Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Zusammenfassung

Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.

Zusammenfassung

Schwach streuende Objekte, wie beispielsweise kleine kolloidale Partikel und die meisten biologischen Zellen, sind in der Mikroskopie häufig angetroffen. In der Tat eine Reihe von Techniken entwickelt worden, um diese Phase Objekte besser zu visualisieren, Phasenkontrast und DIC gehören zu den beliebtesten Methoden zur Verbesserung der Kontrast. Jedoch bleibt Aufzeichnungs Position und Form in der Richtung außerhalb der Abbildungsebene herausfordernd. Dieser Bericht stellt eine einfache experimentelle Methode, um die Position und Geometrie der Objekte in drei Dimensionen genau zu bestimmen, mit digitalen Inline-holographische Mikroskopie (Dihm). Grob gesagt, ist die zugängliche Probenvolumen von der Kamera Sensorgröße in der seitlichen Richtung und der Beleuchtungskohärenz in axialer Richtung definiert. Typische Probenvolumina reichen von 200 um x 200 um x 200 um unter Verwendung LED-Beleuchtung, um5 mm x 5 mm x 5 mm oder mehr unter Verwendung von Laserbeleuchtung. Dieses Beleuchtungslicht wird so konfiguriert, daß ebene Wellen treffen auf die Probe. Objekte im Probenvolumen dann streuen Licht, das mit dem nicht gestreuten Licht stört den Interferenzmuster senkrecht zur Beleuchtungsrichtung bilden. Dieses Bild (das Hologramm) enthält den Tiefeninformationen für dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich und kann auf einem Standard-Bildgebungsvorrichtung, wie eine CMOS-oder CCD-Kamera aufgenommen werden. Die Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren wird eingesetzt, um numerisch konzentrieren Mikroskopbilder, und eine einfache Heuristik Bildgebung auf der Grundlage der Gouy-Phase Anomalie wird verwendet, um zu identifizieren Streuobjekten im rekonstruierten Volumen. Diese einfache, aber robuste Methode ergibt sich eine eindeutige, Modell freie Messung der Lage und Form von Objekten in mikroskopischen Proben.

Einleitung

Inline-Digital-holographische Mikroskopie (Dihm) ermöglicht die schnelle dreidimensionale Bildgebung von mikroskopischen Proben, wie Schwimmen Mikroorganismen ^1,2 und Soft Matter ^3,4 Systeme mit minimalen Änderungen an einer Standard-Mikroskop-Setup. In diesem Papier eine pädagogische Demonstration Dihm vorgesehen ist, um Software in unserem Labor entwickelt zentriert. Dieses Papier enthält eine Beschreibung, wie Sie das Mikroskop, Optimierung der Datenerfassung und Verarbeitung der aufgenommenen Bilder zu dreidimensionalen Daten zu rekonstruieren. Das Software-und beispielsweise Bilder (zum Teil auf Software von der GD Grier und andere entwickelten ^fünf) sind auf unserer Website frei verfügbar. Eine Beschreibung der notwendigen Schritte, um das Mikroskop zu konfigurieren, zu rekonstruieren dreidimensionale Volumen von Hologrammen und machen die daraus resultierenden Volumina von Interesse mit einem kostenlosen Ray-Tracing-Software-Paket zur Verfügung gestellt. Der Beitrag schließt mit einer Diskussion der Faktoren, die die Qualität der RekonstruktionUnd ein Vergleich der Dihm mit konkurrierenden Verfahren.

Obwohl Dihm wurde vor einiger Zeit beschrieben (für eine allgemeine Überprüfung der Grundlagen und Entwicklung, siehe Kim ^6), die erforderliche Rechenleistung und Bildverarbeitung Know-how hat sich bisher weitgehend seine Verwendung an Facharbeitsgruppen mit Fokus auf Instrumentenentwicklung beschränkt. Diese Situation ändert sich im Licht der jüngsten Fortschritte in der Computer-und Kameratechnik. Moderne Desktop-Computer kann problemlos mit der Verarbeitung und Datenspeicheranforderungen zu bewältigen; CCD-oder CMOS-Kameras sind in den meisten Labors Mikroskopie vorhanden ist und die erforderliche Software wird frei verfügbar im Internet von Gruppen, die sich Zeit für die Entwicklung, die Technik investiert haben.

