Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Zusammenfassung

Genetisch kodierte optogenetische Tools ermöglichen invasiven Manipulation von spezifischen Neuronen in der Drosophila Brain. Solche Tools identifizieren können Neuronen, deren Aktivierung ist ausreichend, um zu entlocken oder unterdrücken bestimmte Verhaltensweisen. Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Aktivierung Channelrhodopsin2, die in gezielten Neuronen in frei zu Fuß Fliegen ausgedrückt wird.

Zusammenfassung

Eine wachsende Zahl von genetisch kodierte Werkzeuge sind immer zur Verfügung, dass auch nicht-invasive Manipulation der neuronalen Aktivität bestimmter Neuronen in Drosophila melanogaster ^1. Chef unter diesen sind optogenetische Werkzeuge, die die Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tieren mit hellem Licht zu ermöglichen. Channelrhodopsin (ChR2) ist ein Licht-aktivierten Kationen-Kanal, die, wenn sie von blauem Licht aktiviert, verursacht Depolarisation von Neuronen, sie auszudrücken. ChR2 wurde zur Identifizierung Neuronen entscheidend für bestimmte Verhaltensweisen, wie z. B. CO _{2-Vermeidung,} Rüssel Erweiterung und Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion ^2-4 wirksam. Da jedoch die intensive Lichtquellen verwendet werden, um ChR2 auch stimulieren stimulieren Photorezeptoren haben diese optogenetische Techniken bisher nicht in das visuelle System verwendet worden. Hier bündeln wir eine optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt die Demonstrate dass die Aktivierung von einem Cluster von Webstuhl-Neurone im Fliegenhirn Optik Lappens Foma-1 Neuronen, fahren kann ein Entweichen Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden. Wir verwendeten ein Null-Allel von einer kritischen Komponente des Phototransduktionskaskade, an Phospholipase C-β, durch das Gen kodierte norpA, machen die Fliegen blinde und auch mit dem Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System zur Expression von ChR2 im Foma-1 fahren Neuronen. Individuelle Fliegen werden auf einer kleinen Plattform durch blaue LEDs umgeben ist. Wenn die LEDs beleuchtet werden, die schnell fliegt Abheben in Flug, in einer ähnlichen Weise, um visuell angetriebenen Webmaschine Fluchtverhalten. Wir glauben, dass diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in sich frei bewegenden entfernt untersuchen.

Einleitung

Eine wachsende Arsenal von genetisch kodierte Werkzeuge wurden entwickelt, um neuronale Aktivität in bestimmten Zellen in Drosophila melanogaster ¹ manipulieren. Diese Werkzeuge ermöglichen die nichtinvasive Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tier. Unter diesen greifen Channelrhodopsin2 (ChR2), ein Licht-aktivierter Kationen-Kanal, entscheidende Vorteile, da sie zeitlich gesteuert werden können und schnell induziert. Wenn Neuronen, die ausdrückliche ChR2 zu hellen Blau (470 nm) Licht, das sie schnell depolarisiert und weisen erhöhte Feuerrate ^3-5 ausgesetzt sind. Solche gezielten Aktivierung von spezifischen Neuronen in sich frei bewegenden Tieren hat die Angemessenheit bestimmter Neuronen für Verhaltensweisen wie CO _2-Vermeidung ^3, Rüssel-Erweiterung ^2,4 und Riesen-Faser vermittelten erschrecken Antworten ⁴ enthüllt. Da jedoch die intensive Lichtquellen notwendig ChR2 stimulieren stimulieren auch Photorezeptoren, die Anwendung optogenetic Techniken, um das visuelle System begrenzt wurde. Durch die Kombination eines optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt haben wir gezeigt, dass die Aktivierung einer bestimmten Gruppe von Neuronen in der Fliege optischen Loben können die Escape-Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden ⁶ fahren.

Die meisten, wenn nicht alle, weisen eine visuelle Tieren Fluchtverhalten um Kollisionen mit entgegenkommenden Objekten zu vermeiden. Wandern oder stationär fliegt, wenn sie mit einer drohenden Kollision vorgestellt, Take-off in die Flucht, weg von der entgegenkommenden Kollision ^7-9. Diese take-offs sind durch erhöhte Flügeln vor Take-off und einer instabilen Flugbahn ^10,11 gekennzeichnet. Diese Antwort unterscheidet sich von dem Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion, Sprünge, die nicht durch erhöhte Flügel voraus, und in der Regel in einem frei fallenden Wäschetrockner ^4,9 führen. Nachdem eine bestimmte Cluster von Webstuhl sensiblen Neuronen in der optischen Loben, Foma-1 Neuronen, die uniqu sindely abgestimmt auf sich nähernde Objekte kodieren, haben wir versucht, ihre Beteiligung an der Fliege loom Fluchtverhalten sondieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Optogenetik selektiv zu aktivieren diese Neuronen und entlocken der Fliege Flucht Verhalten.

Wir verwenden die Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System, um die Expression in den ChR2 Foma-1 Neuronen anzutreiben. ChR2 erfordert die Cofaktor all-trans-Retinal und da dies in geringen Mengen in der Drosophila zentralen Nervensystems gefunden wird, muss in der Fliegen "Ernährung ergänzt werden. ^3,4 Als helles Licht verwendet wird, um ChR2 aktivieren und Fliegen zeigen eine starke phototaktischen Verhaltensweisen ^12, versuchten wir, die Möglichkeit einer visuellen Antwort auf den Reiz zu eliminieren. Dazu verwendeten wir Tiere, die homozygot mutierte für eine Null-Allel des norpA Gen, das eine kritische Komponente des Phototransduktionsprozess, Phospholipase C-β kodiert waren. Photorezeptoren in solchen mutierten Fliegen sind keine Verantwortungd ans Licht ^13. Um die optogenetische Stimulation der Flucht Reaktion zu testen, müssen wir eine Fliege zu isolieren und baden sie in helles blaues Licht. Um dies zu tun, legen wir individuelle Fliegen in Pipettenspitzen. Eine Pipettenspitze in einer benutzerdefinierten Halters, so dass die Fliege wird geotactically Fuß bis die Spitze und hinaus auf einer rechteckigen Plattform gesetzt. Die Fliege ist in der Lage, sich frei herumlaufen auf der Oberseite dieser Plattform. Die Plattform wird von vier blaue LED-Arrays mit jeweils 3 LEDs, auf der Oberseite der Plattform ausgerichtet umgeben. Nachdem die Fliege ist auf der Plattform sind die LEDs beleuchtet, und die Fliege Reaktion wird mittels eines High-Speed-Kamera ^6.

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Protokoll

Ein. Generieren Channelrhodopsin Flies

1. Kreuz UAS-ChR2 Fliegen mit dem Gal4-Treiber Ihrer Wahl, verwenden wir G105-Gal4, die in Foma-1 Neuronen in der optischen Loben exprimiert wird.
2. Um die Möglichkeit einer visuellen Antwort auf das blaue Licht Stimulation zu eliminieren, sind beide Leitungen in Fliege aw ⁺ norpA Hintergrund.
3. End Ergebnis: w ⁺ norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Nach erwachsenen Fliegen schlüpfen, legen ausgewählten Weibchen auf frische Lebensmittel, mit 10 uM all-trans-Retinal (ein Co-Faktor für ChR2 erforderlich) und vor Licht geschützt ergänzt, für 3 Tage vor der Durchführung des Verhaltens Assay.

2. Machen Sie 10 uM All-trans-Retinal Verbesserte Lebensmittel

1. Man löst 100 mg des all-trans-Retinal in 17,6 ml 95% Ethanol, um 20 mM Retinal. All-trans-Retinal aus Licht halten zu allen Zeiten geschützt.
2. Melt-Standard Maismehl essen fliegen in der Mikrowelle und abkühlen lassen, bis warm an.
3. Mix 50 ul 20 mMall-trans-Retinal in Fläschchen von 10 ml essen fliegen.
4. Lassen Fläschchen abkühlen und halten vor Licht geschützt.

3. Ausrüstung

1. Pipettenspitzen: Standard 1.000 ul Pipettenspitzen sind in der Nähe der Spitze geschnitten, wodurch ein Porendurchmesser von ~ 2,25 mm.
2. Platform (siehe Abbildung 1).
   1. Ein Delrin Base wurde 17 cm X 25 cm, mit Gewindebohrungen an jeder Ecke zu ¼ "NPT Kühlmittelschlauch Stecker passen gebaut.
   2. Eine vertikale Halterung aus Delrin hergestellt, ist mit dem Zentrum der Basis befestigt. Die Abmessungen sind 25 mm X 40 mm X 65 mm (Breite x Tiefe x Höhe). Eine 10 mm breite Rille läuft über die Länge des Halters, mit einer Flügelschraube an der Unterseite. Eine Plattform ist an der Oberseite des Halters befestigt ist, 25 mm x 40 mm x 10 mm, mit einer 3,5 mm Bohrung mit der Nut in dem Halter ausgerichtet ist.
3. LED-Arrays (siehe Abbildung 1).
   1. Vier Arme Kühlmittelschlauch, ~ 18 cm lang, sind mit der Plattform angebracht base mit dem Wasserschlauch anschließen. Kühlflüssigkeitsleitung wird nur als Strukturträger verwendet und nicht für Kühlzwecke.
   2. Richtig beabstandeten Rillen sind in das letzte Stück des Kühlmittels Abspritzen von jedem Arm für die Anbringung eines Wärmeschilds mit dem Ende jedes Armes abgeschnitten.
   3. Eine blaue LED Rebel Tri-Stars wird jeder Kühlkörper mit pre-cut thermische Klebeband befestigt. A Carclo 18 ° Tri-Objektiv ist auf jeden Tri-Star angebracht.
   4. LED Tri-Sterne sind an den DC BuckPuck Treiber und einer Energieversorgung wie angegeben verdrahtet. Wir haben unser Set-up mit jedem BuckPuck Speisung von zwei Tri-Stars in Reihe angeordnet.
   5. Beleuchtung aller vier LED Tri-Stars bei 700 mA ergab eine Bestrahlungsstärke von 713 W / m ² auf unserer Plattform.
4. Kamera: Die Kamera wird auf einem kleinen Stativ montiert und konzentrierte sich auf die Oberseite der Plattform.

4. Behavioral Assay

1. Kurz betäuben Fliegen auf Eis.
2. Zeigen einzelnen Fliegen in Pipettenspitzen, mit Klebeband zu schließenbeide Enden der Spitze.
3. Nachdem die Fliegen geweckt haben und aktiv erkunden die Pipettenspitze, entfernen Sie das Klebeband und legen Sie eine Pipette in die Nut in der vertikalen Halterung. Die Flügelschraube wird die Pipettenspitze zu befestigen und um die Unterseite der Spitze zu schließen.
4. Wie die Fliege erforscht die Pipettenspitze (typischerweise 30 bis 60 sec), starten Sie die Kamera die Aufnahme kurz vor der Fliege von der Spitze auf die Plattform entsteht.
5. Nachdem die Fliege auf der Plattform entstanden ist, warten 1-2 seco, und schalten Sie auf den blauen LEDs. Verwenden Sie einen Timer manuell messen die Zeit, bis die Fliege initiiert Flug.

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Ergebnisse

Blind fliegt, die entweder ChR2 oder das G105 Fahrer allein zeigen eine niedrige Rate von take-off nach ihrer Beleuchtung mit strahlend blauem Licht. Blind fliegt zeigte die gleiche Rate von take-off unabhängig von Beleuchtung (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass diese take-offs spontane waren eher als durch die Beleuchtung mit blauem Licht. Wenn die ChR2 in den Foma1 Neuronen exprimiert wird, jedoch löst Beleuchtung mit blauem Licht die Flucht Antwort. Über 50% der Fliegen getestet zog innerhalb von...

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Diskussion

Wir haben optogenetische Stimulation der Flucht Verhaltensweisen durch Baden frei zu Fuß Fliegen in helles blaues Licht gezeigt. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in frei zu Fuß Fliegen zu untersuchen, und können zu größeren Plattformen, indem Sie einfach Tiling die LED-Arrays wir über eine größere Fläche verwendet skaliert werden. Verwenden Sie entweder die kostengünstige Kamera, die wir beschreiben, oder andere verfügbare Kamera-Systeme, kann der Anwender individuell die Bi...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagens
All-trans Retinal	Voraus Scientific & Chemical Inc	R3041
			Ausrüstung
Kühlkörper 9,2 K / W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm Vierkant X 30 mm hoch
Carclo 18 ° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blau Rebel am Tri-Star Base LED	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Treiber	Luxeonstar	3021-DE-700
Kabelbaum für BuckPuck Treiber	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermische Klebeband	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Basis
Snap-Loc Coolant Hose, ¼ "ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Schlauchverbinder	McMaster-Carr	5307K39	¼ "NPT
Laboratory Grade Switching Mode Programmierbare DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim Kamera	Casio	EX-FH20