的弱散射主题内嵌数字全息显微镜（DIHM）

摘要

弱散射物体的三维位置可被唯一地识别利用数字内嵌全息显微镜（DIHM），它涉及到一个小的修改，以一个标准的显微镜。我们的软件使用加上瑞利 - 索末菲反向传播，得到三维位置和微观相对象的几何形状的简单的成像启发式。

摘要

弱散射的物体，诸如小的胶体粒子和大多数生物细胞中，经常遇到的显微镜。的确，已经开发了一系列的技术，以便更好地可视化这些相位物体;相衬和DIC是最流行的方法用于增强对比度。但是，在超出成像平面的方向上的记录位置和形状仍然具有挑战性。本报告介绍了一种简单的实验方法精确地确定位置和在三维空间中的物体的几何形状，采用数字内嵌全息显微镜（DIHM）。从广义上讲，可访问的样品体积是由相机传感器尺寸在横向方向上，并且在轴向方向上的照明相干性来定义。典型样品体积范围从200 微米 ×200 微米 ×200微米采用LED照明，以5毫米 ×5 毫米 ×5毫米或更大的用激光照射。这样的照明光被配置成使得平面波入射到样品上。在样品体积的物体然后散射光，这与未散射的光干涉而形成的干涉条纹垂直于所述照明方向。该图中（全息图）包含所需的三维重建的深度信息，并且可以在标准的成像设备，诸如CMOS或CCD照相机上被捕获。瑞利 - 索末菲反向传播方法被用来数值重新聚焦显微镜图像，并基于所述的Gouy相位的简单成像启发式异常是用来识别散射重构的体积内的对象。这个简单而可靠的方法导致对象的位置和形状的显微样品中的一个明确的，无模型测量。

引言

内嵌数字全息显微镜（DIHM）允许显微镜的样品，如游泳微生物^1,2和软物质系统^3,4，以最小的修改一个标准的显微镜装置的快速三维成像。本文DIHM的教学演示提供，围绕在我们的实验室开发的软件中心。本文包括如何设置显微镜，优化数据采集，处理和记录的图像重建三维数据的描述。该软件（部分基于软件由DG格里尔和其他⁵开发）例如图像，且可自由查看我们的网站上。下面说明提供的配置显微镜，从全息图重建三维体积和使用一个免费射线跟踪软件包呈现所得的感兴趣体积所必需的步骤。本文总结了影响重建质量因素的讨论和DIHM与竞争方法进行了比较。

虽然DIHM被描述前一段时间（对于其原则和发展进行全面检讨，见金^6），所需要的计算能力和图像处理专业技术迄今在很大程度上限制了它的使用，以专门研究小组，重点放在仪器的发展。这种局面正在改变在计算机和摄像头技术的最新进展的光。现代桌面电脑可以轻松应对处理和数据存储需求; CCD或CMOS摄像头存在于大多数显微镜实验室，以及必要的软件被免费提供在互联网上通过谁在开发该技术投入时间组。

各种方案已经被提出用于成像微观对象的配置中的三维样品体积。许多这些扫描技术^7,8，其中一个堆栈的图像的记录由米通过样品echanically平移所述图像平面。激光扫描共聚焦荧光显微镜也许是最熟悉的例子。通常，荧光染料被添加到相位物体，以便实现样品的对比可以接受的水平，并在共聚焦装置用于空间定位的荧光发射。这种方法导致了显著的进步，例如在胶体科学它允许访问拥挤的系统^9-11的三维动态。使用标签是荧光共聚焦显微镜和DIHM之间的一个重要差别，但两种技术的其他功能都值得比较。 DIHM具有显著速度上的优势在于，该装置没有移动部件。在共聚焦系统的机械扫描镜放置一个上限的数据采集率 - 通常大约30帧/秒的512×512像素的图像。可以通过物理译获得一摞这样的图像从不同的焦平面阿婷帧之间的样品台或物镜，导致每秒大约一体积为30帧堆栈的最终捕获率。在比较的基础上，现代CMOS相机的全息系统可以捕获2000帧/秒在相同的图像尺寸和分辨率，每个帧被`离线'处理，得到样品体积的独立快照。重申一下：不需要荧光样品DIHM，虽然系统已经开发出来，进行荧光主体¹²的全息重建。以及三维体积信息，DIHM也可以被用来提供定量相衬图像^13，但是这超出了本文的讨论范围之内。

原始DIHM数据图像是二维的，并且在某些方面看起来像标准的显微镜图像，虽然失焦。 DIHM和标准亮视野显微镜之间的主要区别在于，围绕物体的衍射环我n个视场，这些都是因照明的性质。 DIHM需要比亮场更连贯源 - 通常是LED或激光。在全息图上的衍射环含有重构的三维图像所需的信息。有两种主要的方法来解释DIHM数据，直接拟合和数值重新调整。第一种办法是适用的地方衍射花纹的数学形式事先已知^3,4案件;这种情况被通过极少数样球体，缸，一半平面障碍物的简单对象遇见。直接拟合也可以适用于该对象的轴向位置是已知的情况下，图像可以使用的图像模板¹⁴中的查找表被安装。

第二种方法（数字重聚焦）是较为普遍，并依赖于使用的衍射环在二维全息图图像进行数值重构光场在一些（任意间隔）焦平面整个样品体积。这样做的⁶几个相关的方法存在，这项工作采用瑞利-索末菲反向传播技术所描述的李和格里尔^5。这个程序的结果是一个栈，复制手动更改显微镜焦平面（因此得名'数值重新调整'）的效果的图像。一旦已经生成了一个堆栈的图像，必须获得在焦量被摄物体的位置。一个数字图像分析的启发式，如局部强度方差或空间频率内容的，已经呈现给量化聚焦的锐度在不同点的样品¹⁵中。在每一种情况下，当一个特定的图象量度被最大化（或最小化），该对象被认为是在焦点上。

不像其他的计划，寻求以识别特定的焦平面其中一个对象是“焦点”，在这项工作中的方法挑选输出Points的谎言感兴趣的对象内部，从而在广泛焦平面延伸。这种方法可以适用于广泛的主题，并且特别适合于延伸，弱散射样品（相位物体），如杆状胶体，细菌的链条或真核生物的鞭毛。在这样的样品，当对象穿过焦平面的图像的对比度改变;散焦图像具有光中心，如果该对象是在焦平面与暗中心的一侧上，如果它是在另一。纯相的对象几乎没有任何相反，当他们躺在正是在焦平面。这种现象对比反转的已经由其他作者^16,17讨论，并最终由于的Gouy相位异常^18。这已被放置在全息的上下文中更严格的立足点别处，其中所述技术的限制进行评估;在位置的典型的不确定性是150纳米（约一个像素）在EAC的顺序H方向^19。古埃相位异常的方法是用于确定在三维空间中扩展的对象的结构的几个定义良好DIHM方案之一，但尽管如此某些对象是有问题的重构。直接位于沿着光轴（指着相机）的对象是难以精确地重建，在该对象的长度和位置误差变大。这种限制是部分由于受限制的位深度的记录全息图（不同的灰度级，该相机可以记录的数量）的像素。当感兴趣的对象是非常接近焦平面另一个有问题的配置发生。在这种情况下，对象的实际和虚拟图像重建接近，到复杂的光学领域都是难以解释而产生。第二，稍不那么重要这里关注的是，所得的衍射条纹占用更少的图像传感器，而这种粗粒INFormation导致较差质量的重建。

在实践中，一个简单的梯度滤波器被应用到三维重构的体积来检测强度强反转沿照射方向。地区，强度变化很快从亮到暗，或反之亦然，然后与散射区域相关联。弱散射物体有很好的描述为这样的元素²⁰的非相互作用集合，这些个人缴费之和为总的散射场是利用瑞利-索末菲反向传播方法容易倒。在本文中，轴向强度梯度技术被应用到一个链链球菌细胞。细胞体是相位对象（物种大肠杆菌具有测量²¹为1.384在波长λ= 589nm的折射率;的链球菌菌株很可能是类似的），并在显示为连接小圆块的高强度链日渐变滤镜后É样品体积得到了应用。适用于该过滤体积标准阈值和特征提取方法允许容积像素（体素）相对应的区域内的细胞内的提取。这种方法的一个特别的优点是它允许在轴向方向上的物体的位置的明确的重建。类似的方法（至少，那些记录的全息图邻近的对象，通过显微镜的物镜成像）患有无法确定此位移的符号 。虽然瑞利 - 索末菲重建方法还签署无关在此意义上，梯度操作允许我们上面和下面的焦平面弱相位物体之间的区分。

研究方案

1。设置和数据采集

1. 从冻结的股票增长²² 链球菌菌株V4051-197（平滑游泳）细胞在KTY介质的文化。孵育在旋转摇床上过夜，在35℃和150rpm下，以饱和。
2. 接种10ml新鲜KTY培养基用500μl的饱和培养物。孵育另外的3.5小时，在35℃和150rpm下，直到细胞在λ= 600纳米（约5×10 ⁸个细胞/ ml），达到约1.0的光密度。
3. 稀释1:400在新鲜培养基中，得到游动细胞的最终浓度。
4. 在显微镜载玻片上，使润滑脂的环（ 例如，从填充有凡士林注射器）约1毫米的高度，然后将一滴在中心的样品溶液。放置在顶部，轻压玻璃盖的边缘密封，确保液与两个滑动盖和玻璃接触。由此产生的样品室应该是阿柔ND 100-200微米的深度。
5. 将样品室中的盖玻璃朝下显微镜，并小心，以防止气泡的形成在油玻璃和透镜之间。
6. 重点放在样品室的底部表面的显微镜，并带来冷凝器进行对焦。
7. 关掉标准照明体和放置在LED头显微镜的聚光器孔径的后面。设置LED电源的最大输出。
8. 关闭冷凝器光圈到最大程度，并且如果需要，轻推在其安装的LED，直到照明的中心在上述物镜的数值孔径。
9. 切换电脑和相机，以及所有的光重定向到显微镜的相机端口。调整帧速率和图像尺寸的图像采集软件。
10. 使画面曝光时间越短越好，同时仍保持良好的对比度。检查图像亮度直方图，以保证图像不饱和特德或曝光不足。
11. 如果有必要，重新聚焦显微镜，让感兴趣的对象稍微散焦（通常为10-30微米）。在物体与焦平面应该在相同的培养基中（ 即焦平面应位于样品室室内）。

2。重建

处理数据的第一步骤是将数值重新调整视频帧在一系列不同的深度，产生一个堆栈的图像。用户友好的软件，这样做可以在这里找到： http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html与示例图像（使用倒置显微镜获得的，和60X油浸物镜）和光线场景文件追踪渲染。

1. 利益输入和帧其各自的背景为单独的图像文件，在该接口上的有关空格。背景图像是一帧使得fairly代表视频的背景下，在没有全息图，并且将用于抑制任何固定图案噪声可能干扰全息图的定位和分析。
2. 在运行程序之前将值输入到屏幕左侧的全局设置框。前三个是输出栈参数：第一帧的轴向位置（'开始注重'）;在重建切片堆叠数（'步数'）;各片之间在堆栈中的轴向距离（'步长'） 。
3. 为了重建与正确的比例的目的，步长应为相同的尺寸的横向的像素间距。在“像素/微米”框，光照波长和介质的折射率在过去两年框中输入摄像机的横向取样频率（1/pixel间距）。该程序的默认值适合重建的示例数据。
4. 按“翻转的Z-梯度”按钮，如果OBJE中心克拉是黑暗的全息图（见示例帧2005和讨论更多的细节部分）。
5. 检查带通滤波器开/关状态（默认为开启）。这个可选的带通滤波器，位于下方的渐变，翻转开关盒，负责抑制由噪声点的贡献。带通滤波器生成后立即应用到每一个图像切片。
6. 检查开/关状态（默认为上）中间输出开关。中间分析步骤都写在两个输出视频，未压缩的avi文件：第一是重新调整堆栈（文件名'_stack.avi'结尾），第二个是堆栈中的轴向梯度操作后（文件名以' _gradient.avi'）。理想情况下，这第二个堆栈将包含感兴趣的对象突出显示为对一个黑暗的背景明亮的物体。
7. 设置完成后在主窗口中的所有参数，按“运行”。选定的帧将出现在软件的主箱。
8. 使用工具栏将图像放大（左键）和缩小（按shift +左键）的左侧找到放大镜工具。使用工具栏上的矩形工具，选择感兴趣区域（ROI）的区域。捕捉尽可能多的全息图的边缘尽可能的矩形内，因为这将优化改造。
9. 按“进程”按钮，生成两个图像堆栈。检查使用ImageJ（可免费在获得由此产生的堆栈http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）。如果感兴趣的对象可以清楚地看出，在梯度图像的堆栈，请继续下一步要提取的对象的坐标。

3。翻译

1. 除了框架重新调整，这个程序可以定位在X，Y，Z中感兴趣的对象的坐标为每个体素。按“特征提取”按钮来启用该功能。
2. 输入一个路径，包括扩展名（例如：c：家 output.inc），为输出坐标文件。在“输出坐标式”对话框中选择“POV-Ray的风格”。这将导致程序编写可以使用免费的POV-Ray的光线跟踪软件包（可从以下地址获得可视化的对象文件http://www.povray.org/ ）。
3. 重新处理图像作为上文第2节。该方案将提供一系列的（X，Y，Z）在选定的ROI坐标，在“输出坐标”框写入的文件名。物体坐标的提取需要显著长于堆栈生成。
4. 确保样品POV-Ray的文件（与重构代码）是在同一文件夹中刚刚生成的坐标文件。编辑范例。POV文件，并在引号替换文件名就行了
   ＃包括“MYFILE.inc”
   与由重建代码所产生的数据文件的名称。
5. 点击POV-Ray的的“运行”按钮，呈现一个位图图像。 Ŧ他的相机位置，灯光和纹理选项只是一些在POV-Ray的可自定义的，详情参见联机文档。

结果

为了演示DIHM的能力，实验是在一个链链球菌细菌进行。链本身测量10.5毫米长，是由6-7球柱面单元（2所述细胞在链轮的接近分割），直径范围为0.6-1微米。 图1a和1b示出了主接口重建和渲染软件。数字重聚焦过程的例子如图2所示，其中一个空间带通滤波器已被应用， 图3示出了梯度滤波器对图2中的图像的效果。用?...

讨论

在这个实验方案中最重要的步骤是从一个稳定的实验装置的图像的精确捕捉。差的背景资料，高保真重建几乎是不可能的。同样重要的是，避免物镜与内部相位对比元件（如通过物镜的背面看时暗环形可见的），因为这样可以降低重建图像。感兴趣的对象应该是远远不够的焦平面那几双衍射条纹的可见其形象（一个合适的启发是，散焦图案应具有焦点的对象的10倍线性尺寸 - 见示例数据）。物体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362