在缺血大鼠肺的血管生成

摘要

肺灌注全身支气管动脉和肺动脉。在大多数肺病理学，它是较小的全身血管，显示了强大的新血管形成。停止肺血流量，促进轻快的支气管血管生成。我们提供诱导左肺动脉缺血，促进支气管新生血管的手术细节。

摘要

成人肺灌注全身支气管动脉和整个下肢静脉回流流经肺动脉。在大多数肺癌病症，它是规模较小的全身血管，增强肺灌注需要作出响应，并显示强大的新生血管。已经显示出肺血管局部缺血诱导的肺动脉梗阻导致快速全身动脉血管生成的人以及在几个动物模型。虽然组织学评估过程中的时间支气管动脉增殖的影响进行了仔细的描述的¹的威贝尔，机制，负责本组织生长的新船是不明确的。我们提供左肺动脉缺血诱导的大鼠，导致支气管新生血管的手术细节。血管生成的程度的定量的呈现的两个内的肺血管床的存在下，由于一个额外的挑战。方法确定新生血管形成的基础上标记的微球注射。

引言

全身血管生成的肺是大家公认的。在疾病状态下，如哮喘^，肺间质纤维化^3，癌症，慢性肺血栓栓塞症，全身血管和周围的肺中繁衍，侵入肺实质。然而，动物模型来研究这种差别激活的系统，而不是肺循环的毕竟是少数。也许全身新生血管在成年哺乳动物的肺是最可重复性的模型是发生诱导慢性肺动脉缺血后。左肺动脉阻塞在人类^5-7，狗，猪，羊，豚鼠，大鼠^{，12日，13日}和小鼠¹⁴支气管动脉和肋间动脉的快速普及。全身neovasculari负责的机制zation的肺肺缺血后，在很大程度上是未知的，并没有被广泛研究。支气管左肺动脉阻塞后的大鼠血管生成的过程中的时间已被仔细描述在病理工作威贝尔^1。这项工作在大鼠延伸的，我们的实验室已集中生长的重要因素，以及在这个过程中的生理结果本新生血管在肺。结果表明缺血后早期和中和抗体治疗大鼠CXCR2的趋化因子CINC-3升高，CINC-3受体，抑制血管新生^13。新成立的支气管肺缺血发作后的14天内被证明是血管异常显着提高蛋白质的通透性^15。左肺功能弥散能力下降和减少肺容积¹⁵中的表现不正常。虽然新生血管可能有合作ntributed慢性肺缺血肺组织的保护，它似乎不正常，可能会导致肺功能持续下降。

这种模式最奇怪的方面之一可能涉及血管增殖的空间分布。尽管在肺实质因缺血而释放生长因子，新生血管起源于比较大的上游支气管动脉。出现正常的支气管动脉从主动脉的一个小分支和侵入呼吸道树，在气管隆突。这样的机制，其中生长因子诱导的初始阶段动脉生成是不明确的。我们建议，大鼠，用类似人类的血管解剖，提供一个独特的机会来研究负责全身血管生成在肺缺血的机制。虽然左肺动脉完全阻塞是一种罕见的发生在人类的主题，增加支气管血管患者出现同样引起任何部位和大小的肺动脉阻塞^16。因此，我们提供了手术结扎左肺动脉在大鼠和的一种手段，以量化的大小的血管生成的方法的详细描述。

研究方案

对老鼠进行的所有协议，由美国约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准，并按照与美国国立卫生研究院的指导方针。只要有可能，动物应该是手术准备在从手术区域分开的区域的外科手术部位，以尽量减少污染。

1。麻醉/镇痛

1. 放置在感应腔注入3％异氟醚的大鼠（只SD雄性大鼠，125-150克;哈伦，印第安纳波利斯，IN）。
2. 将板的鼻锥和呼吸机连接到3％异氟醚麻醉手术麻醉大鼠。使用无菌技术的所有程序。悬垂老鼠，以确保无菌操作领域。

2。插管法

1. 仰卧位，用医用胶带固定附加物。
2. 删除大鼠的鼻锥，延长舌与软垫钳。
3. 使用14号intracath与钝的金属stilet的为导向。滑动后面ngue，进气管。
4. 取出金属stilet离开的白色塑料intracath在气管。确保将大鼠呼吸和空气流过管子。
5. 更换鼻锥直接转接器导管，连接呼吸机（90次/分，潮气量8毫升/公斤;啮齿动物呼吸机型号683，哈佛装置，州Holliston，马萨诸塞州）的老鼠。
6. 应用Puralube（巴特勒施恩​​，都柏林，OH）兽医药膏眼睛。

3。开胸手术

1. 地点大鼠右侧下来，用医用胶带固定附属物。
2. 剃须左侧胸腔区。
3. 删除多余的皮毛，小真空。
4. 聚维酮碘棉棒（Dynarex公司，Orangebur，NY），其次是用酒精擦拭消毒领域。这个过程重复2次（共3磨砂）。
5. 横切口用无菌无菌手术刀解剖剪刀或在中心场。
6. 钝性解剖，通过L艾尔斯的组织和脂肪肋骨（最后一层薄膜覆盖肋骨）。
7. 计数肋骨，以确定^第三肋间。
8. 45°格雷夫使用无菌镊子，3 ^次和^第 4肋骨之间切开钝。
9. 将肋骨分离器，拉轻轻地创建开放作废，完全可视化的肺，在缝合的地方磁带保持开放。

4。左肺动脉结扎术

1. 90°格雷夫钳，将左肺用右手。
2. 使用杜蒙模式第5直线镊子，用左手抓住左肺动脉和呼吸道。左肺动脉，将为在气道。确保镊子直接垂直于工作台。此外，它是最有效的在最前端的位置（最近的实质）拿起左肺动脉/左主支气管。将左肺外的通风这左手机动的。
3. 使用杜蒙模式＃5 45°弯钳分离左肺动脉，在其自然边界的左主支气管。这种分离出现薄白线之间的两个独立的结构。
4. 分离直接下动脉，而无需通过容器;顺畅地滑动沿分离的钳子提示保持在一起。
5. 继续直到提示钳明显分开，左肺动脉和左主支气管。只有一小点的提示，需要通过充分。如果血液可以可视化的钳子的前端上，然后它是不能完全通过和不应该尝试结扎。一旦通过的空间，左肺动脉，将为在曲线上的钳子。保持在这个位置。
6. 轻轻松开直钝镊子手柄（左手）和抢一块的预切缝（2-3英寸聚丙烯缝线大小6-0 MYCO医疗，卡里，NC）。
7. 打开弯钳抱着左肺动脉和g拉布缝合。通过空间之间的左肺动脉和左主支气管向上的相对运动的曲线的钳子轻轻地拉缝合。
8. 系紧阻断左肺动脉与一个平结，仔细剪断剩余的缝合线。
9. 关闭肋骨4-0安装到19毫米，3/8圈反向切割止血针（MYCO医疗，卡里，NC），小心不要使用钝钳按住肋骨和缝合用聚丙烯（蓝色单丝）尺寸缝合皮肤（仅肋骨）。
10. 完成一个宽松的平结，肺膨胀，积极呼气末正压（PEEP 2-5 CMH _{2 O），hyperinflate}肺当时的安全结得紧紧的，另一个结前剪断缝合其余的。移除PEEP和可视化，持续30秒，以确保，肺不折叠。将5滴布比卡因（APP制药，Schaumbur，IL）。
11. 关闭皮肤组织胶对伤口和皮肤一起推动使用返回END棉棒涂抹。给布比卡因（2.0毫克/公斤皮下）在切口部位随后每8小时，24小时或直到动物恢复正常活动。作为在这方面的皮下组织层是非常薄的，它是不容易在其自己的缝合。当组织胶施加和皮肤被推到一起，它也会关闭皮下层。
12. 关闭异氟醚气体，但继续的老鼠通风室内空气1-2分钟，直到自愿运动的回报。脱离呼吸机，拔除气管导管，确保将大鼠自主呼吸，然后再将其取出。
13. 擦去Puralube眼睛用棉签和监控运动和恢复。注射盐酸丁丙诺啡（0.05 mg / kg腹腔，巴特勒施恩​​，都柏林OH）。继续48小时手术后镇痛，每12小时交付。