Verschiedene Schemata sind für die Abbildung der Konfiguration von mikroskopischen Objekten in einem dreidimensionalen Probenvolumen vorgeschlagen. Viele davon sind ^{7,8-Scan-Techniken,} bei dem ein Stapel von Bildern aufgezeichnet wird, indem mechanically Übersetzen der Bildebene durch die Probe. Konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist vielleicht das bekannteste Beispiel. Typischerweise wird ein Fluoreszenzfarbstoff an ein Phasenobjekt, um ein akzeptables Niveau der Probe Kontrast zu erzielen zugegeben und die konfokalen Anordnung verwendet werden, um räumlich zu lokalisieren Fluoreszenzemission. Dieses Verfahren hat erhebliche Fortschritte, beispielsweise in Kolloid-Wissenschaft, wo es Zugang zu den dreidimensionalen Dynamik voll Systeme ^9-11 erlaubt geführt. Die Nutzung der Kennzeichnung ist ein wichtiger Unterschied zwischen der konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Dihm, aber auch andere Merkmale der beiden Techniken sind ein Vergleich lohnt sich. Dihm hat einen erheblichen Geschwindigkeitsvorteil, dass die Vorrichtung keine beweglichen Teile. Mechanischen Abtastspiegeln in Konfokalsystemen platzieren eine Obergrenze Datenerfassungsrate - typischerweise um 30 Frames / sec für Pixelbild 512 x 512. Ein Stapel solcher Bilder aus verschiedenen Fokusebenen kann durch physikalisches transl erhalten werdentriebs der Probentisch oder Objektivlinse zwischen den Bildern, die zu einer endgültigen Erfassungsrate von etwa einem Volumen pro Sekunde für eine 30-Frame-Stack. Im Vergleich dazu kann ein holographisches System basierend auf einem modernen CMOS-Kamera 2000 Bildern / sec bei der gleichen Bildqualität und Auflösung zu erfassen, wobei jeder Frame 'offline' verarbeitet, um eine unabhängige Snapshot des Volumens der Probe zu geben. Um es zu wiederholen: fluoreszierende Proben nicht für Dihm erforderlich, obwohl ein System entwickelt worden, das holographische Rekonstruktion eines fluoreszierenden Gegenstand ¹² führt. Sowie dreidimensionaler Volumeninformation, Dihm kann auch verwendet werden, um quantitative Phasenkontrastaufnahmen ^{13 vorzusehen,} aber das ist nicht Gegenstand des hier diskutierten.

Raw-Daten Dihm Bilder sind zweidimensional, und in mancher Hinsicht aussehen wie Standard-Mikroskopbilder, wenn auch unscharf. Der Hauptunterschied zwischen Standard-und Dihm Hellfeldmikroskopie liegt in den Beugungsringen umgeben, die Objekte in das Sichtfeld, das sind durch die Art der Beleuchtung. Dihm erfordert eine kohärentere Quelle als helles Feld - in der Regel eine LED oder Laser. Die Beugungsringe im Hologramm enthält die notwendigen Informationen, um ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren. Es gibt zwei Hauptansätze zur Interpretation Dihm Daten; direkte Montage und numerische Neuausrichtung. Der erste Ansatz ist in Fällen, in denen die mathematische Form des Beugungsmusters wird im Voraus bekannt ^3,4 anwendbar, wird dieser Zustand durch eine kleine Handvoll einfache Objekte wie Kugeln, Zylinder und Halbebene Scheide. Direkte Montage ist auch in Fällen, in denen das Objekt axialen Position bekannt ist zutreffend, und das Bild kann unter Verwendung einer Look-up-Tabelle von Bildvorlagen ¹⁴ ausgestattet werden.

Der zweite Ansatz (numerische Refokussierung) ist eher allgemein und beruht auf der Verwendung der Beugungsringe in dem zweidimensionalen Bildhologramm zur numerischen Rekonstruktion des optischen Feldes aneine Anzahl von (willkürlich) beabstandet Brennebenen der gesamten Probenvolumen. Mehrere verwandte Methoden existieren, dies zu tun ^6; diese Arbeit verwendet die Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation-Technik, wie von Lee und Grier ⁵ beschrieben. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist ein Stapel von Bildern, die die Wirkung der Brennebene des Mikroskops (daher der Name `numerische Neuausrichtung ') manuell ändern zu replizieren. Sobald ein Stapel von Bildern erzeugt worden ist, muss die Position des Objekts in der Brennvolumen erhalten werden. Eine Anzahl von Bildanalyseheuristiken, wie lokale Intensitätsvarianz oder räumliche Frequenzgehalt, wurden vorgestellt, um die Bildschärfe an verschiedenen Stellen in der Probe ¹⁵ zu quantifizieren. In jedem Fall, wenn ein bestimmtes Bildmetrik maximiert (oder minimiert), wird das Objekt als im Mittelpunkt.

