Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

Zusammenfassung

Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.

Zusammenfassung

Ex-vivo-Imaging-Technik für Maus Atemwegsepithelien für die quantitative Analyse von beweglichen Zilien Funktion wichtig für Einblick in mukoziliäre Clearance-Funktion wurde eingerichtet. Frisch geerntete Maus Luftröhre wird in Längsrichtung durch den trachealis Muskel geschnitten und in einer flachen ummauerten Kammer auf einem Glasboden-Gericht. Die Luftröhre Probe wird entlang seiner Längsachse positioniert, um von der trachealis in Längsrichtung gewellt nehmen. Dies ermöglicht die Abbildung von Flimmerbewegung im Profil entlang der gesamten Länge Luftröhre. Videos mit 200 Bildern / sec werden unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera der quantitativen Analyse der Cilienschlag Frequenz und Wellenform ciliary ermöglichen. Mit dem Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen während der Bildgebung, Zilien erzeugten Fluidstroms bestimmt werden kann. Das Protokoll Zeit erstreckt sich über etwa 30 min mit 5 min für Kammer Vorbereitung, 5-10 min für ProbeMontage und 10-15 min für Videomikroskopie.

Einleitung

Analyse von beweglichen Zilien Funktion im Atemwegsepithelien ist experimentell wichtig für die Aufklärung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die mukoziliäre Clearance und pulmonale Gesundheit ¹ beeinflussen können. Das einfache Protokoll für die Bildgebung der Maus Atemwegsepithelien entwickelt bietet eine effiziente Methode, um Atemwege Zilien Motilität in Mutanten und Knockout Mausmodelle verhören und erfordern nur Grundkenntnisse in Maus Luftröhrengewebe Dissektion und ex-vivo-Bildgebung der Atemwege Zilien Motilität mit hoher Auflösung Videomikroskopie. Dieses Protokoll wurde gegründet und während eines großen Maus Mutagenese Bildschirm verfeinert, um eine schnelle Auswertung der beweglichen Zilien Funktion (Zilien Überlagerungsfrequenz, Cilienschlag Form, Zilien erzeugte Strömung) in Mutanten mit angeborenen Herzfehlern mit Heterotaxie ^2-5 ausgesetzt sind.

Aktuelle Techniken zur Atemwege Zilien Motilität studieren kann entweder in der akuten ex vivo-Typ oder lon gruppiert werdenger Begriff in vitro experimentelle Ansätze. Akute Experimente umfassen ex vivo Visualisierung der menschlichen Nase / Atemwege Pinsel Biopsien ^6,7 und Analyse einfacher quer Atemwege Abschnitte ^8. Die in-vitro-Ansätze nutzen verschiedene Techniken, um Zellkultur Blatt differenzierte Flimmerepithelien wie in Luft Grenzfläche Kulturen oder Atemwege Suspensionskulturen ^9-11 erzeugen. Jedoch erfordern diese Atemwegsepithelien reciliation Techniken sehr bedeutende Investition in Zeit und Training, bevor irgendwelche brauchbaren Flimmerepithelzellen zum Experimentieren (4-6 Wochen ^9,10) hergestellt werden. Während akute ex vivo Analyse der Atemwegsepithelzellen Pinsel Biopsien häufig für klinische Studien am Menschen verwendet werden, ist diese Methode nicht verwendbar in Mäusestudien aufgrund verschärft mechanische Gewebeschädigung ^12.

Die Technik in diesem Protokoll für die Analyse von mous skizziertene tracheal Atemwegsepithelien ist nicht nur einfach auszuführen, aber es erfordert keine speziellen Fähigkeiten Dissektion noch irgendeine spezielle Ausrüstung außer denjenigen Standard für die Bildgebung von Videomikroskopie. Es gibt viele Vorteile dieser einfachen Protokoll. Zunächst wird, wie die Maus Luftröhre Gewebe Ernte ist schnell und einfach durchzuführen, ermöglicht es eine schnelle Beurteilung der Atemwege Cilien-Funktion in einer großen Anzahl von Mäusen. Dazu kann auch scharfsinnige Analyse der kurzfristigen Auswirkungen der verschiedenen in vitro-Behandlungen. Zweitens ist eine Ex-vivo-Technik bleibt die ciliated Atemwegsepithel attached to it zugrunde Stützgewebe und behalten somit verbundenen Zelle Signalwege. Daher im Vergleich zu in vitro reciliated Atemwegsepithelien, ist dieses Präparat eine bessere Darstellung des natürlichen Gewebe in vivo Umgebung. Drittens erlaubt das Protokoll der Erwerb einer Reihe von verschiedenen quantitativen Parameter, die die objektive Beurteilung der beweglichen Zilien f liefern kannSalbung. Schließlich, im Gegensatz zu anderen aktuellen Methoden zur Sicherung der Atemwege Zilien Visualisierung, ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung der Flimmerhärchen im rechten Winkel zu der Cilienschlag Richtung, so dass Profilansicht der Zilien, die optimal für hochauflösende Bildgebung von Cilienschlag und metachronal Welle Generation .

Dieses Protokoll kann in einer Reihe von Möglichkeiten, um eine breite Palette von experimentellen Anforderungen wie die Rolle von pharmakologischen Mitteln, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und / oder mechanische Faktoren wie Schleim Belastung der Atemwege Cilien-Funktion und Erzeugung / Wartung adressieren geändert werden Atemwege Cilienschlag und metachronal Wellenausbreitung.

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Protokoll

1. Reagenzien-Setup

1.1 Dissection und Imaging Medium

Leibovitz L-15-Medium (L15) mit FBS (10%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin G-Natrium und 100 ug / ml Streptomycin Sulfat) ergänzt wird sowohl während der Ernte und Abbildung Luftröhre Proben verwendet.

2. Shallow Walled Kultur Chamber Assembly

Die Kammer zur Luftröhre Gewebe halten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Boden der Kammer ist der Glasboden 35 mm Kulturschale. Die obere und die Seite der Kammer wird, indem ein kleines Stück 0,3 mm dicken Silikon Folie über die Glasschale generiert. Der Rand der Platte geschnitten wird, um die runde Bodenschale passen und das Zentrum weiter getrimmt, um eine flache zentrale Kammer zu bilden (siehe Schritte 2.1-2.3). Am Anfang dieser Montage wird ein 18 mm runden Deckglas platziert, um eine geschlossene Kammer für Bildgebung erzeugen.

1. Komplett decken ein 18 mm runden Deckglas mit einem Quadrat von 0,3 mm dicke Folie Silikon.
2. Mit Standard scharfe Sektion Schere überstehendes Silikon Folie aus um den Rand des Deckglases (resultierend in einer kreisförmigen Schicht aus Silikon-Folie).
3. Mit einem scharfen Skalpell ausgeschnitten und Entfernen eines zentralen Platz von Silikon-Folie (ca. 10 mm im Quadrat) von der Mitte der überdachten Deckglas (wodurch die Oberseite und die Seiten des bildgebenden Kammer).

3. Luftröhre Ernte und Vorbereitung

1. Euthanize Mäusen in Übereinstimmung mit den örtlichen Institutionen Tierpflege und verwenden Ausschuss und / oder staatlichen Richtlinien und entfernen Luftröhre in einem Standard-Kunststoff 35 mm Kulturschale mit genug L15 Medien zu versenken Gewebe (Autoren haben Mäuse kurz vor der Geburt bei Trächtigkeitstag 16.5 verwendet, bis hin zu Neugeborenen, Neugeborenen und erwachsenen Tieren ^2).
2. Entfernen nicht-Trachea zugehörigen Gewebe an der Außenseite desdie Luftröhre mit stumpfen Dissektion.
3. Entfernen Sie den Kehlkopf mit einem Schnitt quer unterhalb des Ringknorpels mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 1).
4. Entfernen Sie die linke und rechte primäre bronchiale Äste mit einem Schnitt quer oberhalb der Carina mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 2).
5. Halten Sie das Luftröhre mit feinen Pinzetten und bündig die Lumen 2-3 mal mit ~ 1 ml der Baden L15 Medium mit einem P1000 und P1000 Pipetman Spitze, um Schleim und Blut zu löschen.
6. Schneiden Sie einen Ring 3-4 Segment der Luftröhre mit einem Schnitt quer mit Mikrodissektion Schere (2B, Zeile 1).
7. Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte des trachealis Muskel dieser kurzen Luftröhrensegment mit Mikro Schere Dissektion (2B, Zeile 2).
8. Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte der Trachealknorpels Ringe mittels Mikrodissektion Schere (2C , Zeile), so dass zwei Abschnitte der Luftröhre Gewebe geeignet zur Bildgebung (einzigen Abschnitt in 2D gezeigt).

4. Cilia Imaging

1. Übertragen Luftröhre Gewebe Segmenten Lumen unten, auf der Mitte eines 35 mm Glasboden Kulturschale mit 100-200 ul L-15-Medium.
2. Zur Quantifizierung Zilien generierte Strom eine geringe Menge von 0,20 um fluoreszierenden Mikrosphären auf den L-15-Medium baden die Luftröhre Gewebeprobe (~ 1 x 10 ¹¹ Partikel / ml oder 20 ul / ml des Fluoresbrite 2,5% wässrige Mikrokugel-Suspension).
3. Legen Sie die Imaging-Kammer zuvor (siehe Vorgehensweise 1-3 oben) auf der Oberseite der Luftröhre Probe Silikon-Blatt nach unten vorbereitet, mit der Luftröhre Probe in der Mitte des flachen ummauerten Kammer durch das Fenster in die Silikon-Folie geschnitten gebildeten (Abbildung 1 ).
4. Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um im Platz zu sichern und entfernen Sie überschüssiges L-15 Medien aus dem Kanten usinga P1000 und P1000 Pipetman Spitze.
5. Montieren Sie das 35 mm Glasboden Kulturschale und Luftröhre Probe auf einem inversen Mikroskop mit 100x-Objektiv und DIC-Optik.
6. Mit einem High-Speed-Kamera und Film-Erfassungs-Software sammeln Filme von Zilien Motilität bei 200 + Frames pro Sekunde entlang der Luftröhre ciliated Epithelien der zusammengerollt Rand des trachealis Muskel (Abbildung 2D eingerahmten Feld, E: Beispiel Standbild aus aufgezeichneten Film) (Supplementary Film 1).
7. Mit FITC epifluoreszenten Bildgebung und ein wenig Licht CCD-Kamera (siehe Ausstattungsliste oben), sammeln Filme von fluoreszierenden Mikrokügelchen Bewegung über die Oberfläche des ciliated trachealen Epithel später Quantifizierung der Zilien erzeugte Strömung (Ergänzende Movie 2) zu ermöglichen.

5. Quantifizierung von Cilia Motilität

1. Legen DIC abgebildeten Filme in der ImageJ Software-Paket und im Anschluss an die Technik, die von I beschriebenain Drummond ¹³ verwenden Sie die Zeile Werkzeug, um ein Raster-Linie über den Wimpern schlagen zu ziehen. A "reslice" dieser Linie erzeugt eine Art Bild kymograph wo Zilien Bewegung über die Linie erzeugt ein Wellenmuster. Die Anzahl der Pixel zwischen jedem Wellenberg ist sie gemessen (ein Pixel = ein Film-Frame), aus denen die Anzahl der Schläge pro Minute (dh Hz) kann dann berechnet werden.
2. Um Zilien erzeugte Strömung Last fluoreszierenden Kügelchen Filme in der ImageJ Software-Paket zu messen, und verwenden Sie das Plugin MTrackJ ¹⁴ manuell verfolgen fluoreszierende Kügelchen über die Oberfläche der Luftröhre Epithelien und lassen Sie die Software erzeugen Wulst Geschwindigkeit und Ausrichtung für jede Perle verfolgt.

Es sollte darauf geachtet bei der Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen zu fließen wie der Abstand von dem schlagenden Cilien quantifizieren stark beeinflussen können gemessenen Flußbetrags werden. Der Wulst Bewegung in Supplemental Movie 2 ist ein gutes Beispiel dafür. In diesem Beispiel WulstBewegung an der Oberfläche des schlagenden Cilien schnell und deutlich fällt für Perlen weiter weg in den baden-Medien. Um dies zu kontrollieren, sollte Wulst Kurven nur in einem festen Abstand über der Flimmerepithelien in allen Proben gesammelt werden, damit die korrekte Vergleich möglich ist. Schließlich, um repräsentative Daten über Strömung zu erhalten, sollte Perlen für so lange wie möglich verfolgt werden; wir lieber zu Wulst Tracks, 10 + Flimmerzellen decken zur Berechnung Strömung verwenden.

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Ergebnisse

Steuerung Atemwege Zilien muss deutlich sichtbar sein und gesehen in einer koordinierten Art und Weise (Supplemental Film 1; Filmwiedergabe auf 15% verlangsamt Echtzeit) zu schlagen, mit spürbarer Strömung in Richtung der Zilien schlagen (Supplemental Movie 2; Filmwiedergabe ist 100% real time). Die Quantifizierung der Zilien Filme sollten zu Ergebnissen führen ähnlich wie in Abbildung 3 zu sehen. Sammlung von High-Speed-DIC Filme ermöglicht die Quantifizierung der...

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Diskussion

Messung der Zilien Überlagerungsfrequenz (CBF) ist relativ einfach mit hoher Leistung Mikroskop-Objektive und schnelle Bildaufnahme Hardware ^13,15, und erklärt, warum CBF-Messungen die Grundlage der meisten Studien untersuchen mukoziliäre Clearance bei Gesundheit und Krankheit bilden. Doch während CBF-Messung ist für das Verständnis mukoziliäre Clearance, Messung der CBF allein wesentlichen ignoriert die zugrunde liegende Bedeutung sowohl ciliary erzeugt Strom und Cilienschlag Wellenform, die beide meh...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin