JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Özet

Mukosiliyer temizleme fonksiyonu içgörü için önemli hareketli kirpikler fonksiyonunun kantitatif analiz için görüntüleme fare havayolu epitel için bir ex vivo tekniği kurulmuştur. Taze hasat fare trakea trachealis kas ile uzunlamasına kesilir ve cam dipli çanak sığ bir duvarlı odasında monte edilir. Trakea örnek uzunlamasına kıvrılmasına trachealis kas yararlanmak için uzun ekseni boyunca konumlandırılmış. Bu tüm trakea uzunluğu boyunca profil görünümünde siliyer hareket görüntüleme sağlar. 200 kare / sn video kirpikler yendi frekans ve siliyer dalga kantitatif analiz sağlamak için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında floresan boncuk eklenmesiyle, kirpikler üretilen sıvı akışı da belirlenebilir. Protokol süresi odası hazırlanması için 5 dakika ile yaklaşık 30 dakika,, örnek için 5-10 dakika açıklıklımontaj ve videomikroskopi için 10-15 dk.

Giriş

Hava yolu epitel içinde hareketli kirpikler fonksiyon analizi mukosiliyer temizleme ve akciğer sağlığı 1 etkileyebilir genetik ve çevresel faktörlerin ortaya çıkması için deneysel önemlidir. Görüntüleme fare havayolu epitel için geliştirilen basit bir protokol mutant ve nakavt fare modellerinde hava yolu kirpikler motilite sorgulamak için etkili bir yöntem sağlar ve fare trakeal doku diseksiyonu ve yüksek çözünürlüklü videomikroskopi ile hava yolu kirpikler motilite ex vivo görüntüleme sadece temel becerileri gerektirir. Bu protokol heterotaksi 2-5 ile ilişkili konjenital kalp hastalığı olan mutantlar hareketli kirpikler fonksiyonunun hızlı değerlendirme (kirpikler yendi frekans, kirpikler yendi şekli, kirpikler oluşturulan akış) izin vermek için büyük çaplı bir fare mutagenez ekran sırasında kurulan ve rafine oldu.

Havayolu kirpikler hareketliliği incelemek için kullanılan mevcut tekniklerin akut ex vivo türü veya boylam ya toplanabilirin vitro deneysel yaklaşımlar ger terim. Akut deneyler ex vivo insan burun / hava yolu fırça biyopsi görselleştirme 6,7 ve basit enine havayolu bölüm 8 analizini içerir. In vitro yaklaşımlar, hava sıvı arayüzü kültürler ya da hava yolu süspansiyon kültürleri 9-11 gibi farklı siliyalı epitel yaprak oluşturmak için çeşitli hücre kültürü teknikleri kullanmaktadır. Herhangi bir kullanılabilir siliyalı epitel hücreleri deney (4-6 hafta 9,10) için üretilen önce Ancak, bu hava yolu epitel reciliation teknikleri zaman ve eğitim çok önemli bir yatırım gerektirir. Solunum yolu epitel fırça biyopsilerin akut ex vivo analiz yaygın insan klinik çalışmalar için kullanılır, bu yöntem şiddetlenir mekanik doku yaralanması 12 bağlı fare çalışmalarda kullanılabilir değildir.

Mutabakatnamelere analizi için bu protokolde belirtilen tekniğiE trakea hava yolu epitel çalıştırmak için sadece basit değildir, ama özel bir diseksiyon becerileri ne videomikroskopi tarafından görüntüleme için bu standart dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu protokol için pek çok avantajı vardır. Fare trakea doku hasat gerçekleştirmek için hızlı ve kolay olduğu gibi, önce, farelerin, çok sayıda hava yolu kirpikler fonksiyonu hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için izin verir. Bu in vitro tedavi farklı kısa vadeli etkileri akut analizi içerebilir. İkinci olarak, bir ex vivo tekniği olan, siliyalı hava yolu epitel bu destek dokularını altta yatan bağlı kalır ve böylece ilgili hücre sinyal yolları korumak. Bu nedenle in vitro reciliated solunum yolu epitel hücrelerinde ile karşılaştırıldığında, bu hazırlık vivo doku ortamda doğal daha iyi bir temsilidir. Üçüncü olarak, bu protokol sağlayan hareketli kirpikler f değerlendirilmesini sağlar farklı kantitatif bir dizi parametre edinimimerhem. Son olarak, havayolu kirpikler görselleştirme için diğer mevcut yöntemlerle aksine, bu protokol kirpikler yendi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve metachronal dalga üretimi için en uygun olan kirpikler Profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler görselleştirme sağlar .

Bu protokol, farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya hava yolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / bakım gibi mukus yük gibi mekanik faktörlerin rolü deneysel ihtiyaçlarını geniş bir yelpazede ele yolları bir dizi değiştirilebilir havayolu kirpikler yendi ve metachronal dalga yayılımı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Reaktifler Kurulum

1.1 Diseksiyon ve Görüntüleme Orta

Leibovitz L-15 ortamına (L15) trakea örneklerin hasat hem de görüntüleme sırasında kullanılan FBS (% 10) ve Penisilin-Streptomisin (100 birim / penisilin G sodyum ve streptomisin sülfat, 100 mg / ml arasında mi) ile ilave edilir.

2. Sığ Kaleli Kültür Odası Meclis

Trakea doku tutmak için kullanılan haznesi Şekil 1 'de gösterilmiştir. Odanın zemini cam 35 mm kültür çanak dip olduğunu. Odasının üst ve yan cam tabak içinde 0.3 mm kalınlığında silikon kaplama küçük bir parça yerleştirilerek oluşturulur. Sayfanın kenarı yuvarlak alt çanak uyacak şekilde kesilir ve merkez daha (adım 2.1-2.3 bakınız) sığ bir merkezi oda oluşturmak için kesilir. Bu montaj üzerine, bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma görüntüleme için uygun bir kapalı odasına oluşturmak için yerleştirilir.

  1. Tamamen 0,3 mm kalınlığında silikon kaplama bir kare ile bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma kapsamaktadır.
  2. Standart keskin diseksiyon makas kapak kayma (silikon kaplama dairesel bir tabaka ile sonuçlanan) kenarında gelen aşırı silikon kaplama keserek ile.
  3. Keskin bir neşter kesip ve kapalı kapak kayma (böylece görüntüleme odasının üst ve yan oluşturan) ortasından silikon kaplama (yaklaşık 10 mm kare) merkezi bir kare kaldırmak ile.

3. Trakea Hasat ve Hazırlık

  1. Yerel kurumsal hayvan bakımı uygun olarak fareler Euthanize ve komite ve / veya hükümet yönergeleri izleyin ve batığın doku kadar L15 medya (yazar kadar, sadece gebelik gün 16,5 doğum önce fareler kullanmış olan standart bir plastik 35 mm kültür çanak içine trakea çıkarın , yeni doğan yenidoğan ve yetişkin hayvanların 2).
  2. Dış bağlı olmayan trakea ilişkili doku çıkarmakkünt diseksiyon kullanarak trakea.
  3. Sadece mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 1) kullanarak krikoid kıkırdak altında enine kesim ile gırtlak çıkarın.
  4. Mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 2) ile sadece karina üzerinde enine kesim ile sol ve sağ ana bronş dalları çıkarın.
  5. Yavaşça ince forseps ile trakea tutun ve herhangi bir mukus ve kan temizlemek için bir P1000 Pipetman ve P1000 ucu ile banyo L15 orta ~ 1 ml lümen 2-3 kez yıkayın.
  6. Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 1) ile enine bir kesik ile trakea bir 3-4 halka kesimi kesin.
  7. Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 2) kullanarak bu kısa trakea segmentinin trachealis kas ortasından uzunlamasına kesin.
  8. Mikro diseksiyon makas (Şekil 2C kullanarak trakea kıkırdak halkaları ortasından uzunlamasına kesilir Şekil 2B'de gösterildiği gibi) terk>, çizgi).

4. Kirpikler Görüntüleme

  1. Transferi trakea doku parçaları, L-15 orta 100-200 ul ile 35 mm cam alt kültür çanak ortasında üzerine aşağı lümen tarafı,.
  2. Kirpikler oluşturulan akış trakea doku örneği (1 x 10 ~ 11 partikül / ml ya da 2.5% sulu Fluoresbrite Mikro-kürecik süspansiyonu, 20 ul / ml), yıkanan L-15 ortamına floresan 0.20 um arasında bir miktar mikro eklemek ölçmek için kullanılabilir.
  3. Silikon kaplama oyulmuş pencere oluşturduğu sığ duvarlı odanın ortasında bulunan trakea örnek ile, görüntüleme odasının aşağı trakea örnek silikon levha tarafında üzerine (yukarıda 1-3 Usul bakınız) önceden hazırlanmış yerleştirin (Şekil 1 .)
  4. Yavaşça yerine sabitlemek için lamel aşağı doğru itin ve kenarları istimal emdiği L-15 ortamı çıkarınga P1000 ucu ve P1000 Pipetman.
  5. 100X objektif ve DIC optik ile bir ters mikroskop 35 mm cam alt kültür çanak ve trakea örnek monte edin.
  6. Yüksek hızlı bir kamera ve film satın alma yazılımı kullanarak 200 kirpikler motilite film toplamak + en siliyalı trakeal epitel boyunca saniye başına kare (Şekil 2D kutusu, E Outlined: Kayıtlı filmden örnek hareketsiz görüntü) trachealis kas kenarı kıvrılmış (Ek Film 1).
  7. FITC epifluorescent görüntüleme ve düşük ışık CCD kamera (Yukarıdaki donanım listesine bakın) kullanarak, kirpikler oluşturulan akış (Ek Movie 2) daha sonra miktar izin vermek için siliyalı trakeal epitel yüzeyi boyunca floresan mikro-hareketin film toplamak.

5. Cilia Motilite kantitasyonu

  1. ImageJ yazılım paketi içine DIC görüntülü film yüklemek ve I tarafından tarif edilen teknik takip edilmekain Drummond 13 yenerek kirpikler geçen bir raster çizgi çizmek için satırı aracını kullanın. Bu hattın bir "reslice" hat boyunca kirpikler hareketi bir dalga üreten bir kymograph tipi görüntü oluşturur. Her dalga tepe arasındaki piksel sayısı onları ölçülen (bir piksel = bir film karesini) dakikada atım (yani Hz) sayısı hesaplanabilir hangi değil.
  2. ImageJ yazılım paketi içine kirpikler oluşturulan akış yük floresan boncuk film ölçmek ve el trakea epitel yüzeyi boyunca floresan boncuk izlemek ve yazılım izlenen her boncuk için boncuk hız ve yön oluşturmak izin MTrackJ eklenti 14 kullanın.

Dayak kirpikler mesafe olarak akışını ölçmek için güçlü ölçülen akış büyüklüğü etkileyebilir floresan boncuk kullanırken dikkat edilmelidir. Ek Film 2 boncuk hareketi bu bir iyi bir örnektir. Bu örnekte boncuktahareket dayak kirpikler yüzeyinde hızlı ve önemli ölçüde daha uzakta banyo medyada boncuk için devre dışı bırakır. Bu kontrol etmek için, boncuk iz tek doğru karşılaştırma yapılmasına izin vermek için bütün örneklerde silli epitel üzerinde sabit bir mesafede toplanmalıdır. Son olarak, sıvı akışı temsil verilerini elde etmek, boncuk mümkün olduğunca uzun süre için takip edilmelidir, biz sıvı akışı hesaplamak için 10 + siliyalı hücreleri kapsayacak boncuk parça kullanmayı tercih.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Film oynatma% 100; kirpikler yendi (Ek Film 2 yönünde fark akışı ile; Kontrol havayolu kirpikler açıkça görülebilir ve koordineli bir şekilde (film oynatma 15% gerçek zamanlı için yavaşlar Ek Film 1) yenmek için görülen olmalıdır ) gerçek zamanlı. Kirpikler film kantitasyonu, Şekil 3'te görülen benzer sonuçlar vermesi gerekir. Floresan boncuk izleme kirpikler oluşturulan akış hızı ölçümü (Şekil 3D) sağlar ise yü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kirpikler yendi frekans ölçümü (CBF) yüksek güç mikroskobu amaç ve hızlı görüntü elde etme donanım 13,15 kullanarak nispeten kolaydır, ve CBF ölçümleri sağlık ve hastalık sırasında mukosiliyer klerens araştıran en çalışmaların temelini oluşturan açıklıyor. CBF ölçüm tek başına CBF mukosiliyer temizleme, ölçüm anlamak için gereklidir Ancak, siliyer oluşturulan akış ve ölçmek için daha zor genellikle göz ardı edilir, her ikisi de kirpikler yendi dalga, hem de te...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Proje, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH hibe U01HL098180 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kalp, Akciğer resmi görüşlerini temsil etmez, ve Kan Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 Medium Invitrogen21083-027No phenol red
Fetal bovine serum HycloneSH30088.03
Penicillin-Streptomycin Invitrogen15140-122
2x fine forceps RobozRS-4976
Dissection scissors RobozRS-5676
Micro dissection scissors RobozRS-5620
Scalpel RobozRS-9801-15
P1000 pipetman Gilson, IncF123602
P1000 tips Molecular BioProducts2079E
18 mm round glass cover slips Fisher Scientific430588
Plastic 35 mm culture dishes Corning430588
Glass bottom 35 mm culture dishes Warner InstrumentsW3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick AAA Acme Rubber CoCASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres Polysciences09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters LeciaDMIRE2Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filtersLeciaBrand is not critical.
Microscope stage IncubatorLecia11521749Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field Vision ResearchPhantom v4.2Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera HamamatsuC9100-12Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis softwareNational Institutes of HealthImageJ with MtrackJ plugin

Referanslar

  1. Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
  2. Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
  3. Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
  4. Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
  5. Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
  6. Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
  7. Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
  8. Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
  9. Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
  10. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
  11. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
  12. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
  13. Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  15. Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
  16. Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
  17. Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
  18. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyomedikal M hendisli iSay 78Geli im BiyolojisiH cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiAnatomiFizyolojiSolunum MukozaTrakeaSilier Motilite BozukluklarHayvan DeneyMikroskopiFloresanGiri imPolarizasyonVideoHavayolumukosiliyer klerensmikroskopihayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır