Isometrica ed eccentrica valutazione della forza dei muscoli scheletrici Isolato da modelli murini di distrofie muscolari

Riepilogo

Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali terapie per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Si dimostrerà la preparazione del muscolo estensore lungo delle dita e muscoli del diaframma per i test funzionali. Protocolli per contrazioni isometriche ed eccentriche verrà mostrato, così come le differenze nei risultati tra muscoli distrofici, che rappresentano uno stato patologico, e muscoli di tipo selvatico.

Abstract

Critico per la valutazione delle terapie potenziali per malattia muscolare sono valutazioni fisiologiche sensibili e riproducibili di funzione muscolare. Poiché molte prove precliniche si basano su modelli murini per queste malattie, la funzione muscolare isolato è diventato uno degli standard per Go / NoGo decisioni in movimento farmaci candidati in avanti nei pazienti. Dimostreremo la preparazione del estensore lungo delle dita (EDL) e muscoli del diaframma per i test funzionali, che sono i muscoli predominanti utilizzati per questi studi. La geometria muscolo EDL è ideale per preparazioni muscolari isolate, con due tendini facilmente accessibile, e una piccola dimensione che può essere supportato da superfusione in un bagno. Il diaframma presenta profonda progressiva patologia negli animali distrofici, e può servire da piattaforma per valutare molti potenziali terapie contrastare la fibrosi, e promuovere la stabilità miofibre. I protocolli per i test di routine, tra cui isometrica ed eccencontrazioni triche, verrà mostrato. Forza isometrica fornisce una valutazione della forza, e le contrazioni eccentriche aiutare a valutare la stabilità sarcolemma, che si interrompe in molti tipi di distrofie muscolari. Il confronto tra i risultati attesi fra i muscoli da muscoli di tipo selvatico e distrofiche, saranno fornite anche. Tali misure possono integrare le misurazioni morfologiche e biochimiche di omeostasi tissutale, nonché valutazioni intere di animali della funzione muscolare.

Introduzione

Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali trattamenti per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Per la malattia muscolare, l'uso di modelli murini sono diventati un elemento centrale per la comprensione dei rapporti tra genotipo e fenotipo, e per estendere la conoscenza nella progettazione e la sperimentazione di terapie potenziali. Le distrofie muscolari, in particolare, hanno fatto affidamento sui topi per valutare questi agenti e stabilire dati preclinici necessari per andare avanti per studi clinici su pazienti. Una misura di esito frequente utilizza isolato funzione muscolare per determinare la forza, che è applicabile ad una vasta gamma di studi. Un'altra misura è l'uso di eccentrico, o allungamento, contrazioni determinare i cambiamenti di integrità della membrana muscolare, che è carente nella distrofia muscolare di Duchenne, e il modello di mouse per questa malattia (mdx). Pertanto, è essenziale che questi tipi di misuratore digenitori di essere sensibile e riproducibile.

Il mouse estensore lungo delle dita (EDL) muscolare è stato ampiamente utilizzato per la funzione muscolare isolato a causa della sua geometria ideale e dimensione, compreso l'orientamento delle fibre uniformi e tendini definitive ^{2, 5, 6, 10, 12.} Metodi per muscoli EDL isometriche misurazioni funzionali sono stati descritti in una precedente pubblicazione JoVE ^8, così come nel Treat-NMD SOP ^1. Abbiamo esteso la descrizione di questi metodi per includere entrambe le contrazioni isometriche ed eccentriche. Caratteristiche della malattia sono evidenti nel EDL, inclusi i cicli heighted di degenerazione / rigenerazione e uscita forza diminuita.

Il diaframma del mouse mostra la progressione più rapida patologica di distrofia muscolare rispetto ad altri muscoli del topo ^11. 6 mesi di età, fibrosi cumulativo comprende circa il 50% del muscolo. Ciò provoca significativamente impaired forza di uscita ^11. Pertanto, agenti terapeutici che possono prevenire l'infiltrazione fibrotica può essere valutato in modo efficiente nel diaframma.

La perdita di distrofina nel muscolo porta ad un aumento fragilità e le accresciute danni contrattile in tutti i muscoli ^9. Pertanto molte terapie per la distrofia muscolare di Duchenne sono orientati per la sostituzione distrofina. Come tale, un saggio che è diventata essenziale per valutare queste strategie è contrazione eccentrica, che può distinguere tra muscolare normale e distrofiche, oltre a determinare quale utilità particolare strategia ha per proteggere un muscolo distrofico da danni contrattile ^{2, 3, 4, 12.} Questa procedura richiede o un dual-mode servomotore che può modulare / lunghezza di registrazione e forza, o un metodo di regolazione della lunghezza rapidamente separata da un trasduttore di forza.

Protocollo

Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dalla University of Pennsylvania IACUC.

1. Dissezione EDL e preparazione (circa 30 min)

1. Anestetizzare topi per garantire che essi sperimentano nessun dolore o disagio durante la procedura, ma che i muscoli rimangono ben ossigenato dalla circolazione. Noi abitualmente uso un cocktail ketamina / xilazina (100/10 mg / kg) iniettata tramite IP. Piano di anestesia chirurgica è determinata dalla completa assenza di pedale o riflessi di astinenza palpedral, o mancanza di risposta dell'orecchio contrazione.
2. Immobilizzare gli arti posteriori con nastro medico, e rimuovere la pelle della hindlimb inferiore anteriore per esporre i muscoli di questa zona. Mantenere i muscoli umido con l'applicazione di PBS a intervalli regolari.
3. Sotto un ambito dissezione, fare una piccola incisione laterale al ginocchio per esporre il tendine prossimale del muscolo EDL. Ci sono due tendini in questa regione, ed entrambi dovrebbero essere tagliati per consentire ririmozione della EDL.
4. Alla caviglia mediale, tagliare il tendine del muscolo TA per esporre i tendini distali del EDL, che si estendono lungo le tarso meta. Sollevare il muscolo TA di mezzo, facendo attenzione a non tagliare o toccare la parte inferiore EDL. Torna ai tendini distali del EDL, snip ognuno e farli passare attraverso la caviglia, poi afferrare i tendini, tirare delicatamente la EDL lontano dal resto dell'arto. Si dovrebbe rilasciare dall'estremità prossimale liberamente, ma se non, tornare alla incisione laterale per garantire che il tendine è tagliato. Rimuovere il muscolo e mettere in un piatto pieno di dissezione refrigerati Ringers ossigenati. Pin il muscolo attraverso i tendini a lunghezza approssimativamente di riposo, che è la lunghezza presenti in vivo. La lunghezza è troppo breve quando il muscolo è flaccido nel piatto, e troppo a lungo se il muscolo sta tirando sui perni dissezione.
5. Euthanize il mouse immediatamente dopo la rimozione del muscolo per dislocazione cervicale.
6. Legare ai dieci punti di suturaDons, il più vicino possibile al muscolo, ma senza toccare il muscolo. Pin il muscolo alla lunghezza di circa di riposo con i punti di sutura.

2. Membrana dissezione e preparazione (circa 30 min)

1. Euthanize i topi prima di questa procedura per dislocazione cervicale in anestesia, se il mouse stesso è sottoposto a due dissezioni, o CO ₂ seguita da conferma con dislocazione cervicale.
2. Fare una incisione nella pelle per esporre la cavità addominale e toracica. Aprire la cavità addominale, e tagliare la parete del corpo appena sotto le costole. Usando forbici ossee, e l'inserimento di partenza sopra diaframma, taglio intorno alla gabbia toracica intera seguendo la linea delle costole, e tagliare la colonna vertebrale. Tagliare vasi sanguigni che attraversa il centro del diaframma in modo che il diaframma può essere rimosso facilmente.
3. Rimuovere la membrana dal mouse, e mettere in un piatto pieno di dissezione Ringers ossigenati. Agitare delicatamente il DiAPhragm nel piatto per lavare via il sangue. Refresh soluzione di Ringer come necessario.
4. Tagliare una piccola striscia di diaframma del tendine centrale alle nervature lungo l'orientamento delle fibre nella porzione centrale dei hemidiaphragms laterali. La striscia deve essere compreso tra 2-4 mm di larghezza. Usando forbici osso, tagliare la nervatura su entrambi i lati del nastro, lasciando circa 1-2 mm sporgenza della nervatura ai lati della striscia diaframma.
5. Legare punti di sutura al tendine centrale. Legare sutura a ciascuna delle estremità sporgenti lateralmente nervatura, e quindi legare questi insieme per fare un grande anello.
6. Due strisce possono essere ottenute da qualsiasi dato diaframma (una per ogni lato).

3. Muscoli di montaggio a Bath Meccanica

1. Afferrare le suture e utilizzare questi per fissare il muscolo di un post rigida ad una estremità, e di un trasduttore di forza sull'altra estremità.
2. Regolare la lunghezza per assicurarsi che il muscolo non è allentato, ma non è tesa. Una buona approssimazione è il musc riposole lunghezza come al punto 1.4 - 1.5.
3. Bagno deve essere riempito con soluzione di Ringer ossigenato mantenuta a 22 ° C per prolungare la stabilità muscolare per il test. Muscoli dovrebbe riposare per 5 min in questo bagno prima del test funzionale in modo che la temperatura muscolare è equilibrato a 22 ° C.

4. Contrazioni isometriche

1. Creazione delle condizioni di stimolazione sovramassimale. Dopo un muscolo viene posto nel bagno, utilizzare singoli impulsi di stimolazione 0,5 msec per generare una contrazione, e monitorare uscita forza. Aumentare gradualmente la forza di corrente fino a raggiunge un livello massimo ma costante. Aumentare la corrente al 10% più di questo livello per gli esperimenti rimanenti.
2. Stabilire la lunghezza ottimale. Utilizzando stimolazioni contrazione isometrica, regolare la lunghezza del muscolo gradualmente fino a una forza massima viene ottenuta. Appoggiare il muscolo ~ 10 secondi tra ogni contrazione. Lunghezza muscolare ottimale (L _o) si ottiene quando la forza contrazione è massima. Record lunghezza del muscolo (la lunghezza ègiunzioni tra il miotendiniche per EDL e tra la centrale di giunzione mio-tendinea tendine e l'inserzione del muscolo alla costola) con pinze Vernier.
3. Massima forza isometrica tetanica. Stimolare muscolo fissato a L _o per un periodo di 500 msec, con una serie di impulsi di 0,5 msec con stimolazione sopramassimale ea frequenza fusione (dal plateau della frequenza forza relazione (Rif. es:. ⁸⁾ Il plateau di muscoli EDL è tipicamente raggiunto con 120 Hz, e per muscoli del diaframma con 100 Hz.. Stimolare 3 volte alla frequenza relativa con periodi di riposo di 5 minuti tra i periodi di stimolazione per ogni muscolo.

5. Contrazioni eccentriche

1. Lasciare riposare muscolare 5 minuti tra l'esecuzione di contrazioni isometriche ed eccentriche.
2. Stimolare i muscoli a 80 Hz isometricamente per le prime 500 msec, seguito da un tratto L 10% _o in finale stimolazione 200 msec (un tasso di allungamento di 0,5 L _o/ Sec).
3. Ripetere modello stimolazione con 5 min pause tra per il numero desiderato di contrazioni eccentriche.
4. Misurare la forza per ogni contrazione nel periodo di tempo precedente al tratto. Calcolare la caduta in vigore tra la contrazione e il cognome.

6. Cancellazione dal Apparato muscolare

1. Accorciare la lunghezza del muscolo per consentire la rimozione delicata del muscolo dal trasduttore e postare e versarla in un piatto dissezione con Ringer.
2. Rimuovere punti di sutura dei muscoli.
3. Per il muscolo EDL, asciugare il muscolo due volte, poi pesare, prima della trasformazione successiva (ad esempio, il congelamento, fissaggio, ecc.) Questo sarà importante per calcolare l'area in sezione trasversale, e la forza specifica.
4. Per il muscolo diaframma, immergere nello 0,1% Procion arancione, un colorante impermeant membrana per 15-20 min. Ciò fornirà un indice di danno dissezione.
5. Sezionare il muscolo, allontanandosi dall'inserzione ossea, così come il centtendine ral. Questo è necessario per fornire un peso esatto del muscolo. Asciugare come sopra prima della pesatura e successiva preparazione.
6. Calcola area della sezione trasversale (CSA):
   CSA (mm ²⁾ = massa (mg) / [(L _o mm) * (L / L _o) * (1,06 mg / mm ^3)],
   dove L / L _o è la fibra muscolare rapporto lunghezza (0,45 per EDL, 1,0 per il diaframma) ⁵ 1,06 ed è la densità del muscolo.

Risultati

Valori attesi per le forze isometriche dei muscoli EDL da 12 animali settimane vecchi sono mostrati nella Figura 1. Poiché i muscoli mdx esporre ipertrofia compensatoria, totale forza tetanica può essere maggiore nei muscoli mdx rispetto all'età di tipo selvatico controlli abbinati. Tuttavia, una misura più appropriata di uscita funzionale è forza specifica (figura 2), dove viene normalizzato vigore per sezione trasversale per calcolare questo valore. Forza specifica dipende dalla capacità intrinseca funzionale del muscolo, dove la debolezza nei muscoli distrofici è più evidente quando sia la forza assoluta e l'area trasversale sono contabilizzate. Nelle nostre mani, i muscoli di topi mdx EDL generare circa il 20 - 25% inferiori rispetto a quelli delle forze specifiche di età corrispondente di tipo selvatico topo 10-26 settimane di età.

Per il diaframma, solo forza specifica è rilevante per il confronto perché la preparazione è un pezzo di muscolo dipende dalla diffuction. Confronto della forza specifica tra tipo selvatico e muscoli del diaframma mdx riflette la patologia progressiva in questo tessuto. Uscita forza isometrica diminuisce con l'età (Figura 3), in modo che da 6 mesi di età, muscoli del diaframma di topi mdx non producono più della metà della produzione funzionale di strisce diaframma da pari età di tipo selvatico controlli.

Un esempio di contrazioni eccentriche di testing diaframma è mostrato in Figura 4. Ad ogni successiva contrazione eccentrica, uscita forza diminuisce in strisce a membrana da entrambi di tipo selvatico (C57) e topi mdx. Tuttavia, la perdita di forza è più drammatico in campioni di muscolo dal topo mdx, presumibilmente dalla mancanza di distrofina e le sue proteine ​​associate.

Figura 1. Isometrica forza tetanica in di tipo selvatico e mdx EDL f muscoli rom 12 topi settimana fa. Forza assoluta può essere più elevata nei pari età mdx muscoli EDL a causa di ipertrofia compensatoria.

Figura 2. Forza isometrica tetanica normalizzati per area muscolare in sezione trasversale è forza specifica, e rivela depresso capacità funzionale dei muscoli EDL da topi mdx rispetto a quelli di tipo selvatico topo. Tracce sono da topi stessi in Figura 1.

Figura 3. La perdita progressiva della capacità di forza generatrice valutata con la forza specifica è più evidente nel diaframma di topi mdx (barre rosse) rispetto al tipo selvatico (C57 in linea blu).

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Figura 4. La perdita di forza in funzione del numero di contrazione eccentrica per muscoli del diaframma da 12 settimane vecchio C57 e topo mdx. I dati sono media ± SEM per N = 4 muscoli per genotipo.

Discussione

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire indicazioni su come eseguire la funzione muscolare isolato su due muscoli di topo - l'EDL e il diaframma. La valutazione di questi muscoli può fornire una conoscenza o meno di nuovi candidati terapeutici per le malattie muscolari sono utili. Per entrambi i muscoli, il fattore principale per ottenere dati affidabili è una dissezione pulito. Pertanto, la pratica e perfezionare il passo iniziale isolamento è essenziale prima di passare i test funzionali. Inoltre, l'istituzione di parametri funzionali per il muscolo normale è fondamentale prima di fare paragoni al muscolo distrofico, o tra i trattamenti. Ciò assicurerà che i risultati dello studio non sono soggetti a variabilità impartita dalla capacità di chi esegue gli esperimenti. L'uso di un colorante impermeant membrana può aiutare con ottimizzare la preparazione dissezione, per incubazione di qualsiasi muscolo in una soluzione contenente un colorante segnerà fibre più danneggiate, e può servire come un indice di dissection successo. Minimizzando il numero di fibre danneggiate nel muscolo aiuterà ad ottimizzare la misurazione. Le fibre danneggiate da dissezione fluorescenza molto più brillantemente di quelli danneggiati da contrazione eccentrica, e quindi, se il colorante è utilizzato anche durante il processo meccanica, si può usare l'intensità del colorante per distinguere tra i due tipi di danni.

Dissezione di strisce diaframma sarà quasi sempre danno fibra, semplicemente perché tagliando lungo la lunghezza delle fibre, alcune inevitabilmente vengono distrutte. Assorbimento colorante è forte in quei fibre danneggiate, e questi sono normalmente limitati ai bordi esterni della preparazione. In media, si osserva una banda di fibre danneggiate che è ~ 3 fibre in larghezza (~ 120 micron) su entrambi i lati della striscia muscolare. Se la banda danneggiato comprende più del 15% del muscolo, i dati vengono scartati. La preparazione diaframma ha anche vincoli sulla dimensione ottimale per le misure funzionali. Abbiamo trovato che i pezzi di diaphragm che sono più larghi di 5 mm iniziano a piegare su se stesse, perché il legame tendine centrale è solo in un punto. Ciò si traduce in una riduzione della forza specifica nella preparazione. Abbiamo anche trovato che strette strisce hanno anche bassa forza specifica, che riteniamo sia perché il numero di fibre danneggiate durante la dissezione comprendono una quota maggiore del numero totale di fibre. Per esempio, se 0,1 millimetri per lato è danneggiato, allora è 5% (2x0.1 mm / 4 strip mm) della preparazione muscolare che non contribuisce alla forza, mentre se la striscia è solo 1 mm, quindi 20 % della preparazione muscolare è danneggiato. Così, sia la larghezza della zona danneggiata e la larghezza della intera preparazione sono fattori importanti da controllare.

Misure di massima tensione isometrica richiedono che tutte le fibre muscolari di un muscolo vengono stimolati. Poiché non vi è variabilità enorme componenti di un apparato funzione, questo deve essere determinato per ogni singola serieup. Per esempio, dimensione bagno o il tipo di stimolatore può influenzare l'intensità di stimolazione. Stimolazione Twitch è un modo ragionevole per determinare le condizioni di stimolazione sovramassimale. Una volta che questo è stabilito per una configurazione specifica e muscolo, può essere utilizzato per studi successivi.

Al contrario, la lunghezza ottimale di qualsiasi muscolo dato deve essere misurato per ciascun preparato mediante il processo iterativo sopra descritto. Questo assicura che si sovrappongono a filamento spessi e sottili è ottimale e il massimo potenziale di capacità di generazione di forza è misurata. Procedure alternative possono fare affidamento sui modelli di diffrazione associati con le striature muscolari, ma questo richiede attrezzatura supplementare non descritto qui.

Noi abitualmente uso 500 msec durata di stimolazione, che rientra nella fascia media di questo parametro utilizzato da altri ricercatori in questo campo. Anche se questo potrebbe causare affaticamento del muscolo durante la contrazione, che è evidenteda un "abbassamento" della produzione di forza massima, questo di per sé può essere informativo. Per esempio, una differenza di affaticamento potrebbe essere raggiunto da diversi tipi di terapie comprese quelle che movimentazione bersaglio di calcio, di conseguenza l'abbassamento in vigore durante contrazione attiva può servire come un indice di miglioramento. In alternativa, la perdita di forza potrebbe indicare che le suture sui tendini non sono abbastanza stretto, e che stanno scivolando durante la contrazione. Il muscolo deve essere rimosso dal bagno e le suture devono essere ri-legato se questo si verifica. Abbiamo anche utilizzare una serie di contrazioni tetaniche 3, che aiuta a valutare la stabilità del preparato. Anche in questo caso, scivola sutura porterebbe alla perdita di forza tra le contrazioni, che richiede sutura ri-legatura. Muscoli di grandi dimensioni possono anche generare nuclei anossici, che portano a perdite di forza durante il protocollo. Massa muscolare è un fattore limitante per l'esecuzione di test di funzionalità muscolare isolato, in cui i muscoli EDL con masse superiori a 20 mg perdere forza con ogni contrazionezione, e non può essere supportata da superfusione in un bagno. Strisce membrana non soffrono le stesse complicazioni perché sono abbastanza sottili da avere vitalità prolungata nel bagno.

Altri muscoli possono essere utilizzati per la funzione muscolare isolato, compreso il muscolo soleo, che è comunemente usata, ma non descritti qui. Molte delle stesse procedure possono essere adottate per i soleo in termini di preparazione e il collaudo funzionale. Tuttavia, le differenze principali sono la frequenza di stimolazione, ed i parametri per contrazioni eccentriche. Utilizzare del soleo per funzione complementare a quello degli altri due muscoli, e quindi dovrebbe essere considerata come parte di un "pacchetto standard" per la valutazione topi distrofici ^{4, 7.}

Contrazione eccentrica fornisce un indice di fragilità contrattile, ed è importante utilizzare un protocollo che comporta modesta perdita di forza nei muscoli da animali di tipo selvatico e di una notevole perdita di forza inmuscoli distrofici non trattati in modo che ci sia una vasta gamma dinamica per i confronti. La mancanza di qualsiasi perdita di forza nei muscoli normali suggerisce che la contrazione eccentrica è troppo dolce, e non sarà sufficiente per distinguere tra terapie che non sono efficaci e quelle che sono veramente vantaggioso. Tuttavia, una perdita di forza nei muscoli normali sottoposti a contrazione eccentrica potrebbe essere troppo grande per prendere in giro le differenze associate alla malattia. Il nostro protocollo per l'EDL e il diaframma di 0,5 utilizza Lo / sec velocità di allungamento per produrre un cambiamento di lunghezza del 10%. Noi di solito eseguire 5 contrazioni eccentriche, che si traducono in una piccola perdita di forza nei muscoli normali e una significativa perdita di forza nei muscoli distrofici. Certamente, tutti questi parametri possono essere variati per aumentare la variazione di lunghezza totale, il tasso di allungamento, o il numero di contrazioni eccentriche per distinguere differenze tra muscolo malato e sano, nonché sugli effetti di uno specifico tipo di mutazione o tRATTAMENTO che si studia. Fino a quando non vi è una netta differenza tra i muscoli normali e malati, poi c'è un gold standard da raggiungere in termini di trattamenti.

In sintesi, questo protocollo definisce le linee guida per l'esecuzione di contrazioni isometriche ed eccentrico, e identifica spera potenziali insidie ​​da evitare quando si imposta questa tecnica nel vostro laboratorio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
nel sistema di test muscolare in vitro	Aurora scientifico	1200A
Dissezione microscopio	Leica	MZ6
ACE sorgente di luce	Schott-Fostec	A20500
Forbici per dissezione	Strumenti Scienza Belle	14060-11
Angolari forbici dissezione	Strumenti Scienza Belle	15006-09
Manico bisturi	Strumenti Scienza Belle	10003-12	alternativo strumento di dissezione
Curve lame di bisturi # 12	Scienza fineStrumenti	10012-00	alternativo strumento di dissezione
Bone forbici	Strumenti Scienza Belle	16044-10
S & T sutura legatura forcipe	Strumenti Scienza Belle	00272-13
Dumont Pinza SS - angolo	Strumenti Scienza Belle	11203-25
Intrecciato sutura seta TAGLIA 6-0	Teleflex Medical	07-30-10
Nastro medico	TRANSPORE	3M
La ketamina cloridrato 100 mg / ml	Hospira	NDC 0409-2051-05	Ultima dose è di 80 mg / kg
Iniezione TranquiVed (xilazina 100 mg / ml)	Vedco	NDC 50989-234-11	Ultima dose è di 10 mg / kg
Reattiva arancione 14	Sigma-Aldrich	R-8254
Componenti della soluzione Ringers			La soluzione è a gas equilibrata con 95% O 2 e il 5% di CO 2, pH finale 7,4
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Concentrazione finale: 118 mm
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P217-3	Concentrazione finale: 4,7 mm
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientific	C79-500	Concentrazione finale: 2.5 mM
Potassio fosfato monobasico	Fisher Scientific	P-285	Concentrazione finale: 1,2 mm
Solfato di magnesio	JT Baker	2500-01	Concentrazione finale: 0,57 mm
4 - (2-idrossietil) TuboRazine-1-etansolfonico (HEPES)	Fisher Scientific	BP310-500	Concentrazione finale: 5,95 g / L
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Concentrazione finale: 5.5 mM