5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Zusammenfassung

Ein zweistufiges Verfahren zur chronischen Niereninsuffizienz (CNI) in der Lewis-Ratte etablieren durch chirurgisches Entfernen 5/6th der renalen Masse beschrieben. Kombination des chirurgischen Eingriffs, führt NOS-Hemmung und ein High-Salz-Diät zu einem Modell ähnlich menschlichen CKD, sodass Studie von kausalen Mechanismen und Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen.

Zusammenfassung

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) ist ein globales Problem. Verlangsamen CKD Progression ist ein großes gesundheitliches Priorität. Seit CKD durch komplexe Störungen der Homöostase gekennzeichnet ist, sind integrative Tiermodellen notwendig, um die Entwicklung und das Fortschreiten von CKD studieren. Um die Entwicklung der CKD und neuartige therapeutische Interventionen in CKD studieren, benutzen wir die 5/6th Nephrektomie Ablation Modell, einem bekannten experimentellen Modell der progressive Nierenerkrankung, ähnlich mehrere Aspekte der menschlichen CKD. Die Brutto-Reduktion renaler Masse verursacht progressive glomeruläre und Tubulointerstitielle Verletzung, Verlust der Überrest Nephronen und Entwicklung von systemischen und glomerulären Hypertonie. Es ist auch mit progressiver Verlust intrarenal Kapillare, Entzündungen und Glomerulosklerose verbunden. Risikofaktoren für CKD unweigerlich Auswirkungen auf die Endothelfunktion. Um dies zu imitieren, kombinieren wir Entfernung von 5/6th der renalen Masse mit Stickstoffmonoxid (NO) Verarmung und eine hohe Salz-Diät. Nach der Ankunft und Eingewöhnung, wieder Tiereceive eine NO-Synthase-Inhibitor (NG-Nitro-L-Arginin) (L-NNA) ergänzt, um Trinkwasser (20 mg / L) für einen Zeitraum von 4 Wochen, gefolgt von rechtsseitigen uninephrectomy gefolgt. Eine Woche später wird eine Zwischensumme Nephrektomie (SNX) auf der linken Seite durchgeführt. Nach SNX werden Tiere erlaubt, für zwei Tage nach LNNA im Trinkwasser (20 mg / L) folgte für einen weiteren Zeitraum von 4 Wochen zu erholen. Eine hohe Salz-Diät (6%), in Boden chow (siehe Zeitleiste Abbildung 1) ergänzt wird während des Experiments fortgesetzt. Progression der Niereninsuffizienz im Laufe der Zeit durch Messen Plasma Harnstoff, systolischer Blutdruck und Proteinurie gefolgt. Nach sechs Wochen nach SNX hat Nierenversagen entwickelt. Die Nierenfunktion wird mittels "Goldstandard" Inulin und para-Amino Hippursäure (PAH)-Clearance-Technologie. Dieses Modell der CKD wird durch eine Verringerung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und des effektiven renalen Plasma-Flow (ERPF), Hypertonie (systolischer Blutdruck> 150 mmHg), Proteinurie (> 50 mg/24 h gekennzeichnet) Und milden Urämie (> 10 mm). Histologische Merkmale sind Tubulointerstitielle Schäden, die durch Entzündung, Fibrose und tubuläre Atrophie und fokale Glomerulosklerose führt zu massiven Abbau von gesunden Glomeruli innerhalb der Restbevölkerung (<10%) wider. Follow-up bis 12 Wochen nach SNX weiteres Fortschreiten der CKD zeigt.

Einleitung

Aufgrund seiner progressiven Charakter, anschließenden Endstadium Nierenerkrankung und assoziierten kardiovaskulären Morbidität und Mortalität ist CKD ein wachsendes Problem der öffentlichen Gesundheit ^ein. Verlangsamen CKD Progression ist daher ein großes gesundheitliches Priorität. Seit CKD durch komplexe Störungen der Homöostase gekennzeichnet ist, sind integrative Tiermodellen notwendig, um die Entwicklung und das Fortschreiten von CKD studieren. Die Niere besteht aus einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen, die miteinander interagieren. Diese Komplexität kann nicht in vitro nachgeahmt werden.

Um neue therapeutische Interventionen in CKD studieren, benutzen wir die 5/6th Nephrektomie Ablation Modell, ein bekannter experimentellen Modell der progressive Nierenerkrankung, ähnlich mehrere Aspekte der menschlichen CKD ^2,3. Die Brutto-Reduktion renaler Masse verursacht progressive glomeruläre und Tubulointerstitielle Verletzung, Verlust der Überrest Nephronen und Entwicklung von systemischen und glomerulären Hypertonie. Es ist mit progr verbundenEssiv intrarenal Kapillare Verlust ^4, Entzündung und Glomerulosklerose. Risikofaktoren für CKD unweigerlich Auswirkungen auf die Endothelfunktion ^5. Wir verwendeten einen Rattenstamm (Lewis), die relativ beständig um die Entwicklung von CKD ist und deshalb haben wir kombiniert Entfernung von 5/6th der renalen Masse mit Stickstoffmonoxid (NO) Verarmung ^{6, 7, 8} und eine hohe Salz-Diät ^9. Nach der Ankunft und Eingewöhnung, erhalten Tiere eine NO-Synthase-Inhibitor (L-NNA) ergänzt werden, um Trinkwasser (20 mg / L) für einen Zeitraum von 4 Wochen, gefolgt von rechtsseitigen uninephrectomy (UNX) mit Fortsetzung der L-NNA nach zwei Tagen gefolgt . Eine Woche später wird Zwischensumme Nephrektomie (SNX) dh Entfernung 2/3rds renalen Masse auf der linken Seite durchgeführt. Nach SNX werden Tiere erlaubt, für 2 Tage wieder gefolgt von 20 mg / L LNNA in Trinkwasser für einen Zeitraum von 4 Wochen zu erholen. Eine hohe Salz-Diät (6%), in Boden chow (siehe Zeitleiste Abbildung 1) ergänzt wird während des Experiments fortgesetzt. Ter Grund, die UNX auf der rechten Seite durchzuführen und SNX auf der linken Seite ist, dass die Nierengefäße mehr auf der linken Seite, die es einfacher, den Nieren ohne Dehnung der Gefäße zu viel, wenn die Niere außerhalb des Körpers ausgesetzt ist, Zugriff sind . In der Literatur werden Modelle beschrieben, bei dem die Pole des ersten linken Niere entfernt werden, gefolgt von UNX der rechten Niere eine Woche später ^10,11,12. In unseren Händen Dieses Modell zeigte eine viel schnellere Entwicklung von Nierenversagen, sondern auch eine viel größere Variation in Verlust der Nierenfunktion. Progression der Niereninsuffizienz im Laufe der Zeit durch Messen Plasma Harnstoff, systolischer Blutdruck und Proteinurie gefolgt. Nach sechs Wochen nach SNX hat Nierenversagen entwickelt, gekennzeichnet durch deutliche Verringerung der glomerulären Filtrationsrate (69%) und des effektiven renalen Plasmaflusses (62%) ¹³ Hypertonie (systolischer Blutdruck> 150 mmHg), Proteinurie (> 50 mg/24 h) und milden Urämie (> 10 mm). Histologische Merkmale sind Tubulo-interstitielle Schäden, die durch Entzündung, Fibrose und tubuläre Atrophie und fokale Glomerulosklerose führt zu massiven Abbau von gesunden Glomeruli innerhalb der Restbevölkerung (<10%) wider. Follow-up bis 12 Wochen nach SNX zeigt ein weiteres Fortschreiten der CKD und bietet ein Fenster der Gelegenheit für die Bewertung der therapeutischen Interventionen.

Protokoll

Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den tierexperimentellen ethischen Richtlinien des Utrecht Versuchstier Ausschuss ausgeführt. Das Protokoll wird unter der Leitung und Genehmigung des Autors Institution Tierpflege und Nutzung Ausschuss durchgeführt.

CKD ist bei männlichen Inzucht Lewis Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) im Alter von 8 Wochen induziert. Ratten werden unter Standardbedingungen in einem Licht-, Temperatur-und Feuchte-kontrollierten Umgebung untergebracht.

1. Chirurgie Vorbereitung

1. Sterilisieren chirurgische Instrumente:
   • 1 Student Pinzetten 1-2 Zähne 12 cm
   • 1 student standard Muster Zange
   • 2 Semken Zange
   • 1 Mayo Schere
   • 1 Schüler Iris Schere
   • 1 Olsen-Hegar Nadelhalter mit Schere
   • Blanket
2. Prüfen Inventarliste:
   • OP-Tisch mit Erwärmung pad und Lampe
   • O _{2, Isofluran}
   • Gewebe
   • Shaver
   • Scales
   • Sterile Betriebssollwert
   • Sterile Gaze 5x5 und 10x10
   • 70% Alkohol
   • 0,9% NaCl-Lösung
   • 1 ml Spritze
   • Nadeln (25G)
   • Gel Schaumstoff-Pads: Spongostan
   • Vicryl 4.0 und 5.0
   • Buprenorphin 0,03 mg / kg (1:10 in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt)
   • Saubere Käfig für Ratten nach der Operation

2. Right Side Uninephrectomy

1. Desinfizieren Sie die Tabelle mit 70% Alkohol.
2. Platz Ratte in Induktion Box und induzieren Anästhesie mit 4% Isofluran und 1 Liter Durchfluss von O _2. Hinweis: Je nach Rattenstamm verwendet, prä-und perioperative Analgesie vorgeschrieben sind, muss dies mit dem örtlichen Tierarzt besprochen werden.
3. Übertragen Ratte zu Tisch und Platz Nase in Kegel. Die Ratte und Nasenkonus auf ein Heizkissen gelegt, um die Ratte die Körpertemperatur zu halten. Die Ratte is belüftet mit einer Mischung aus 2% Isofluran und 1 Liter O _2.
4. Rasur die Flanke von der Ratte und desinfizieren mit Alkohol. Hände waschen und desinfizieren und sterile Handschuhe tragen. Tragen Sie einen Kopf Kappe und eine Maske. Machen Sie eine 1-1,5 cm Einschnitt parallel zu den Rippen mit anatomischen Pinzette und Schere stumpf. Expose der Niere durch stumpfe Dissektion der Rückenmuskulatur.
5. Die unteren Pol der Niere sichtbar ist, sorgfältig mit den kleinen stumpfen Pinzette die perirenalem Gewebe zu greifen. Externalize die Niere durch leichtes Ziehen am perirenalem mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, nicht zu stören die Nebenniere bei diesem Vorgang. Die Nebenniere kann durch Anordnen einer Pinzette an der medialen Seite auf dem Fettgewebe entnommen und sanft nach oben bewegt wird zwischen der Nebenniere und der Niere wie in Abbildung 2 dargestellt.
6. Zeigen Niere sanft auf Gaze und frei von umgebenden Fett-und Bindegewebe. Identifizieren Sie die Nierenarterie und Vene und legen Sie eine Ligatur (5,0Vicryl) mit einem einzigen Knoten um die Gefäße, aber nicht binden Sie den Knoten.
7. Bewegen Sie den lockeren Knoten vorsichtig entlang der Gefäße in Richtung der Aorta von ca. 0,5 cm, um Platz zwischen der Niere und dem Knoten erstellen. Dies geschieht, um die Ligatur ein Abrutschen nach dem Schneiden zu verhindern.
8. Krawattenknoten mit zwei doppelten Knoten. Wenn Perfusion gestoppt, wird die Farbe der Niere sofort zu braun wechseln. Schneiden Sie nicht die Enden der Ligatur.
9. Schneiden Sie die renalen Gefäße in der Nähe der Niere und Entfernung der Niere. Vorsichtig an den langen Enden der Ligatur für Blutungen der renalen Gefäße überprüfen zu ziehen. Die Ligatur sollte an Ort und Stelle auf dem Schiff zu bleiben. Schneiden Sie die langen Enden der Ligatur. Hinweis werden die Überbleibsel Nierengefässe in die Bauchhöhle sofort zurückzuziehen.
10. Blot ausgeschnitten Niere trocknen und gewogen.
11. Schließen Sie die Skelettmuskulatur Schnitt mit fortlaufenden Nähten mit Vicryl 5.0. Spritzen 0,10 ml (0,03 mg / kg) im Buprenorphin in der hinteren Gliedmaßen. Schließen Sie dieHaut mit Vicryl 4.0 mit Intrakutannaht. Dies verhindert, dass die Ratten von der Öffnung der Wunde. Hinweis: aufgrund von Atemdepression in Lewis-Ratten, wir geben nur postoperativen Analgesie kurz vor dem Abschalten der Isofluran.
12. Haus der Ratte in einem Käfig sauber Einzelhaft mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser. Setzen Sie den Käfig Hälfte auf Erwärmung pad O / N und überprüfen Sie die Ratte sorgfältig am nächsten Tag. Wenn die Wunde geschlossen wird und die Ratte aktiv ist, was in der Regel zwischen 6 und 12 Stunden nach der Operation kann die Ratten wieder in Gruppe Gehäuses platziert werden.

3. Left Side Zwischensumme Nephrectomy

1. Sieben Tage später werden die gleichen Vorbereitungen auf der linken Seite für die rechte Seite, wie 2,1 bis 2,5 beschrieben wird. Vor der Operation wird die Menge von Nierengewebe, die entfernt, die etwa 2/3rds des Gewichts der rechten Niere werden muss berechnet. Bereiten Sie kleine Stücke von Gel-Schaum (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) vor der Operation.
2. Zeigen scharfen Schere um den oberen Pol der linken Niere und Resektion des oberen Pol in einem Hub (für Scheren Lage, siehe Abbildung 3). Abdeckung sofort mit einem Stück Gel-Schaum und üben leichten Druck mit steriler Gaze.
3. Wiederholen Sie mit dem unteren Pol der Niere als in 3.3.
4. Heben Niere zur Verhinderung der Gerinnung auf der Haut. Pflegen Sie leichten Druck auf beiden Gel Schaumstoff-Pads mit steriler Gaze, bis die Blutung aufhört. Wenn die Blutung anhält, fügen Sie eine weitere Schaumstoffmatte.
5. Zeigen Überrest Niere mit anhaftenden Gel Schaumstoff-Pads in den Bauch. Schließen Sie die Muskeln und Haut und folgen 2,9-2,12.

4. Sham Surgery

1. Sham Überwachung unterzogen dasselbe Verfahren, um die Nieren freizulegen. Statt Ausrottung der Niere oder Schneiden der Stangen eine Woche später sind sowohl die Nieren bei einem einwöchigen Intervall decapsulated, kümmert sich nicht um die Nebennieren zu stören. Wundverschluss und postoperative Versorgung sind identical bis 2.11 und 2.12.

Ergebnisse

Nach Zwischensumme Nephrektomie ist etwa 1:6 der renalen Gesamt-Masse links. Abbildung 4 zeigt das Gewicht des entfernten Teils der rechten Niere mit Mittelwert und Standardabweichung in zwei früheren Experimenten. Man sollte im Hinterkopf behalten, dass in der Woche nach UNX tritt Hypertrophie der linken Niere, die anzeigt, dass das Gewicht, die entfernt berechnet bezogen auf das Gewicht der rechten Niere immer Ergebnisse in weniger als 5/6th Entfernung werden muss. Da es jedoch nicht möglich, das Ge...

Diskussion

Chirurgische Entfernung von 5/6th der renalen Masse in der Lewis-Ratte, mit einem High-Salz-Diät und temporäre NOS Inhibition kombiniert führt zu einem Modell von CKD, die menschliche CKD ähnelt und ermöglicht Untersuchung der kausalen Mechanismen und Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen in CKD.

Die 5/6th Nephrektomie Modell ist ein bekannter und vielfach beschrieben Modell für CKD. Allerdings ist das einfache Entfernen 5/6th der renalen Masse nicht sofort Nierenversagen in a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
L-NNA	Sigma-aldrich	N5501
Spongostan dental: gel foam pads 1x1x1 cm	Johnson&Johnson	Ms0005
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36	Ethicon	V303H
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36	Ethicon	V392H
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Via local pharmacist ordered by Reckitt Benckiser pharmaceuticals	unknown
			Equipment
Student Tissue Forceps - 1x2 Teeth 12 cm	Fine Science Tools (FST)	91121-12
Student Standard Pattern Forceps	FST	91100-12
Mayo Scissors	FST	14010-15
2X Semken Forceps	FST	11008-13
Student Iris Scissors	FST	91460-11
Olsen-Hegar Needle Holder	FST	12002-14