5。左侧颈总动脉插管

要评估的幅度支气管perfus离子在期望的时间点后，左肺动脉结扎缺血左肺，注射标记的微球通过左侧颈动脉到主动脉弓。准备大鼠以上1-2。

1. 切中线，沿着颈部中，冲解剖发现气管和左侧颈总动脉（微球注射部位）。
2. 插入导管充满肝素盐水，钝尖PE20管（Becton Dickinson公司，火花MD）连接到25克针，4路，1毫升注射器活塞的容器。
3. 将一瓶的微球（15μm的深红色聚苯乙烯荧光微球，1×10 ^6个球/毫升; Invitrogen公司，尤金，OR）在水中的超声波发生器30秒。
4. 取出瓶，涡和玻璃注射器1毫升汉密尔顿（Hamilton公司，雷诺，内华达州）至20克针吸取0.5毫升（500,000微球）。
5. 将4路活塞的汉密尔顿注射器注入微球注射泵（率:500μl/ min的精灵此外，肯特科学，Torringt上，CT）。
6. 移除Hamilton注射器和冲洗装置用1毫升heparized生理盐水，在500μl/ min的。
7. 执行完整的胸部开胸切断对大鼠下腔静脉抽血。
8. 拆下左侧的肺和其他组织的利益。
9. 要提取从组织中的微球，采取整个左肺后大鼠放血2M KOH（4-6毫升）中，并将其放置。在55°C水浴和离开组织消化过夜。加入吐温80（0.25％）洗珠，涡旋（10秒），并离心（2,000 rpm转速，20℃，10分钟）。除去上清液，添加2 - 乙氧基乙基乙酸酯（1毫升），涡旋，并静置1小时。后离心，离心（2000转;（20°C，10分钟），取出2 - 乙氧基乙酯水层含有的荧光，放置在试管和措施，使用日立F-2500型荧光分光光度计（激发612/emission 618 Digilab，州Holliston，MA）。

结果

血管铸型:左肺动脉缺血大鼠的影响的结果是在图1中所示。显示的是甲基丙烯酸酯演员的支气管血管和广泛的血管，气道左边的树后的28天内LPAL。要获得此铸造，注射全身血管与甲基丙烯酸酯的混合物（红色），降主动脉逆行进入气管插管和注射一个白色的基于硅的材料。血管铸型提供了一个显着的肺支气管血管生成的可视化。特别值得一提的是大，曲折上游的支气管血管的左肺。虽...

讨论

左肺动脉结扎在所有物种进行测试导致的缺血性强大的全身新生血管的肺。我们已经提出了详细的手术方法在大鼠模型。我们的研究结果所产生血管铸型，组织病理学，并在体内标记表明支气管动脉增殖和灌注肺实质。因此，的支气管血管生成机制，可以研究平行的人类生存条件的慢性肺血栓栓塞症的动物模型。此外，临床上相关的小动物模型提供了一个机会，学习的形式和功能的新生血?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂:	公司
盐酸丁丙诺啡，Puralube;	巴特勒施恩
布比卡因	APP制药公司
聚维酮碘棉棒	Dynarex公司
聚丙烯缝线大小为6-0，3/8圈反向切割针	MYCO医疗
PE20管材	Becton Dickinson公司
15微米的深红色的聚苯乙烯fluorospheres	Invitrogen公司
1毫升汉密尔顿玻璃注射器	汉密尔顿公司
设备:
精灵加注射泵	肯特科学
荧光分光光度计	Digilab
啮齿动物呼吸机型号683	哈佛设备
			表1表的具体的试剂和设备。