JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Генетически закодированный инструменты optogenetic позволяет неинвазивным манипуляции конкретных нейронов в Drosophila Мозг. Такие инструменты могут определить нейроны, активации достаточно, чтобы вызвать или подавить частности поведения. Здесь мы представляем метод для активации Channelrhodopsin2, что выражается в целевых нейронов в свободно гуляющих мух.

Аннотация

Все большее число генетически закодирована инструменты становятся доступны, которые позволяют неинвазивным манипуляции с нейронной активности специфических нейронов дрозофилы 1. Главными среди них являются optogenetic инструменты, которые позволяют активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных с использованием яркого света. Channelrhodopsin (ChR2) является светло-активированных катионов канал, который при активации синий свет, вызывает деполяризацию нейронов, что выразить это. ChR2 была эффективна для выявления нейроны важны для конкретного поведения, такие как CO 2 избегания, хоботок расширение и гигантские волокна опосредованная реакция испуга 2-4. Однако, как яркие источники света используются для стимуляции ChR2 также стимулировать фоторецепторы, эти optogenetic методы ранее не были использованы в зрительной системе. Здесь мы объединяем optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции для демонстрацииnstrate, что активация кластера ткацкий станок-чувствительных нейронов в оптической доле мухи, Фома-1 нейроны, может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения. Мы использовали нулевой аллель из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β, кодируемого геном norpA, оказывать летит слепым, а также использовать Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы для управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейронов. Индивидуальные мух помещают на небольшой платформе окружении синих светодиодов. Если светодиоды горят, летит быстро взлета в полете, подобно визуально приводом станка-выход поведения. Мы считаем, что этот метод может быть легко адаптирована для изучения других поведения в свободном перемещении мухи.

Введение

Растущий арсенал генетически закодирована инструменты были разработаны для работы нейронной активности в отдельных клетках дрозофилы 1. Эти инструменты позволяют неинвазивной активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных. Среди них Channelrhodopsin2 (ChR2), светло-активированных катионов канал, предлагает основные преимущества, так как он может быть временно управлять и быстро индуцированной. Когда нейроны, которые выражают ChR2 подвергаются ярко-синий (470 нм) света они быстро деполяризовать и обладают повышенной теплотехнической 3-5. Такие целевые активации специфических нейронов в свободном перемещении животных показали достаточность частности нейронов поведения, такие как CO 2 избежании 3, хоботок расширения 2,4, и гигантские волокна опосредованный ответ испуга 4. Однако, как интенсивный источник света необходимо стимулировать ChR2 также стимулировать фоторецепторы, применяя опtogenetic методов зрительной системы была ограничена. Объединив optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции, мы показали, что активация конкретного кластера нейронов в оптической доле мухи может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения 6.

Большинство, если не все, визуально животные проявляют побег поведение, чтобы избежать столкновения с встречным объектов. Ходьба или стационарного мух, когда представлены надвигающегося столкновения, взлет в полете, от встречного столкновения 7-9. Эти взлетов характеризуется поднятыми крыльями до взлета и неустойчивую траекторию полета 10,11. Эта реакция отличается от гигантского волокна опосредованной реакции испуга, прыжки, которые не предшествовали поднятыми крыльями, и обычно приводят в свободном падении падение 4,9. После определения конкретного кластера ткацкий станок чувствительных нейронов в зрительных долей, Фома-1 нейроны, которые uniquЭли настроен для кодирования приближается объектов, мы стремились исследовать их участие в ткацком станке поведения побег мухи. Здесь мы демонстрируем использование optogenetics выборочно активировать эти нейроны и вызывает бегство поведение мухи.

Мы используем Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейроны. ChR2 требует кофакторов все-транс-ретиналь и как этому можно найти в низких уровнях в Drosophila центральной нервной системы, оно должно быть дополнено в рационе мух. 3,4 Как яркий свет используется для активации ChR2 и мухи проявляют сильное поведение phototactic 12, мы стремились исключить возможность визуального ответ на стимул. Для этого мы использовали животных, которые были гомозиготных мутантных по нулевой аллель гена norpA, который кодирует одним из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β. Фоторецепторов в таких мутантных мух не могут ответственD на свет 13. Чтобы проверить optogenetic стимуляции побег ответ, мы должны изолировать одну муху и купать его в ярко-синим светом. Чтобы сделать это, мы размещаем отдельные мухи в пипетки советов. Одна пипетка головка помещена в специально держателя, так что муха будет geotactically ходить кончик и выходит на прямоугольной платформе. Муха может свободно ходить на вершине этой платформы. Платформа окружен четырьмя синий светодиод массивов, каждый из которых содержит 3 светодиода, ориентированных на верхней части платформы. После того, как муха на платформе, светодиоды горят, и ответ мухи записывается с помощью высокоскоростной камеры 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Создание Channelrhodopsin мух

  1. Крест UAS-ChR2 мух с Gal4 водитель по вашему выбору, мы используем G105-Gal4, которая выражается в Фома-1 нейроны в оптической доле.
  2. Чтобы исключить возможность визуального ответ на синей световой стимуляции, как муха линии в AW фоне + norpA.
  3. Конечный результат: W + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
  4. После взрослых мух eclose, положить выбранный женщин на свежие продукты питания, с добавлением 10 мкМ полностью транс-ретиналь (кофактор необходимых для ChR2) и защищенном от света месте, за 3 дня до проведения поведенческого анализа.

2. Сделайте 10 мкМ All-транс-ретиналь Расширение питания

  1. Растворите 100 мг полностью транс-ретиналь в 17,6 мл 95% этанола, чтобы сделать 20 мМ сетчатки. Храните все-транс-ретиналь, защищенном от света во все времена.
  2. Растопить стандартной пищи лету кукурузной муки в микроволновой печи, и дайте остыть до теплого на ощупь.
  3. Смешать 50 мкл 20 мМвсе-транс-ретиналь во флаконы по 10 мл лету пищи.
  4. Пусть флаконы охладить и хранить в защищенном от света.

3. Оборудование

  1. Внесите советы: Стандартный 1.000 мкл советы пипетки срезают вблизи острия, создавая поры диаметром ~ 2,25 мм.
  2. Платформа (см. Рисунок 1).
    1. База Delrin, 17 см х 25 см, была построена с резьбовыми отверстиями на каждом углу, чтобы соответствовать ¼ "NPT разъемы шланг охлаждающей жидкости.
    2. Вертикальный держатель, изготовленный из Delrin, присоединен к центру базы. Габаритные размеры составляют 25 мм х 40 мм х 65 мм (ширина х глубина х высота). Шириной 10 мм паз проходит вдоль держателя, с накатанной головкой на дне. Платформа крепится к верхней части держателя 25 мм X 40 мм X 10 мм, с диаметром 3,5 мм отверстие в соответствие с паз в держателе.
  3. Светодиодные массивы (см. Рисунок 1).
    1. Четыре руки шланг охлаждающей жидкости, ~ 18 см длиной, прикреплены к платформе барельефыэлектронной использованием разъема шланг охлаждающей жидкости. Шланг охлаждающей жидкости используется только в качестве структурной поддержки и не используется для целей охлаждения.
    2. Правильно расположенные канавки нарезать последний кусочек шланга охлаждающей жидкости из каждой рукой, чтобы прикрепить радиатор к концу каждой руке.
    3. Синий светодиод Rebel Tri-Stars устанавливается на каждый радиатор использованием нарезанные тепловой липкой ленты. Carclo 18 ° Tri-объектив прикреплен к каждой Tri-Star.
    4. Светодиодные Tri-Stars подключены к BuckPuck DC драйверов и блока питания, как указано. Мы устроили нашу установку с каждой BuckPuck питание два Tri-Звезды в серии.
    5. Освещение всех четырех светодиодных Tri-Звезды на 700 мА дали освещения из 713 Вт / м 2 на нашей платформе.
  4. Камера: камера установлена ​​на небольшой штатив и сосредоточились на верхней части платформы.

4. Анализ поведенческих

  1. Коротко обезболивания мух на льду.
  2. Поместите отдельные мухи в пипетку советов, с помощью липкой ленты, чтобы закрытьОба конца чаевых.
  3. После того, как мухи проснулись и активно изучают пипетки наконечник, удалите пленку и поместить пипеткой в ​​паз в вертикальный держатель. Винт используется для защиты кончика пипетки на место и закрыть нижнюю часть чаевых.
  4. Как муха исследует пипетки чаевые (обычно 30 - 60 сек), начало записи камеры непосредственно перед муха выходит из наконечника на платформу.
  5. После того, как муха вышли на платформу, подождите 1-2 SECO, и включить синих светодиодов. Используйте таймер вручную измерять время, пока муха начинает полет.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Слепой летит выражения либо ChR2 или G105 драйвера только показывают низкую скорость взлета после их освещения с ярко-синим светом. Слепой летит выставлены с той же скоростью взлета независимо от освещения (рис. 2), предполагая, что эти взлетов было спонтанным, а не за счет освещени?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы показали, optogenetic стимуляции побег поведения, купаясь свободно гуляющих мух в ярко-синий свет. Этот подход может быть легко адаптирована для изучения поведения в других свободно гуляющих мух, и можно масштабировать до больших платформ просто плитка светодиодных массивов мы испол?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа финансировалась стипендий Стэнфордского Дин (SEJdV), Национальные институты здравоохранения Pioneer Award директора (TRC DP0035350), премии Фонда Мак-Найт ученого (TRC) и R01 EY022638 (TRC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Реагент
All-транс сетчатки Предварительная научная и химической Inc R3041
Оборудование
Радиатор 9,2 ° C / Вт Luxeonstar LPD30-30B 30 мм квадратных X 30 мм
Carclo 18 ° Tri-объективом Luxeonstar 10507
Синий светодиод на Rebel Tri-Star базы Luxeonstar MR-B0030-20T 470 нм, 174 лм @ 700 мА.
700 мА BuckPuck DC Driver Luxeonstar 3021-DE-700
Жгут проводов для Driver BuckPuck Luxeonstar 3021-HE
Нарезанные тепловой клейкой ленты Luxeonstar LXT-S-12 20 мм базы Hex
Snap-Loc шланг охлаждающей жидкости, ¼ "ID McMaster-Carr 5307K49
Snap-Loc охлаждающей жидкости шланга McMaster-Carr 5307K39 ¼ "NPT
Лаборатория класс Переключение режима Программируемый источник питания постоянного тока BK Precision 1698
Камера Exilim Casio EX-FH20

Ссылки

  1. Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  2. Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
  3. Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
  4. Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
  6. de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
  7. Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
  8. Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
  9. Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
  10. Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
  11. Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
  12. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  13. Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
  14. Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
  15. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

71optogeneticschannelrhodopsinChR2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены