허혈성 쥐 폐의 혈관 신생

요약

폐는 전신 기관지 동맥과 폐동맥 동맥 모두에서 perfused 있습니다. 대부분의 폐 pathologies에서는 강력한 neovascularization을 보여주는 작은 조직 vasculature입니다. 폐 혈액 흐름의 중단이 활발 기관지 혈관 신생을 촉진합니다. 우리는 기관지 neovascularization을 촉진 좌측 폐동맥의 국소 빈혈을 일으킬 외과 세부 정보를 제공합니다.

초록

성인 폐는 전신 기관지 동맥과 폐동맥 동맥을 통해 흐르는 전체 정맥 반환 모두에 의해 perfused 있습니다. 대부분의 폐 pathologies에서는 향상된 폐 관류에 대한 필요에 응답하고 강력한 neovascularization을 보여주는 작은 조직 vasculature입니다. 폐 동맥 방해에 의해 유도 폐 혈관 국소 빈혈은 사람의 급속한 전신 동맥 혈관 신생뿐만 아니라 여러 동물 모델에서 결과로 표시되었습니다. 쥐의 기관지 동맥 확산의 시간 코스의 histologic 평가는 신중하게 Weibel ¹ 설명되었지만, 새로운 혈관의 조직 성장을위한 책임이 메커니즘은 명확하지 않습니다. 우리는 기관지 neovascularization로 연결 쥐에서 좌측 폐동맥의 국소 빈혈을 일으킬 외과 세부 정보를 제공합니다. 혈관 신생의 정도의 정량화는 폐 내의 두 혈관 침대의 존재로 인해 추가 과제를 제공합니다. 방법표시 microsphere 주사에 따라 기능 혈관 신생을 결정하기 위해 제공됩니다.

서문

폐의 조직 혈관 신생은 잘 인식됩니다. 이러한 천식 ^2, 간질 폐 섬유증이 ³ 암 ⁴ 및 만성 폐 thromboembolism ^5의 전신 vasculature과 폐 실질 폐 proliferates 주변과 침공과 같은 질병 상태에서. 그러나, 조직의 차동 활성화보다는 폐 순환을 공부하는 동물 모델은 몇 가지 있습니다. 아마도 성인 포유 동물의 폐에 조직 neovascularization의 가장 재현 모델은 만성 폐 동맥 국소 빈혈을 유도 한 후 발생하는 것입니다. ^5-7 인간 좌측 폐동맥 폐쇄에 대한 반응은, 개 ^8, 돼지 ^9, 양 ^10, 기니 돼지 ^11, 쥐 ^{1, 12, 13} 및 마우스 ¹⁴ 기관지 동맥뿐만 아니라 갈비 사이 동맥의 급속한 확산이다. 전신 neovasculari에 대한 책임 메커니즘폐 국소 빈혈 후 폐의 zation은 대부분 알 수없는 널리 연구되지 ​​않았습니다. 좌측 폐동맥 폐쇄 후 쥐의 기관지 혈관 신생의 시간 코스는 신중하게 Weibel ^1의 histologic 작품에 설명되어 있습니다. 쥐에이 작품 확장, 저희 연구실이 과정에서 중요한 성장 요인뿐만 아니라 폐에서이 neovasculature의 physiologic 결과 모두에 초점을 맞추고있다. 결과가 CXC 케모카인의 CINC-3은 초기 국소 빈혈 후에 CXCR2에 중화 항체를 쥐를 치료 올라간다 보여, CINC-3 수용체는 혈관 신생 ¹³ attenuates. 십사일 폐 국소 빈혈의 발병 후 새로 설립 된 기관지 vasculature 수가 크게 증가 단백질 투자율 ¹⁵ 이상으로 표시했습니다. 왼쪽 폐 기능은 diffusing 용량과 폐 볼륨 ¹⁵ 감소 감소 일반 게재되지 않았습니다. neovasculature가 공동있을 수 있습니다 있지만만성 폐 국소 빈혈 동안 폐 조직의 보존에 ntributed, 그것은 정상하고 폐 기능의 지속적인 감소에 기여할 수는 없습니다 나타납니다.

아마도이 모델의 가장 호기심 측면 중 하나는 혈관을 proliferating의 공간적 분포에 관한 것이다. 국소 빈혈로 인한 폐 실질 조직 내에서의 성장 요인의 출시에도 불구하고, neovasculature이 상대적으로 큰 업스트림 기관지 동맥에서 유래 된 것입니다. 정상적인 기관지 동맥은 대동맥에서 작은 지점으로 발생하고 카리나의기도 트리를 침공. 따라서 성장 요인 arteriogenesis의 초기 단계를 유도하는하여 메커니즘은 명확하지 않습니다. 우리는 쥐가 인간과 비슷한 혈관 해부학 적으로 폐 국소 빈혈 동안 전신 혈관 신생을 담당하는 메커니즘을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공하는 것이 좋습니다. 좌측 폐동맥의 완전한 방해가 인간의 과목에서 드문이지만하면,증가 기관지 vascularity는 유사 환자에서 유도 할 것으로 보인다 폐동맥 폐쇄 ^(16)의 어떤 사이트와 크기입니다. 따라서, 우리는 쥐의 왼쪽 폐 동맥과 혈관 신생의 정도를 수량화 할 수있는 수단을 ligate 할 수있는 수술 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

프로토콜

쥐에서 수행 모든 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회와 NIH의 지침에 따라 승인되었습니다. 가능하면 동물은 수술 외과 사이트의 오염을 최소화하기 위해 수술 영역에서 별도의 지역에 준비해야합니다.

1. 마취 / 무통

1. 3퍼센트 isoflurane과 함께 주입 유도 챔버에서, 장소 쥐 (할렌, 인디애나 폴리스, IN Sprague Dawley 남성의 쥐, 125~150그램).
2. 3퍼센트 isoflurane 마취와 코 콘과 환풍기에 연결된 수술 보드에 anesthetized 쥐를 놓습니다. 모든 절차에 대한 무균 기술을 사용합니다. 멸균 운영 필드를 보장하기 위해 쥐를 내리면 t.

2. 삽관 법

1. 외과 테이프를 사용하여 부정사 위치에 부속을 고정.
2. 코 콘에서 쥐를 제거 패딩 집게로 혀를 확장합니다.
3. 가이드로 무딘 금속 stilet와 14 게이지 intracath을 사용합니다. 에 뒤에 슬라이드기관에 ngue.
4. 기관에 흰색 플라스틱 intracath을 떠날 금속 stilet를 제거합니다. 쥐 호흡하며 공기가 튜브를 통하여 흐르는 확인하십시오.
5. 카테터에 직접 어댑터 코 콘을 교체, 환풍기 (, 8 ML / kg 갯벌 볼륨, 설치류 환풍기 모델 683, 하버드 장치, Holliston, 매사추세츠 90 숨 / 분)에 쥐를 연결합니다.
6. Puralube (버틀러 Schein, 더블린, OH) 눈에 수의학 연고를 적용 할 수 있습니다.

3. Thoracotomy

1. 장소 쥐 오른쪽 아래, 외과 테이프를 사용하여 부속을 고정.
2. 왼쪽 흉곽 영역을 면도.
3. 작은 진공과 초과 털을 제거합니다.
4. Povidone - 요오드 swabstick (Dynarex 공사, Orangebur, NY)에 의해 다음 알코올로 닦고하여 살균 필드를 확인합니다. 이 과정을 두 번 이상 (3 스크럽 총)을 반복합니다.
5. 필드의 중앙에 메스 멸균 해부 가위 또는 멸균과 횡 방향의 절개를합니다.
6. 리터를 해부 퉁명아래 갈비 (마지막 층은 갈비를 덮고 얇은 막입니다)에 조직과 지방의 에어.
7. ³ 늑간 공간을 결정하기 위해 갈비뼈를 계산합니다.
8. 멸균 45 ° Graefe 집게를 사용하여 ^3, 4 ^번째 갈비뼈 사이의 무딘 절개를합니다.
9. , 갈비뼈 구분 기호를 삽입 부드럽게 개방 유지하기 위해 봉합에 열려있는 폐의 전체 시각화와 무효, 장소 테이프를 만드는 당긴다.

4. 좌측 폐동맥의 결합

1. 90 ° Graefe의 포셉으로 오른손으로 다시 왼쪽 폐를 이동합니다.
2. 뒤몽 패턴을 # 5 바로 집게를 사용하여, 왼쪽 손으로 왼쪽 폐 동맥과기도를 잡아. 왼쪽 폐동맥기도 위에 누워 것입니다. 포셉은 테이블에 직접 수직 있는지 확인합니다. 또한, 그것은 가장 말초 위치 (실질에 가장 가까운)에서 좌측 폐동맥 왼쪽 / mainstem의 기관지을 수령 것이 가장 효과적입니다. 이 왼쪽 기동과 옆 환기 왼쪽 폐를 밀어 넣습니다.
3. 뒤몽을 사용패턴 # 5 45 °의 자연 국경에서 왼쪽 mainstem의 기관지에서 왼쪽 폐동맥을 분리 곡선 포셉. 이 분리 라인은 두 개인 구조 사이의 얇고 흰 나타납니다.
4. 혈관을하지 않고 동맥에서 바로 분리, 부드럽게 분리를 따라 함께 개최 포셉 팁을 끼 웁니다.
5. 포셉의 팁이 가시적 왼쪽 폐 동맥과 왼쪽 mainstem의 기관지를 분리 할 때까지 계속합니다. 팁의 작은 점은 완전히 통해 있어야합니다. 혈액 포셉의 끝에서 시각화 할 수 있다면, 그것은을 통해 완전히되지 않고 결합을 시도하지 않아야합니다. 일단 공간을 통해 왼쪽 폐동맥 포셉의 곡선에 누워 것입니다. 이 위치에 잡아.
6. 부드럽게 직선 무딘 집게 그립 (왼쪽)을 공개하고 사전 절단 봉합 (~ 2~3인치, 폴리 프로필렌 봉합사 크기 6-0, Myco 의료, 캐리, NC)의 조각을 잡아.
7. 좌측 폐동맥와 g를 데리고 곡선 포셉을 엽니 다랩의 봉합. 부드럽게 포셉의 곡선에 상대적으로 상승 운동에 좌측 폐동맥과 왼쪽 mainstem의 기관지 사이의 공간을 통해 봉합사를 당겨.
8. 사각형 매듭과 왼쪽 폐, 봉합의주의 싹둑 나머지 부분을 occluding 아래로 묶어주세요.
9. (파란색 모노 필라멘트) 폴리 프로필렌으로 두 번 갈비뼈와 봉합을 보유하는 무딘 집게를 사용하여 닫기 갈비 크기주의하지로하는 것 19mm, hemostat에 바늘을 (Myco 의료, 캐리, NC) 절단 8분의 3 원 역에 첨부 4-0 봉합 피부 (단 갈비).
10. 느슨한 광장 매듭을 완료, 긍정적 인 엔드 - 날숨 압력 (따위가 나오기 시작, 2-5 cmH ₂ O)에, 장소를 폐를 부풀려, 단단히 폐 후 안전한 매듭을 hyperinflate하고, 봉합의 나머지 부분을 snipping 전에 다른 모든 매듭을합니다. 따위가 나오기 시작에서 제거하고 폐는 붕괴하지 않도록 30 초에 표시합니다. 5 물방울 Bupivicaine을 (APP 제약, Schaumbur, IL) 적용됩니다.
11. 닫기 상처를 조직 접착제를 삽입하여 피부와 함께 피부를 밀어은 전용 다시 사용면 팁 작은 주걱의 D. 이후 절개의 위치 24 시간마다 8 시간이나 동물이 정상적인 활동을 다시 시작 때까지 Bupivicaine (2.0 밀리그램 / kg 피하)를 제공합니다. 이 지역의 피하 층은 매우 얇은으로, 이것 자체로는 치료해야 쉽지 않다. 조직 접착제가 적용되고 피부가 두명이 경우 또한 피하 층을 닫습니다.
12. isoflurane 가스를 해제하지만, 자발적인 움직임을 반환 할 때까지 실내 공기에 1-2 분 동안 쥐를 환기하고 있습니다. 환풍기에서 tracheal 튜브를 분리하고 쥐를 제거하기 전에 자발적 호흡이되어 있는지 확인합니다.
13. 면봉 및 모니터 운동 및 복구와 눈에서 Puralube을 닦아주십시오. (0.05 MG / kg intraperitoneal, 버틀러 Schein, 더블린 OH) buprenorphine 히드로 클로라이드를 삽입. 수술 후 48 시간에 대한 진통제 매 12 시간 배달을 계속합니다.

5. 왼쪽 경동맥 동맥 Cannulation

기관지 perfus의 크기를 평가하려면좌측 폐동맥의 결합 후 원하는 시간 지점에서 허혈성 왼쪽 폐의 이온은, 대동맥으로 왼쪽 경동맥을 통해 표시 마이크로를 삽입. 1-2 위와 같이 쥐를 준비합니다.

1. 목을 따라 중간 선을 잘라 기관과 왼쪽 경동맥 (microsphere 분사 사이트)를 나타 내기 위해 해부 퉁명.
2. 25g 바늘, 4 방향 꼭지, 1 ML의 주사기에 연결된 용기로 PE20 튜브 (Becton 디킨슨, MD를 스파크)의 heparinized 생리, 무딘 팁이 가득 카테터를 삽입합니다.
3. 물 sonicator에서 30 초 동안, 마이크로 (Invitrogen, 유진, 또는 X 10 ⁶ 영역 / ML 15 μm 진홍의 폴리스티렌 형광 마이크로, 1) 장소 병.
4. 병, 소용돌이를 제거하고 20g 바늘을 통해 1 ML 해밀턴 유리 주사기 (해밀턴 회사, 리노 NV)에 0.5 ML (50 마이크로을)를 그립니다.
5. 4 방식 꼭지에 해밀턴 주사기를 첨부 주사기 펌프 (속도로 마이크로을 불러 일으킬 : 500 μl / 분, 지니 플러스, 켄트 과학, Torringt) 코네티컷 있습니다.
6. 500 μl / 분에서 heparized 생리의 1 ML과 해밀턴 주사기와 수세식 장치를 제거합니다.
7. 전체 가슴 thoracotomy을 수행하고 아래 대정맥을 severing하여 쥐를 ...에게서 피를 뽑다.
8. 왼쪽 폐와 관심의 다른 조직을 제거합니다.
9. 조직에서 마이크로 압축을 풀려면 일어난 과다 출혈 후 쥐의 전체 좌측 폐를 타고 2M 코 (4-6 ML)에 배치합니다. 55 ° C의 물을 욕조에 장소와 조직 소화 밤새 둡니다. , 구슬을 씻어 소용돌이 (10 초)과 원심 분리기를 (; 10 분 20 ° C 2,000 RPM) 십대 초반 80 (0.25 %)를 추가합니다. , 표면에 뜨는을 제거합니다 2 ethoxyethyl 초산 (1 ML), 소용돌이를 추가하고 1 시간에 서 보자. 소용돌이 정지 및 원심 분리기 (2,000 RPM, (20 ° C 10 분 용) 히타치 F-2500 형광 분광 광도계를 사용하여 큐벳과 방법으로 형광, 장소를 포함하는 2 ethoxyethyl 초산 수용액 층 (여기 612/emission 618를 제거합니다. , Digilab, Holliston, MA).

결과

혈관 캐스트 : 쥐의 좌측 폐동맥의 국소 빈혈의 효과의 결과는 그림 1에 설명되어 있습니다. 표시하면 기관지 vasculature의 메타 크릴 레이트 캐스트와 28일 LPAL 후 왼쪽기도 트리의 광범위한 vascularity입니다. 이 캐스트를 얻으려면 조직 vasculature는 내림차순으로 대동맥에 역행, 메타 크릴 레이트 혼합물 (빨간색)로 주입하였으며, 기관은 cannulated과 흰색 실리콘 기반 소재로 주입되었다. ?...

토론

테스트 모든 종의 좌측 폐동맥의 결합은 허혈성 폐의 강력한 조직 neovascularization로 연결됩니다. 우리는 쥐 모델에서 수술 방법의 세부 사항을 제시하고 있습니다. 우리의 결과는 혈관 주조, 조직 병리학에서 생산 및 생체 라벨에 기관지 동맥 세포 분열 따위에 의해 번식을 명시하고 폐 실질을 perfuse. 따라서, 기관지 혈관 신생의 메커니즘은 만성 폐 thromboembolism의 인간의 상태를 패러랠 동물 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 :	회사
buprenorphine 히드로 클로라이드, Puralube	버틀러 Schein
bupivicaine	APP 제약
Povidone - 요오드 swabstick	Dynarex 공사
폴리 프로필렌의 봉합 크기 6 대 0으로 8분의 3 원 역 절단 바늘	Myco 의료
PE20 튜브	Becton 디킨슨
15 μm 진홍의 폴리스티렌 fluorospheres	Invitrogen
한 ML 해밀턴 유리 주사기	해밀턴 회사
장비 :
램프의 요정 플러스 주사기 펌프	켄트 과학
형광 분광	Digilab
쥐 환풍기 모델 683	하버드 장치
			표 1. 특정 시약 및 장비 표.