在啮齿类动物呼吸道上皮纤毛运动功能的高分辨率成像的体外方法

摘要

一个简单而可靠的可视化和量化技术，气道纤毛的蠕动和纤毛产生流量使用小鼠气管。这种技术可以被修改，以确定如何广泛的因素，包括药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载影响纤毛运动。

摘要

体外小鼠气道上皮细胞成像技术定量分析洞察黏液纤毛清除功能的重要运动纤毛功能已经确立。刚收获的小鼠气管，通过纵向切开气管肌肉和安装在浅壁室玻璃底的菜。其长轴沿气管样品趁气管肌肉纵向卷曲。这使得成像的纤毛运动，沿着整个气管长度在纵断面图。使用微分干涉显微镜和一个高速的数码相机得到允许纤毛摆动频率的定量分析和睫状波形画在200帧/秒。在成像过程中添加的荧光珠，纤毛产生的流体流动也可以被确定。协议时间跨越约30分钟，5分钟5-10分钟的样品制备室安装，和10-15分钟电视显微镜。

引言

阐明遗传和环境因素会影响粘液纤毛清除功能和肺的健康^1，气道上皮细胞的运动纤毛功能分析实验是重要的。成像的小鼠气道上皮细胞的简单的协议，开发提供了一种有效的方法来审问呼吸道纤毛运动的突变体和基因敲除小鼠模型，并在小鼠气管组织解剖和体外成像与高清晰度电视显微镜，呼吸道纤毛蠕动只需要基本技能。此协议在建立和完善了大规模的鼠标诱变屏幕，运动纤毛功能允许快速评估（纤毛摆动频率，纤毛摆动形状，纤毛产生的流量）患有先天性心脏疾病的伴有内脏异位^2-5的突变体。

目前的技 ​​术，用于研究呼吸道纤毛蠕动，可以分组为急性体外类型或离子蒙古包长期在体外实验方法。急性实验包括人/鼻气道活检刷^6,7 体外可视化和分析简单的横向气道第^8。 在体外细胞培养方法利用各种技术，以产生分化的纤毛上皮细胞，如空气中的液体界面的文化或气悬浮培养^9-11张。然而，这些气道上皮reciliation的技术要求非常显著的投资在时间和培训之前任何可用的纤毛上皮细胞的实验（4-6周^9,10）。虽然通常用于人体临床研究急性呼吸道上皮刷活检体外分析，这种方法是不是可以使用小鼠的研究，由于加剧了机械组织损伤^12。

在这个协议中所述的技术分析的谅解备忘录ê气管的气道上皮细胞不仅是简单的执行，但它不需要特殊的解剖技能，也没有任何专门的设备除了那些电视显微镜成像标准。这个简单的协议有许多优点。首先，小鼠气管组织收获是快速和容易执行，它允许大量的小鼠气道纤毛功能快速评估。这可以包括急性分析不同在体外治疗的短期效果。其次，作为体外技术，气道纤毛上皮细胞仍然连接到相关的支持组织和，从而保留相关的细胞信号通路。因此，在比较， 在体外 reciliated的气道上皮细胞，该制剂在体内的组织环境是一个更好的代表性的自然。第三，该协议允许收购了一些不同的量化参数，可以提供客观的评估运动纤毛f油膏。最后，在对比其他流动呼吸道纤毛可视化的方法，这个协议允许的纤毛纤毛摆动方向直角可视化，允许纵断面图中的纤毛，是最佳的高分辨率成像的纤毛摆动和metachronal的波代。

这个协议可以修改了一些方法来解决了广泛的实验需求等作用的药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载上呼吸道纤毛功能和生成/维护呼吸道纤毛摆动和波传播metachronal。

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研究方案

1。试剂设置

1.1解剖和成像介质

Leibovitz的L-15培养基（L15）补充有FBS（10％）和青霉素 - 链霉素（100单位/ ml青霉素G钠和100微克/毫升硫酸链霉素）气管样品收获和成像过程中使用的。

2。浅寨文化商会大会

图1所示的腔室用来装气管组织。室的地板是玻璃见底35毫米培养皿。通过为0.3mm厚的硅薄片的玻璃盘上方放置一小片产生的腔室的顶部和侧面。在片材的边缘切断，以适应的圆底盘和中心进一步修整，以形成一个浅的中央腔室（见步骤2.1-2.3）。除在此组件中，一个18毫米的圆形盖玻片下产生一个封闭的腔室，适合于成像。

1. 完全覆盖了18毫米的圆形玻璃盖玻片0.3毫米厚的硅薄片的正方形。
2. 随着标准的锐性剥离剪刀剪掉多余的矽胶片，从盖玻片的边缘，（矽胶片层在一个圆形的）。
3. 随着锋利的手术刀切出来，取出矽胶片（约10平方毫米），从中间盖盖玻片（由此形成的顶部和两侧的成像室）中心广场。

3。气管收获和准备

1. 安乐死小鼠根据本地机构动物保健和使用委员会和/或政府指引，并有足够的L15媒体，泅组织（作者只是在出生前在妊娠16.5天的小鼠，通过对去除气管成一个标准的塑料35毫米培养皿新生儿，新生儿和成人的动物^2）。
2. 删除非气管内有相关的组织附着到外的气管使用钝性分离。
3. 取出喉与横向切割正下方的环状软骨使用微清扫剪刀（ 图2A中 ，第1行）。
4. 拆下的左，右主支气管分支与的横向切割正上方的隆突使用微清扫剪刀（ 图2A中 ，第2行）。
5. 轻轻握住气管用细镊子和冲洗管腔2-3次〜1毫升的沐浴L15介质与P1000和P1000的Pipetman尖清除粘液和血液。
6. 切出3-4环段气管采用横向切割，微解剖剪刀（ 图2B，1号线）。
7. 通过使用微解剖剪刀（ 图2B 2号线），这短短的气管段气管肌肉的中间纵向切开。
8. 通过纵向切开气管软骨环的中间使用微解剖剪刀（ 图2C ，行），离开气管组织适合成像的两个部分（ 如图2D所示的单节）。

4。纤毛成像

1. 传输气管组织流明段，面朝下，到中间的L-15培养基100-200微升35毫米的玻璃底培养皿。
2. 为了量化纤毛生成的流洗澡气管组织样品（〜1×10 ¹¹颗粒/ ml或20微升/毫升的Fluoresbrite 2.5％的微球悬浮液的水溶液）的L-15培养基中，添加少量荧光0.20微米的微球。
3. 将预先制备的（见上述第1至第3步骤）上方的气管样品硅胶片的一面朝下的摄像室，位于浅的壁形成的腔室由窗口矽胶片切成在中间气管样品（ 图1 ）。
4. 盖玻片上轻轻向下推以固定到位，并消除任何多余的L-15媒体从边缘全光照GA尖P1000和P1000的Pipetman。
5. 安装35毫米的玻璃底培养皿和气管样本100X客观和DIC的光学显微镜上。
6. 使用一个高速照相机和电影采集软件收集电影纤毛蠕动在200 +帧每秒沿气管纤毛上皮细胞的卷曲边缘气管肌肉（ 图2D概述箱，例如E：静止图像录制电影） （ 补充影片1）。
7. 使用FITC啶成像和低光CCD摄像头（见上面的设备清单），收集荧光微球运动的电影，整个气管纤毛上皮表面的纤毛产生的流量（ 电影2）允许后定量。

5。定量纤毛运动

1. 负载DIC成像ImageJ软件程序包，由I所描述的技术的电影转换成泉德拉蒙德¹³使用直线工具绘制光栅线穿越跳动的纤毛。 A“”这条线重新划分产生kymograph的跨线的纤毛运动产生波浪纹型图像。每个波峰之间的像素数是他们测量（一个像素的=一部电影帧），然后可以计算每分钟节拍数（ 即赫兹）。
2. 为了测量纤毛产生的流量负荷荧光珠电影成的ImageJ软件包，并使用的MTrackJ插件¹⁴手动跟踪整个气管上皮细胞表面的荧光珠，并让软件生成钢丝速度和方向性跟踪的每个胎圈。

应小心，当使用荧光珠到量化流作为打浆纤毛的距离，可以强烈地影响测量流量的大小。珠补充运动电影2，这是一个很好的例子。在这个例子中的胎圈打浆纤毛的表面移动速度很快，并显着下降的有孔玻璃珠进一步相差在入浴媒体。为了控制这个问题，应该只收集珠描记在一个固定的距离，在所有样品中的纤毛上皮细胞，以允许正确地进行比较。最后，取得对流体流动的有代表性的数据，有孔玻璃珠应尽可能长的时间的跟踪，我们优选使用用于计算流体流动，覆盖10 +纤毛细胞的胎圈轨道。

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结果

控制呼吸道纤毛应清晰可见，看到击败以协调的方式（ 补充电影1，电影播放放缓至15％的实际时间），纤毛摆动的方向（ 补充电影2，电影播放100％有明显的流实时）。定量的纤毛电影应该产生类似的结果如图3所示。未能收集高速DIC电影使纤毛摆动频率的定量分析（ 图3C），纤毛摆动形状的定性评估，并给出了良好的图象，而荧光珠的跟踪允许?...

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讨论

测量纤毛摆动频率（CBF）是比较容易的使用高倍显微镜的目标和快速的图像采集硬件^13,15，并解释了为什么脑血流量测量形成的基础研究在健康和疾病中的黏液纤毛清除。然而，当脑血流量测量是必不可少的了解黏液纤毛清除，单独测量CBF睫状肌产生的流量和纤毛摆动波形，这两者都是比较难以衡量，往往被忽视的重要性，忽略了潜在的，可能没有相关的脑血流量。例如如何增加脑血流量...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin