5/6th联合切除术，高盐饮食和一氧化氮合酶抑制剂诱导Lewis大鼠慢性肾脏病

摘要

两阶段方法建立Lewis大鼠慢性肾脏病（CKD），通过手术取出肾质量5/6th描述。结合的外科手术过程中，一氧化氮合酶抑制和高盐饮食导致类似人类的CKD的模型，允许因果机制的研究和发展新的治疗干预。

摘要

慢性肾脏病（CKD）是一个全球性的问题。 CKD进展缓慢是一个主要的健康优先。由于慢性肾脏病的特点是复杂的动态平衡紊乱，综合性的动物模型是必需的研究开发和CKD恶化。要研究开发在CKD CKD和新的治疗干预，使用5/6th切除术，消融模型，一个众所周知的实验模型，进行性肾疾病，类似人类CKD的几个方面。肾质量的毛利减少，导致渐进性肾小球和肾小管间质损伤，损失残肾和发展的系统性和肾小球内高压。它也与渐进肾内毛细管损失，炎症和肾小球硬化。 CKD总是危险因素对血管内皮功能的影响。为了模仿这一点，我们结合5/6th去除肾质量与一氧化氮（NO）的枯竭和高盐饮食。抵达和驯化后，动物重新ceive一氧化氮合酶抑制剂（NG-硝基-L-精氨酸）（L-NNA）补充饮用水（20毫克/升），一个为期4周，随后右侧单侧肾切除。一个星期后，一个肾切除（SNX）的左侧。 SNX后，动物被允许恢复两天LNNA饮用水中（20毫克/升）为进一步为期4周其次。高盐饮食（6％），辅以地面州城（见时间线图1），继续在整个实验过程。通过测量血浆尿素，收缩压和蛋白尿，肾功能衰竭的进度之后随着时间的推移。通过SNX 6周后，肾功能衰竭发展。使用'黄金标准'菊粉和对氨基马尿酸（PAH）的间隙技术测定肾功能。这种模式的特点是CKD的减少，肾小球滤过率（GFR）和有效肾血浆流量（ERPF），高血压（收缩压> 150毫米汞柱），蛋白尿（> 50毫克小时）和轻度尿毒症（> 10毫米）。组织学特征包括炎症，肾小管萎缩，纤维化和局灶性肾小球硬化，导致残余人口健康肾小球内大量减少（<10％）反映了肾小管间质损害。后续SNX显示，直到12周后进一步CKD恶化。

引言

由于CKD的先进性，随后终末期肾脏疾病及相关心血管疾病的发病率和死亡率，是一个日益严重的公共卫生^问题 。 CKD进展缓慢是一个主要的健康优先。由于慢性肾脏病的特点是复杂的动态平衡紊乱，综合性的动物模型是必需的研究开发和CKD恶化。肾脏由范围广泛的不同类型的细胞，彼此交互。这种复杂性，不能在体外模仿。

要研究新的治疗干预CKD中，我们使用的5/6th切除术烧蚀模型，一个著名的实验模型，进行性肾疾病，类似几个方面的人CKD ^2,3。肾质量的毛利减少，导致渐进性肾小球和肾小管间质损伤，损失残肾和发展的系统性和肾小球内高压。这是与程序控制essive肾内毛细血管亏损^4，炎症和肾小球硬化。危险因素CKD不约而同地影响内皮功能^5。我们使用大鼠株（刘易斯），是比较耐CKD发展，因此，我们结合5/6th去除肾质量与一氧化氮（NO）枯竭^6，7，8，高盐饮食^9。抵达和驯化后，动物收到一氧化氮合酶抑制剂（L-NNA）一个为期4周的补充饮用水（20毫克/升），其次为右侧单侧肾切除（UNX）延续L-NNA两天后。一个星期后，在左侧肾切除（SNX）， 即去除肾质量分之二。 SNX后，动物被允许恢复为2天，然后再由20 mg / L的LNNA饮用水中的4个星期为一个周期。高盐饮食（6％），辅以地面州城（见时间线图1），继续在整个实验过程。 Ť他理由进行UNX的右侧，并在左侧的SNX是，肾血管长度的左侧，这使得它更易于访问未经拉伸的船只太多时身体外面的露出肾脏的肾。在文献中，模型是描述了其中的磁极的左肾首先被清除，UNX的右肾一个星期后^10,11,12。在我们的手中，这个模型显示出更快速的发展，肾功能衰竭，也有更大的变化，肾功能丧失。通过测量血浆尿素，收缩压和蛋白尿，肾功能衰竭的进度之后随着时间的推移。通过SNX 6周后，肾功能衰竭发展，其特征在于由肾小球滤过率显着减少（69％）和有效肾血浆流量^{（62％）13}高压（收缩压> 150毫米汞柱），蛋白尿（> 50毫克小时），轻度尿毒症（> 10毫米）。病理特征包括tubul的邻间质损害反映炎症，肾小管萎缩，纤维化和局灶性肾小球硬化，导致残余人口健康肾小球内大量减少（<10％）。 SNX显示随访，直到12周后进一步CKD进展，评价治疗干预的机会提供了一个窗口。

研究方案

所有的实验都根据动物实验的伦理导向线的乌得勒支的实验动物委员会执行。该协议是作者的机构的动物护理和使用委员会的指导和批准下进行。

CKD是诱发雄性近交系Lewis大鼠（查尔斯河，Sulzfeld，德国）在8周龄。大鼠被安置在标准条件下，光，温度和湿度控制的环境中。

1。术前准备

1. 消毒手术器械:
   • 1学生组织钳1-2齿12厘米
   • 1学生标准模式钳
   • 2 Semken钳
   • 1梅奥剪刀
   • 1学生虹膜剪刀
   • 奥尔森有解用剪刀持针器
   • 毯子
2. 检查库存清单:
   • 手术台变暖垫和灯
   • Ø _{2，异氟醚}
   • 组织
   • 剃须刀
   • 秤
   • 无菌操作集
   • 无菌纱布5X5和10x10
   • 70％酒精
   • 0.9％NaCl溶液
   • 1ml注射器
   • 针（25G）
   • 凝胶海绵垫:spongostan
   • 薇乔4.0和5.0
   • 丁丙诺啡0.03毫克/公斤（1:10稀释在生理盐）
   • 清洁笼大鼠手术后

2。右侧单侧肾切除

1. 在表中，用70％的酒精消毒。
2. 将大鼠感应盒，用4％的异氟醚和1升流量的O ₂诱导麻醉。注:这取决于所用的大鼠株，前和围手术期镇痛所规定，这需要与当地的兽医讨论。
3. 转入大鼠表和地方鼻锥。大鼠和鼻锥体被放置在一个加热垫维持大鼠的体温。鼠我Ş通风与2％异氟醚和1升O ₂的混合物中。
4. 剃须大鼠的侧面，并用酒精消毒。手清洗和消毒，穿无菌手术手套。戴头帽和口罩。 1 - 1.5厘米的切口平行于肋骨解剖钳和剪刀钝。背部肌肉钝性分离，暴露肾脏。
5. 肾下极可见，小心地用小钝钳，夹住肾周脂肪组织。外部肾肾周脂肪用钳子轻轻拉动。在此过程中不干扰肾上腺照顾。肾上腺可以容易地除去，通过将上面的内侧部位在脂肪组织中的钳子，并轻轻地向上移动，肾上腺和图2中所示的肾之间。
6. 上轻轻将肾脏周围的脂肪和结缔组织的纱布清晰。确定肾动脉和静脉，放置结扎（5.0薇乔）与血管周围单结，但不打领带结。
7. 仔细将松散的结约0.5厘米，沿着朝向主动脉血管创造空间之间的肾脏和结。这样做是为了防止从切割后脱落结扎。
8. 两个双结打结。如果停止灌注，肾的颜色会立即变为褐色。不要切断结扎线的两端。
9. 切靠近肾脏的肾血管和肾脏排除。轻轻拉出长端结扎检查肾血管出血。结扎应该留在地方上的船只。切长两端结扎。请注意，残余肾血管会收缩，立即进入腹腔。
10. 吸干切除肾脏干燥和称重。
11. 关闭骨骼肌切开与薇乔5.0运行缝线。注射0.10毫升（0.03毫克/千克）丁丙诺啡IM后肢。关闭皮肤与薇乔4.0与皮内缝合。这可以防止将大鼠从开放的伤口。注:由于呼吸抑制Lewis大鼠，我们只给手术后的镇痛之前关闭异氟醚。
12. 房子在一个干净的食物和水容易进入孤笼大鼠。将笼变暖垫O / N的一半，第二天仔细检查老鼠。当将伤口闭合和大鼠是积极的，这通常是在手术后6和12小时之间，大鼠可以被放置成组壳体的。

3。左侧肾切除

1. 七天后，相同的制剂为从2.1至2.5所描述的右侧的左侧。在手术前，需要被移除对应约分之二的重量右肾的肾组织中的量的计算方法。术前准备小块泡沫凝胶（Spongostan，强生公司，新泽西州）。
2. 左肾上极锋利的剪刀周围放置在一个冲程（剪刀的位置，参见图3），切除上极。立即盖上一块泡沫凝胶，并用无菌纱布施加温和的压力。
3. 重复3.3肾脏下极。
4. 提起肾脏皮肤上，以防止凝血。保持温和的压力，用无菌纱布都凝胶海绵垫，直到出血停止。当出血仍然存在，添加另一个泡沫垫。
5. 将残肾腹部内贴壁凝胶海绵垫。关闭的肌肉和皮肤，并按照2.9-2.12。

4。假手术

1. 假手术对照经过同样的过程，以揭露肾脏。而是肾脏摘除或切割的两极，一个星期后，两个肾脏被解封间隔一个星期，照顾不来打扰的肾上腺。伤口缝合手术后的护理是ID2.11及2.12 entical。

结果

肾切除后，约六分之一肾总质量被留下。 图4显示了与前两次实验的平均值和标准偏差右肾切除部分的重量。每个人都应该记住，在UNX一周后，左肾肥大发生，这表明的重量，计算上在5/6th去除小于右侧肾脏的重量的结果总是需要被移除。然而，由于它是不可能的左肾在手术过程中确定权重，这是最准确的方法，以消除约5/6th的原肾质量。

随着时间的推移，CKD大鼠...

讨论

手术切除5/6th Lewis大鼠肾的质量，再加上高盐饮食和临时NOS抑制剂导致的模型类似于人类CKD CKD，CKD的治疗干预的因果机制和疗效，并允许研究。

的5/6th肾切除模型是一个著名的和广泛的描述模型，用于CKD。然而，简单地删除5/6th肾质量不会导致立即肾功能衰竭大鼠品系。我们使用Lewis大鼠的影响进行研究基于细胞的疗法，在CKD的可用性GFP + Lewis大鼠²¹允许nonGFP跟踪管理?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
L-NNA	Sigma-aldrich	N5501
Spongostan dental: gel foam pads 1x1x1 cm	Johnson&Johnson	Ms0005
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36	Ethicon	V303H
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36	Ethicon	V392H
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Via local pharmacist ordered by Reckitt Benckiser pharmaceuticals	unknown
			Equipment
Student Tissue Forceps - 1x2 Teeth 12 cm	Fine Science Tools (FST)	91121-12
Student Standard Pattern Forceps	FST	91100-12
Mayo Scissors	FST	14010-15
2X Semken Forceps	FST	11008-13
Student Iris Scissors	FST	91460-11
Olsen-Hegar Needle Holder	FST	12002-14