L'angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

Riepilogo

Il polmone è perfuso sia l'arteria sistemica bronchiale e arterie polmonari. Nella maggior parte delle patologie polmonari, è il più piccolo vascolare sistemica che mostra neovascolarizzazione robusta. La cessazione del flusso ematico polmonare promuove l'angiogenesi vivace bronchiale. Noi forniamo i dettagli chirurgici di indurre ischemia arteriosa polmonare sinistra che promuove la neovascolarizzazione bronchiale.

Abstract

Il polmone adulto è perfuso sia l'arteria sistemica bronchiale e il ritorno venoso intero che scorre attraverso le arterie polmonari. Nella maggior parte delle patologie polmonari, è il più piccolo vascolare sistemica che risponde ad una esigenza di perfusione polmonare avanzata e mostra neovascolarizzazione robusta. Ischemia vascolare polmonare indotta da ostruzione arteriosa polmonare ha dimostrato di provocare una rapida angiogenesi arteriosa sistemica nell'uomo e in modelli animali. Sebbene la valutazione istologica del corso tempo di proliferazione dell'arteria bronchiale nei ratti è stato accuratamente descritto da Weibel ^1, meccanismi responsabili di questa crescita di nuovi vasi organizzata non sono chiare. Noi forniamo i dettagli chirurgici di indurre sinistra ischemia arteriosa polmonare nel ratto che porta alla neovascolarizzazione bronchiale. Quantificazione del grado di angiogenesi presenta una sfida aggiuntiva per la presenza dei due letti vascolari all'interno del polmone. Metodideterminare angiogenesi funzionale sulla base iniezioni microsfere sono etichettati.

Introduzione

Angiogenesi sistemica nel polmone è ben riconosciuta. In condizioni patologiche quali asma ^2, fibrosi polmonare interstiziale ^3, cancro ^4, tromboembolia polmonare cronica e ^5, il sistema vascolare sistemica e circonda i prolifera polmonari e invade il parenchima polmonare. Tuttavia, i modelli animali per studiare questa attivazione differenziale del sistemica piuttosto che la circolazione polmonare sono pochi. Forse il modello più riproducibile di neovascolarizzazione sistemica nel polmone del mammifero adulto è quella che si verifica dopo induzione cronica ischemia arteriosa polmonare. La risposta a sinistra ostruzione dell'arteria polmonare nell'uomo ^{5-7, 8} cani, maiali, pecore ^{9 10,} cavie, ratti ^{11 1, 12, 13, 14} e topi è la rapida proliferazione dell'arteria bronchiale e arterie intercostali. I meccanismi responsabili della sistemica neovascularizione del polmone dopo ischemia polmonare non sono noti e non sono state ampiamente studiate. La durata di angiogenesi bronchiale nel ratto dopo sinistra ostruzione dell'arteria polmonare è stata descritta nel lavoro istologica di Weibel ^1. Estendere questo lavoro nel ratto, il nostro laboratorio ha focalizzato su entrambi i fattori di crescita importanti in questo processo, nonché l'esito fisiologico di questo neovascolarizzazione nel polmone. Risultati dimostrano la chemochina CXC CINC-3 è elevata precoce dopo ischemia e trattando ratti con un anticorpo neutralizzante per CXCR2, il recettore per CINC-3, attenua angiogenesi ^13. Il sistema vascolare di nuova costituzione bronchiale 14 giorni dopo l'insorgenza di ischemia polmonare ha dimostrato di essere anormale, con un significativo aumento della permeabilità delle proteine ^​​15. Funzione polmonare sinistra non stava mostrando normale diminuita capacità di diffusione e una diminuzione del volume polmonare ^15. Sebbene la neovascolarizzazione può avere contributed alla conservazione del tessuto polmonare durante ischemia cronica polmonare, sembra non essere normale e può contribuire ad un prolungato decremento della funzione polmonare.

Forse uno degli aspetti più curiosi di questo modello riguarda la distribuzione spaziale della proliferazione dei vasi sanguigni. Nonostante il rilascio di fattori di crescita all'interno del parenchima polmonare da ischemia, la neovascolarizzazione originario monte relativamente grandi arterie bronchiali. L'arteria bronchiale normale si pone come un piccolo ramo della aorta e invade l'albero delle vie aeree alla carena. Così il meccanismo con cui i fattori di crescita indurre la fase iniziale di arteriogenesi non è chiara. Suggeriamo che il topo, con una anatomia vascolare simili agli esseri umani, fornisce un'opportunità unica di studiare i meccanismi responsabili per l'angiogenesi sistemico polmonare durante l'ischemia. Sebbene completa ostruzione dell'arteria polmonare sinistra è un evento raro in soggetti umani,aumentata vascolarizzazione bronchiale sembra essere similmente indotta in pazienti indipendentemente dalla dimensione del sito e ostruzione dell'arteria polmonare ^16. Così, forniamo una descrizione dettagliata del metodo chirurgico per legare l'arteria polmonare sinistra in ratti e un mezzo per quantificare la grandezza di angiogenesi.

Protocollo

Tutti i protocolli eseguiti su ratti sono stati approvati dalla Johns Hopkins Animal Care University e del Comitato uso e in conformità con le linee guida NIH. Quando possibile, l'animale deve essere preparata chirurgicamente in una zona separata dalla zona chirurgica per ridurre al minimo la contaminazione del sito chirurgico.

1. Anestesia / analgesia

1. Posto ratto (ratti Sprague Dawley maschi, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) in una camera di induzione infuso con 3% isoflurano.
2. Posizionare ratto anestetizzato a bordo chirurgia attaccato al cono e ventilatore con il 3% anestesia isoflurano. Utilizzare la tecnica sterile per tutte le procedure. Drappeggio ratto garantire campo sterile operativo.

2. Intubazione

1. Immobilizzare appendici in posizione supina con nastro adesivo chirurgico.
2. Rimuovere ratto dal naso a cono, estendere la lingua con le pinze imbottite.
3. Utilizzare 14 intracath calibro con stiletto in metallo smussato come guida. Far scorrere dietro aNgue, nella trachea.
4. Rimuovere stiletto in metallo bianco lasciando intracath plastica in trachea. Garantire il ratto respira e l'aria fluisce attraverso il tubo.
5. Sostituire il cono con adattatore diretto al catetere, collegare ratto di ventilatore (90 atti / min, 8 ml / kg di volume corrente; Roditore Ventilatore modello 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
6. Applicare Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) unguento veterinaria sugli occhi.

3. Toracotomia

1. Luogo ratto lato destro verso il basso, immobilizzare appendici con nastro adesivo chirurgico.
2. Shave sinistra nella cassa toracica laterale.
3. Rimuovere pelo in eccesso con il vuoto di piccole dimensioni.
4. Fai campo sterile pulendo giù con l'alcol seguita da Povidone-Iodio swabstick (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Ripetere questa operazione altre due volte (per un totale di tre scrub).
5. Fai incisione trasversale con le forbici sterili dissezione o bisturi sterile nel centro del campo.
6. Blunt sezionare attraverso layers del tessuto e grasso fino a nervature (ultimo strato è sottile membrana che copre le costole).
7. Contare costole per determinare 3 ^° spazio intercostale.
8. Utilizzando sterili 45 ° Graefe pinza, fare un'incisione smussato tra il 3 ^° e 4 ^° costola.
9. Inserire separatori costola, tirare leggermente la creazione di vuoto aperto con visualizzazione completa di polmone, nastro adesivo posto su suture di tenere aperto.

4. Sinistra legatura dell'arteria polmonare

1. Con 90 ° pinza Graefe, spostare polmone sinistro posteriore con la mano destra.
2. Utilizzando i modelli Dumont N ° 5 pinze diritte, prendere a sinistra dell'arteria polmonare e delle vie aeree con la mano sinistra. Sinistro dell'arteria polmonare si stese sopra delle vie aeree. Garantire che pinze sono direttamente perpendicolare al tavolo. Inoltre, è più efficace per raccogliere l'arteria polmonare sinistra / bronco principale sinistro nella posizione più distale (più vicino al parenchima). Spingere il polmone sinistro di ventilazione da parte con questa manovra la mano sinistra.
3. Utilizzare Dumontpattern # 5 45 ° pinze curve per separare l'arteria polmonare sinistra dal bronco principale di sinistra alle frontiere naturali. Questa linea di separazione appare sottile e bianca tra le due strutture singole.
4. Separare direttamente sotto l'arteria, senza passare attraverso la nave, senza problemi far scorrere le punte pinze tenute insieme lungo la separazione.
5. Continuare fino a punte della pinza sono visibilmente separati l'arteria polmonare sinistra e il bronco principale di sinistra. Solo un piccolo punto della punta deve essere pienamente attraverso. Se il sangue può essere visualizzata sulla punta della pinza, allora non è completamente tramite legatura e non deve essere tentata. Una volta nello spazio, l'arteria polmonare sinistra porrà sulla curva della pinza. Tenere in questa posizione.
6. Delicatamente rilasciare dritto smussato presa pinza (mano sinistra) e prendere parte di un pre-taglio sutura (~ 2-3 cm; sutura in polipropilene formato 6-0, Myco medici, Cary, NC).
7. Aprire pinze curve cullano sinistro dell'arteria polmonare e grab sutura. Estrarre delicatamente sutura attraverso lo spazio tra sinistra dell'arteria polmonare e bronco principale di sinistra in un movimento verso l'alto rispetto alla curva della pinza.
8. Fissate occludere la polmonare sinistra con un nodo quadrato, resto attentamente snip di sutura.
9. Chiudi costole con una pinzetta smussate per tenere costola e due volte con sutura in polipropilene (monofilamento blu) taglia 4-0 collegato a un 19 mm, 3/8 retromarce cerchio di taglio dell'ago (Myco Medical, Cary, NC) in una pinza emostatica, facendo attenzione a non sutura della pelle (solo costole).
10. Completare un nodo allentato quadrato, gonfiare il polmone, luogo positiva di fine espirazione (PEEP; 2-5 cm H ₂ O), hyperinflate nodo polmonare poi sicuro strettamente e fare un altro nodo pieno prima snipping resto di sutura. Rimuovere dalla PEEP e visualizzare per 30 sec per garantire che il polmone non collassa. Applicare 5 gocce Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
11. Chiudi la pelle mettendo colla tessuto sulla ferita e spingere indietro la pelle insieme usando end di cotone punta dell'applicatore. Dare Bupivicaine (2,0 mg / kg per via sottocutanea) al sito di incisione successivamente ogni 8 ore per 24 ore o fino a quando l'animale riprende la normale attività. Come strato sottocutaneo in questa zona è molto sottile, non è facile da suturare da solo. Quando la colla è applicata tessuto e la pelle viene accostati chiude anche lo strato sottocutaneo.
12. Spegnere gas isoflurano, ma continuano a ventilare il ratto per 1-2 minuti in aria ambiente fino al ritorno del movimento volontario. Scollegare il tubo tracheale dal ventilatore e assicurarsi che il ratto è in respiro spontaneo prima di rimuoverlo.
13. Pulire Puralube da occhi con un batuffolo di cotone e il movimento del monitor e di recupero. Iniettare buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg intraperitoneale, Butler Schein, Dublino OH). Continua la consegna di ogni analgesico ore 12 per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.

5. Sinistra incannulamento arteria carotide

Per valutare l'entità del perfus bronchialiione del polmone ischemico sinistra a tempi desiderati sinistra dopo legatura dell'arteria polmonare, iniettare microsfere marcate attraverso l'arteria carotide sinistra nella aortico. Preparare ratti come sopra 1-2.

1. Tagliare linea mediana lungo il collo, smussare sezionare per rivelare trachea e sinistra arteria carotide (al sito di iniezione microsfere).
2. Inserire il catetere riempito con soluzione fisiologica eparinizzata, punta smussata di PE20 tubi (Becton Dickinson, Sparks MD) nel serbatoio collegato a 25 g di aghi, 4 vie rubinetto, siringa da 1 ml.
3. Bottiglia Luogo di microsfere (15 micron cremisi polistirene microsfere fluorescenti, 1 x 10 ⁶ sfere / ml; Invitrogen, Eugene, OR) in sonicatore acqua per 30 sec.
4. Rimuovere bottiglia, vortice e redigere 0,5 ml (500.000 microsfere), in un ml 1 siringa di vetro Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV) attraverso un ago 20 g.
5. Collegare la siringa Hamilton a 4-way rubinetto e infondere microsfere con pompa a siringa (rate: 500 microlitri / min; Genie Plus, Kent scientifico, Torringtsu, CT).
6. Rimuovere la siringa Hamilton e apparecchi filo con 1 ml di soluzione fisiologica heparized a 500 microlitri / min.
7. Eseguire toracotomia pieno petto e exsanguinate il ratto dal recidendo la vena cava inferiore.
8. Rimuovere il polmone sinistro e altri tessuti di interesse.
9. Per estrarre microsfere dal tessuto, prendere l'intero polmone sinistro del ratto dopo dissanguamento e trasferirla in KOH 2M (4-6 ml). Mettere in un bagno d'acqua ° 55 C e lasciare per una notte per la digestione dei tessuti. Aggiungere Tween 80 (0,25%) per lavare le perline, vortice (10 sec) e centrifugare (2000 rpm, 20 ° C per 10 min). Rimuovere il surnatante, aggiungere 2-etossietil acetato (1 ml), vortex e lasciare riposare per 1 ora. Vortex e centrifugare la sospensione (2.000 rpm; (20 ° C per 10 min) Rimuovere il 2-etossietil strato acquoso contenente l'acetato, fluorescenza posto in una cuvetta e misurare usando un Hitachi F-2500 spettrofotometro a fluorescenza (eccitazione 612/emission 618. , Digilab, Holliston, MA).

Risultati

Espressi vascolare: Risultati degli effetti di sinistra ischemia dell'arteria polmonare nel ratto sono rappresentati in figura 1. Viene mostrato un cast in metacrilato del circolo bronchiale e la vascolarizzazione estesa della struttura delle vie aeree sinistra 28 giorni dopo la LPAL. Per ottenere questo cast, il sistema vascolare sistemica è stata iniettata una miscela metacrilato (rosso), retrogrado nell'aorta discendente e la trachea è stata incannulata e iniettato con un materiale a base d...

Discussione

Sinistra legatura dell'arteria polmonare in tutte le specie testate porta alla robusta neovascolarizzazione sistemica del polmone ischemica. Abbiamo presentato i dettagli del metodo chirurgico in un modello di ratto. I nostri risultati prodotti da fusione vascolare, istopatologia, e in vivo dimostrano che l'etichettatura arterie bronchiali proliferano e perfusione del parenchima polmonare. Così, i meccanismi di angiogenesi bronchiale può essere studiata in un modello animale che affianca la condizione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti:	Azienda
buprenorfina cloridrato, Puralube	Butler Schein
bupivicaine	APP Pharmaceuticals
Povidone-iodio swabstick	Dynarex Corporation
polipropilene dimensioni sutura 6-0, 3/8 cerchio ago inversione di taglio	Myco Medical
PE20 tubi	Becton Dickinson
15 micron fluorosfere polistirene cremisi	Invitrogen
1 ml di vetro siringa Hamilton	Hamilton Azienda
Attrezzatura:
Genie Inoltre siringa pompa	Kent scientifico
Spettrofotometro fluorescenza	Digilab
Roditore Ventilatore Modello 683	Harvard Apparatus
			Tabella 1. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche.