Ex méthode in vivo pour l'imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires

Résumé

Une technique simple et fiable pour la visualisation et quantification des voies respiratoires motilité des cils et cils de flux générés en utilisant la souris trachée est décrite. Cette technique peut être modifiée pour déterminer comment un grand nombre de facteurs influencent la motilité des cils, y compris les agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus.

Résumé

Une technique ex vivo pour l'imagerie souris épithélium des voies respiratoires pour l'analyse quantitative de la fonction de cils mobiles importante pour comprendre la fonction de la clairance mucociliaire a été établi. Fraîchement récoltées souris trachée est coupé longitudinalement à travers le muscle trachéal et monté dans une chambre fortifiée peu profonde sur un plat à fond de verre. L'échantillon trachée est positionné le long de son axe pour tirer profit du muscle trachéal à se recourber longitudinalement. Cela permet à l'imagerie du mouvement ciliaire dans la vue de profil sur toute la longueur trachéale. Vidéos à 200 images / sec sont obtenus en utilisant l'interférence différentiel microscopie en contraste et une caméra numérique à haute vitesse pour permettre une analyse quantitative de la fréquence de battement des cils et forme d'onde ciliaire. Avec l'ajout de billes fluorescentes lors de l'imagerie, les cils écoulement de fluide générée peut également être déterminé. Le temps de protocole couvre environ 30 min, à 5 min de préparation chambre, 5-10 min pour l'échantillonmontage et 10-15 min pour vidéomicroscopie.

Introduction

Analyse de la fonction de cils mobiles dans l'épithélium des voies respiratoires est expérimentalement importantes pour comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter la clairance muco-ciliaire et la santé pulmonaire ^1. Le protocole simple mis au point pour l'imagerie de la souris épithélium des voies respiratoires constitue une méthode efficace pour interroger voies cils motilité des modèles mutants et KO souris et ne nécessitent que des compétences de base chez la souris dissection du tissu trachéal et l'imagerie ex vivo des voies respiratoires cils motilité avec vidéo-microscopie à haute résolution. Ce protocole a été établi et perfectionné au cours d'un écran de mutagenèse souris à grande échelle pour permettre une évaluation rapide de la fonction de cils mobiles (fréquence de battement de cils, la forme de battement de cils, cils flow généré) dans des mutants présentant une cardiopathie congénitale associée à hétérotaxie ^2-5.

Les techniques actuelles utilisées pour étudier la motilité des cils des voies aériennes peuvent être regroupées en deux l'ancien type vivo ou lon aiguëger terme dans les approches expérimentales in vitro. Expériences aigus comprennent visualisation ex vivo de nasales / voies aériennes biopsies humaines brosse ^6,7 et une analyse des sections transversales des voies respiratoires simples ^8. Les approches in vitro utilisent diverses techniques de culture cellulaire pour générer des feuilles de l'épithélium cilié différenciée comme dans les cultures de l'interface air liquide ou respiratoires cultures de suspension ^9-11. Cependant, ces techniques de reciliation épithélium des voies respiratoires nécessitent des investissements très importants en temps et en formation avant les cellules épithéliales ciliées utilisables sont produites pour l'expérimentation (4-6 semaines ^9,10). Bien que l'analyse ex vivo aiguë des voies respiratoires biopsies de pinceau épithéliales sont couramment utilisées pour les études cliniques chez l'homme, cette méthode n'est pas utilisable dans les études de souris dues à une lésion tissulaire mécanique exacerbée ^12.

La technique décrite dans ce protocole pour l'analyse des protocoles d'ententee trachéale épithélium des voies respiratoires n'est pas seulement simple à réaliser, mais il ne nécessite pas de compétences particulières de dissection, ni aucun équipement spécialisé en dehors de celles norme d'imagerie par vidéo-microscopie. Il ya de nombreux avantages à ce protocole très simple. Tout d'abord, comme la récolte de tissus trachée de la souris est rapide et facile à réaliser, il permet une évaluation rapide de la fonction des cils des voies aériennes dans un grand nombre de souris. Cela peut inclure une analyse aiguë des effets à court terme des différents traitements in vitro. D'autre part, étant une technique ex vivo, l'épithélium respiratoire cilié reste attaché à elle sous-jacent tissus de soutien et de conserver ainsi les voies de signalisation cellulaire associées. Par conséquent, en comparaison avec in vitro reciliated épithélium des voies respiratoires, cette préparation est une meilleure représentation de la nature dans un environnement de tissus in vivo. Troisièmement, ce protocole permet l'acquisition d'un certain nombre de paramètres quantitatifs qui peuvent fournir une évaluation objective de la motilité ciliaire fonction. Enfin, contrairement à d'autres méthodes actuelles de voies cils visualisation, ce protocole permet de visualiser des cils perpendiculairement à la direction de battement de cils, ce qui permet la vue de profil des cils qui est optimale pour l'imagerie à haute résolution de battement de cils et de génération d'ondes metachronal .

Ce protocole peut être modifié dans un certain nombre de façons d'aborder un large éventail de besoins expérimentaux tels que le rôle des agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus sur la fonction des cils des voies respiratoires et de la production / maintenance de voies respiratoires battement de cils et de la propagation des ondes metachronal.

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Protocole

1. Réactifs Setup

1.1 Dissection et l'imagerie moyen

L-15 du milieu de Leibovitz (L15) est complété avec du FBS (10%) et pénicilline-streptomycine (100 unités / ml de pénicilline G sodique et 100 pg / ml de sulfate de streptomycine) est utilisé à la fois pendant la récolte et de l'imagerie d'échantillons trachée.

2. Shallow fortifiée hémicycle de la culture

La chambre utilisée pour maintenir le tissu trachée est illustré à la figure 1. Le sol de la chambre est le fond de verre 35 mm boîte de culture. Le haut et le côté de la chambre est généré en plaçant un petit morceau de 0,3 mm feuilles de silicone épaisse sur le plat en verre. Le bord de la feuille est coupée pour s'adapter à la coupelle à fond rond et le centre est en outre découpé pour former une chambre centrale peu profonde (voir les étapes 2.1 à 2.3). Au sommet de cette assemblée, une lamelle de verre ronde de 18 mm est placé à générer une enceinte appropriée pour l'imagerie.

1. Recouvrir complètement un mm en verre ronde glissement 18 de couverture avec un carré de 0,3 mm feuilles de silicone épais.
2. Avec des ciseaux de dissection standards couper les feuilles de silicone excès de partout dans le bord de la lamelle (résultant en une couche circulaire de feuilles de silicone).
3. Avec un scalpel découper et enlever une place centrale de feuilles de silicone (environ 10 mm de côté) à partir du milieu de la lamelle couvert (formant ainsi le dessus et les côtés de la chambre d'imagerie).

3. Trachée récolte et préparation

1. Euthanasier les souris en conformité avec les soins aux animaux institutionnelles locales et utiliser comité et / ou les directives gouvernementales et enlever la trachée en plastique 35 mm boîte de culture standard avec suffisamment L15 médias au tissu de plonger (auteurs ont utilisé des souris juste avant la naissance au jour de gestation 16.5, par le biais de animaux nouveau-nés, néonatale et adulte ^2).
2. Enlever le tissu non associé trachée fixé à l'extérieur dela trachée en utilisant dissection.
3. Retirez le larynx avec une coupe transversale juste au-dessous du cartilage cricoïde l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 1).
4. Retirez les branches bronchiques primaires à gauche et à droite avec une coupe transversale juste au-dessus de la carène avec des micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 2).
5. Tenir délicatement la trachée avec une pince fine et rincer la lumière 2-3 fois avec environ 1 ml du milieu L15 de bain avec un P1000 et P1000 Pipteman pointe pour dégager le mucus et du sang.
6. Découpez un segment d'anneau 3-4 de la trachée avec une coupe transversale avec micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 1).
7. Couper longitudinalement à travers le milieu du muscle trachéal de ce segment trachée court l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 2).
8. Couper longitudinalement au milieu des anneaux de cartilage trachéal l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2C , ligne), laissant deux morceaux de tissu trachée adapté pour l'imagerie (section unique montre la figure 2D).

4. Imagerie par Cilia

1. Transfert segments de tissu trachée, côté lumière vers le bas, sur le milieu d'un mm à fond de verre plat 35 de culture avec 100-200 pi de milieu L-15.
2. Pour quantifier les cils flux généré ajouter une petite quantité de fluorescence 0,20 um microsphères dans le milieu L-15 baignant l'échantillon de tissu trachée (~ 1 x 10 ¹¹ particules / ml ou de 20 ul / ml de la suspension à 2,5% de microsphères aqueuse Fluoresbrite).
3. Placer la chambre d'imagerie préparé précédemment (voir procédure 3.1 ci-dessus) au-dessus de l'échantillon côté de la feuille de silicone trachée vers le bas, avec l'échantillon trachée située au milieu de la chambre à paroi peu profonde formée par la fenêtre découpée dans la feuille de silicone (Figure 1 ).
4. Appuyez doucement sur la lamelle pour sécuriser en place et enlever l'excédent L-15 médias de l'usin bordsga P1000 et P1000 pointe Pipetman.
5. Monter le fond de verre plat de culture de 35 mm et un échantillon de trachée sur un microscope inversé avec optique 100X objectifs et DIC.
6. En utilisant une caméra à haute vitesse et le logiciel d'acquisition de film recueillir films de la motilité des cils à 200 + images par seconde le long de l'épithélium trachéal ciliées de l'recroquevillés bord du muscle trachéal (figure 2D Décrit boîte, E: par exemple image fixe de vidéo enregistrée) (Film supplémentaire 1).
7. En utilisant l'imagerie à fluorescence FITC et une caméra CCD bas de lumière (voir la liste des équipements ci-dessus), rassembler films de mouvement de microsphères fluorescentes à travers la surface de l'épithélium trachéal ciliée pour permettre la quantification des cils plus tard flux généré (Movie supplémentaire 2).

5. La quantification de la motilité Cilia

1. Chargez films imagés DIC dans le logiciel ImageJ et suivant la technique décrite par Iain Drummond ¹³ utiliser l'outil Ligne pour tracer une ligne de trame traversant les cils battant. Un "retrancher" de cette ligne génère une image du type à kymographe où le mouvement des cils sur la ligne génère un motif d'onde. Le nombre de pixels entre chaque crête de l'onde est leur mesurés (un pixel = une séquence vidéo) à partir de laquelle le nombre de battements par minute (soit Hz) peut alors être calculée.
2. Pour mesurer les cils ont généré des flux de charge films perles fluorescentes dans le logiciel ImageJ, et utiliser le plugin MTrackJ ¹⁴ pour suivre manuellement billes fluorescentes sur la surface de l'épithélium de la trachée et de laisser le logiciel génère vitesse perle et la directivité pour chaque perle suivi.

Des précautions doivent être prises lors de l'utilisation des billes fluorescentes pour quantifier le débit comme la distance entre les cils battant peut fortement influencer l'ampleur du débit mesuré. Le mouvement bourrelet supplémentaire Movie 2 est un bon exemple de cela. Dans cet exemple perlele mouvement est rapide à la surface des cils battant et diminue considérablement hors de perles plus loin dans les médias de bain. Pour contrôler cela, tracés de perles ne devraient être collectées à une distance fixe au-dessus de l'épithélium cilié dans tous les échantillons pour permettre des comparaisons appropriées à prendre. Enfin, pour obtenir des données représentatives sur l'écoulement du fluide, perles devraient être suivis aussi longtemps que possible, nous préférons utiliser des pistes de perles qui couvrent les cellules ciliées 10 + pour le calcul de l'écoulement du fluide.

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Résultats

Contrôle des voies aériennes cils doit être clairement visible et vu à battre de manière coordonnée (Film 1 supplémentaire; la lecture du film est ralentie à 15% en temps réel), avec un débit notable dans le sens du battement de cils (Film complémentaire 2; la lecture du film est de 100% temps réel). La quantification des films de cils devrait donner des résultats similaires à ceux observés dans la figure 3. Collection de films DIC à grande vitesse perme...

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Discussion

Mesure de la fréquence de battement des cils (CBF) est relativement facile en utilisant objectifs de microscope haute puissance et l'image matériel d'acquisition rapide ^13,15, et explique pourquoi les mesures CBF forment la base de la plupart des études portant sur ​​la clairance mucociliaire pendant la santé et la maladie. Cependant, alors que la mesure CBF est essentielle pour comprendre clairance muco-ciliaire, la mesure de CBF seul ignore l'importance fondamentale des deux flux génér...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin