Optogenetic刺激的逃避行为<em&gt;果蝇</em

摘要

基因编码的optogenetic的工具，使非侵入性的操作，在特定的神经元果蝇脑。这些工具可以识别神经元的激活是足以引起或抑制特定的行为。在这里，我们提出了有针对性的自由行走苍蝇的神经元激活方法Channelrhodopsin2表示。

摘要

越来越多的基因编码的工具，正成为可用，允许非侵入性操作，在果蝇的特定神经元的神经活动。其中最主要的是optogenetic工具，激活或沉默的完整和自由移动的动物在特定的神经元，使用明亮的光线，使。 channelrhodopsin（CHR 2）是激活时，由蓝色光，使反映它的神经元的去极化的光激活的阳离子通道。 CHR 2已经有效地确定神经元的特定行为，如CO ₂避税，长鼻延伸和巨纤维介导的惊吓反应^2-4的关键。然而，作为用来刺激CHR 2也刺激感光体的强光源中，这些optogenetic技术已经以前没有被使用的视觉系统。在这里，我们结合的optogenetic的方法的突变，会影响演示的光传导nstrate集群的织机敏感的神经元在果蝇视叶，福马-1神经元的激活，可以开车逃逸行为，以避免碰撞。我们使用了无效等位基因的光传导级联的重要组成部分，磷脂酶C-β，编码基因的norpA，导致苍蝇盲目的，也可以使用CHR 2的福马-1表达的GAL4-UAS转录的激活系统神经元。个人的苍蝇被放置在一个小平台，周围环绕着蓝色的LED。当LED被点亮，过得很快起飞，飞行，视觉驱动的织机逃逸行为方式类似。我们相信，这种技术可以很容易地适应检查的其他行为，在自由移动的苍蝇。

引言

越来越基因编码的工具库已经发展到操纵的神经活动在特定的细胞在果蝇 ^1。这些工具使非侵入性的完整和自由移动的动物在特定的神经元的激活或沉默。的光激活的阳离子通道，Channelrhodopsin2（CHR 2），其中，提供了重要的优势，因为它可以在时间控制，并迅速诱导。当神经元表达CHR 2暴露在明亮的蓝色（470 nm）的光，他们迅速去极化，表现出升高的发射率^3-5。这种有针对性的激活特定的神经元在自由活动动物，揭示了充足的特定神经元的行为，如长鼻延长^2,4，3，CO ₂避免和巨纤维介导的惊吓反应。然而，由于激烈的光源要刺激CHR 2也刺激光感受器，施加运算togenetic视觉系统的技术，已经被限制。通过相结合的optogenetic的方法的突变，会影响光传导，我们已经表明，在果蝇视叶神经元激活一个特定的集群可以开车逃逸行为，以避免碰撞^6。

大多数情况下，如果不是全部的，视觉的动物表现出逃避行为，以避免与迎面而来的物体发生碰撞。步行或固定荏苒，当一个迫在眉睫的冲突，进入飞行，起飞距离迎面而来的碰撞^7-9。这些起飞的特点是起飞和飞行轨迹不稳定^，10,11之前提出的翅膀。这种反应是与巨纤维介导的惊吓反应，跳之前没有提出翅膀不同，通常会导致在自由下落的滚筒^4,9。在确定了具体的织机敏感的神经元群在视叶，福马-1神经元，这是尹居良伊利调整到接近对象进行编码，我们试图探讨其参与果蝇的织机逃逸行为。在这里，我们演示了如何使用光遗传学选择性地激活这些神经元，引起果蝇的逃逸行为。

我们使用驱动C​​HR 2的FOMA-1神经元表达的GAL4-UAS转录的激活系统。 CHR 2需要的辅助因子全反式视黄醛，因为这是发现在果蝇中枢神经系统在较低水平，必须要补充在果蝇的饮食^。3,4明亮的光线来激活CHR 2和果蝇表现出强烈的趋光行为^12，我们试图以消除可能的刺激的视觉反应。要做到这一点，我们使用的动物，它编码的光传导级联反应的重要组成部分，磷脂酶C-β的norpA基因为无效等位基因的纯合突变。在这样的突变果蝇的感光器无法respond来点亮^13。的逃避反应要测试optogenetic的刺激，我们需要隔离一只苍蝇，沐浴在明亮的蓝色光线。要做到这一点，我们把个人的苍蝇在枪头。一个枪头放置在一个自定义的夹持器，使得飞将geotactically步行尖端和流出到一个矩形平台。苍蝇是能够自由地走动这个平台的顶部。该平台所包围四个蓝色LED阵列，各含3个LED，重点的顶部上的平台。苍蝇在该平台后，指示灯亮起，并使用高速摄像机⁶苍蝇的反应记录。

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研究方案

1。生成Channelrhodopsin苍蝇

1. 跨UAS-CHR 2的苍蝇与GAL4您所选择的驱动程序，我们使用G105-GAL4，表示这是在福马-1在视叶神经元。
2. 为了消除可能的蓝色光刺激的视觉反应，无论是飞线是在AW ⁺ norpA背景。
3. 最终的结果：W ⁺ norpA“G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. 后成蝇E关闭，把选中的女性在10μM全反式视黄醛（辅助因子所需的CHR 2），避光，新鲜的食物，补充前3天进行行为分析。

2。 10μM全反式视黄醛的强化食品

1. 在17.6毫升的95％乙醇中溶解100毫克的全反式视黄醛，使20mM的视网膜。保持全反式视黄醛避光，在任何时候。
2. 标准的玉米面飞的食物在微波炉融化，放凉，直到温暖的触摸。
3. 混合50微升的20mM全反式视黄醛的10毫升粉煤灰食品到小瓶中。
4. 让瓶冷却，并保持避光。

3。设备

1. 枪头：标准1000μL枪头附近的尖被切断，创造〜2.25毫米的孔径。
2. 平台（参见图1）。
   1. 一个聚甲醛基地，17厘米X 25厘米，被修建在每一个角落，以适应¼“不扩散核武器条约”冷却液软管接头的螺纹孔。
   2. 由Delrin制成，甲垂直支架，安装的碱的中心。整体尺寸为25毫米X 40毫米X 65毫米（宽X深X高）。运行一个10毫米宽的凹槽的保持器的长度，在底部具有翼形螺钉。 A平台安装的支架的顶部，25毫米×40毫米×10毫米，用3.5毫米直径的孔与在支架中的槽对齐。
3. 发光二极体（LED）阵列（参见图1）。
   1. 冷却液软管，四臂〜18厘米长，都贴有平台BASE使用的冷却液软管连接器。冷却剂软管仅被用作结构支撑和不用于冷却的目的。
   2. 切槽，到最后一块冷却液软管，每个臂，每个臂的末端贴上了散热片，以适当的距离。
   3. 使用预切的热胶带安装在每个散热片上的蓝色LED反叛的三星级。一个CARCLO 18°三镜头贴在每个三星级。
   4. 的BuckPuck DC驱动器和电源连接到LED三连星。我们已经安排我们的设置，与每个BuckPuck供电两个三连星系列。
   5. 所有四个LED照明的三连星在700 mA时产生的辐射为713瓦/米^2，在我们的平台上。
4. 摄像头：摄像头是装在一个小三脚架和重点顶部的平台上。

4。行为检测

1. 简单地说，麻醉苍蝇冰。
2. 将个人苍蝇在枪头，用胶带将关闭两端部的前端。
3. 苍蝇后语惊醒梦中人，并正在积极探索枪头，取出磁带，然后将移液管在垂直支架的凹槽中。的指旋螺丝，用于固定枪头，并关闭底部的尖端。
4. 一样的飞走探索枪头（一般为30 - 60秒），启动相机记录之前出现的飞行从尖端到这个平台上。
5. 后飞已经出现在平台上，等待1-2塞科和打开的蓝色LED。使用一个定时器来手动测量的时间，直到飞启动飞行。

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结果

盲飞表达无论是CHR 2或G105驱动程序独秀率较低起飞后带有明亮的蓝色光照明。盲飞，无论照明（ 图2）表现出同样的速度起飞，起飞，这是自发的，而不是由于蓝色光的照明。当CHR 2 Foma1神经元中的表达，然而，与蓝色光的照射引发逃避反应。超过50％的测试苍蝇起飞，在1秒内的照明，75％的5秒内（ 图2）。相比之下，只有10％的控制苍蝇起飞，在1秒内，20％的5秒内。表示...

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讨论

我们已经证明的逃逸行为optogenetic刺激，洗澡自由地走在明亮的蓝色光线的苍蝇。这种方法可以很容易地适应自由行走苍蝇检查的其他行为，并且可以扩展到更大的平台，通过简单地平铺在一个较大的区域中使用的LED阵列，我们。使用廉价的摄像机，我们描述，或其他可用的相机系统中，用户可以调整图像的帧速率和空间分辨率获得的适应行为兴趣。此外，我们的成像后的时间是有限的LED被?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			试剂
全反式视网膜	促进科学和化学公司	R3041
			设备
散热片9.2 C / W	Luxeonstar	LPD30-30B	30平方毫米X 30毫米高
CARCLO 18°三镜头	Luxeonstar	10507
蓝色的反叛LED上三星基地	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470纳米，174流明@ 700毫安。
700毫安BuckPuck DC驱动器	Luxeonstar	3021-DE-700
线束BuckPuck驱动	Luxeonstar	3021-HE
预切的热胶带	Luxeonstar	LXT-S-12	20毫米内六角基地
扣-LOC冷却液软管，6.3“ID	麦克马斯特 - 卡尔	5307K49
扣-LOC冷却液软管接头	麦克马斯特 - 卡尔	5307K39	¼“不扩散核武器条约”男
实验室等级的开关模式可编程直流电源供应器	BK精密	1698
EXILIM相机	卡西欧	EX-FH20