Im Gegensatz zu anderen Systemen, die auf eine bestimmte Brennebene, wo sich ein Objekt "im Fokus" identifizieren zu suchen, das Verfahren in dieser Arbeit holt sich punkte, die in das Objekt von Interesse liegen, die in einem breiten Spektrum von Brennebenen erstrecken kann. Dieser Ansatz ist auf ein breites Spektrum von Themen und eignet sich besonders für ausgedehnte, schwach streuenden Proben (Phase-Objekte), wie stabförmige Kolloide, Ketten von Bakterien oder eukaryotischen Flagellen. In diesen Proben ändert sich die Bildkontrast, wenn das Objekt durch die Fokusebene verläuft, eine defokussierte Bild hat ein Lichtzentrum, wenn das Objekt auf einer Seite der Bildebene und einer dunklen Mitte, wenn es auf der anderen. Reine Phasenobjekte haben wenig bis keinen Kontrast, wenn sie genau in der Brennebene liegen. Dieses Phänomen der Kontrastinversion von anderen Autoren ^16,17 diskutiert und letztlich aufgrund der Gouy-Phase Anomalie ^18. Dies wurde auf einer strengeren berechtigt im Kontext der Holographie setzen an anderer Stelle, wo die Grenzen der Technik ausgewertet, die typische Unsicherheit in der Position ist, in der Größenordnung von 150 nm (ca. ein Pixel) in each Richtung ^19. Die Gouy-Phase Anomalie-Methode ist eine der wenigen gut definierten Dihm Systeme zur Bestimmung der Struktur ausgedehnter Objekte in drei Dimensionen, aber dennoch einige Objekte problematisch zu rekonstruieren sind. Objekte, die direkt entlang der optischen Achse (die auf die Kamera) liegen, sind schwierig genau zu rekonstruieren; Unsicherheiten in der Länge und der Position des Objektes groß werden. Diese Einschränkung ist zum Teil auf die eingeschränkte Farbtiefe der Pixel Aufzeichnung des Hologramms (die Anzahl der verschiedenen Graustufen, die die Kamera aufnehmen kann). Ein weiterer problematischer Konfiguration tritt auf, wenn das Objekt von Interesse ist sehr nahe an der Brennebene. In diesem Fall werden die reale und virtuelle Bilder des Objekts in unmittelbarer Nähe wieder aufgebaut, was zu komplizierte optische Felder, die schwer zu interpretieren sind. Eine zweite, etwas weniger wichtiges Anliegen dabei ist, dass die daraus resultierenden Beugungsstreifen besetzen weniger von der Bildsensor, und das gröbere informationen führt zu einer schlechteren Qualität Wiederaufbau.

In der Praxis wird ein einfacher Farbverlauf-Filter, um dreidimensionale rekonstruierten Volumen angewendet starke bis Inversionen entlang der Beleuchtungsrichtung zu erkennen. Regionen, in denen Intensitätsänderungen schnell von hell nach dunkel oder umgekehrt, werden dann mit Streubereiche verbunden. Diese einzelnen Beiträge Summe, um die Gesamtstreufeld, das einfach mit dem Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren invertiert geben; schwach streuenden Objekte sowie eine nicht wechselwirkenden Erhebung solcher Elemente ²⁰ beschrieben. In dieser Arbeit wird die axiale Intensitätsverlauf Technik mit einer Kette von Streptococcus Zellen angelegt. Die Zellkörper sind Phasenobjekte (der Spezies E. coli hat einen Brechungsindex, gemessen ²¹ bis 1,384 bei einer Wellenlänge λ = 589 nm sein, der Streptococcus-Stamm dürfte ähnlich sein) und erscheinen als ein Hochintensität-Kette von verbundenen Blobs the Probenvolumens nach dem Gradienten-Filter aufgebracht wurde. Standard auf diesem gefilterten Volumen angewendet Schwelle und Merkmalsextraktion Methoden ermöglichen die Extraktion von volumetrischen Pixel (Voxel), die der Region in den Zellen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine eindeutige Rekonstruktion der Position eines Objekts in der axialen Richtung. Ähnliche Verfahren (zumindest diejenigen, die Aufzeichnung von Hologrammen in der Nähe des Objekts durch ein Mikroskopobjektiv abgebildet) leiden darunter, nicht in der Lage, die Zeichen für diese Verschiebung zu bestimmen. Obwohl die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren ist auch Zeichen-unabhängige in diesem Sinne ermöglicht die Gradientenbetrieb uns, zwischen schwacher Phasenobjekte oberhalb und unterhalb der Fokusebene zu unterscheiden.

Protokoll

1. Setup-und Datenkommunikation

1. Wachsen einer Kultur von Streptococcus-Stamm V4051-197 (glatte Schwimmen) Zellen in KTY Medium aus der Tiefkühl ^22. Inkubieren in einem Rundschüttler über Nacht bei 35 ° C und 150 UpM bis zur Sättigung.
2. Beimpfen von 10 ml frischem KTY Medium mit 500 &mgr; l der gesättigten Kultur. Inkubation für weitere 3,5 h bei 35 ° C und 150 Upm, bis die Zellen erreichen eine optische Dichte von etwa 1,0 bei λ = 600 nm (etwa 5 x 10 ⁸ Zellen / ml).
3. Verdünnt 1:400 in frischem Medium auf eine Endkonzentration von beweglichen Zellen zu erhalten.
4. Auf einen Objektträger, einen Ring von Fett (zB aus einer Spritze mit Vaseline gefüllten) um 1 mm in der Höhe und einen Tropfen der Probenlösung in der Mitte. Legen Sie ein Deckglas oben und drücken Sie leicht an den Kanten zu versiegeln, sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in Kontakt mit beiden Träger und Deckglas. Die daraus resultierende Probenkammer sollte arou seinnd 100-200 um in die Tiefe.
5. Setzen Sie die Probenkammer im Mikroskop mit dem Deckglas nach unten, und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen in dem Öl zwischen Glas und Linse zu verhindern.
6. Fokussierung des Mikroskops auf der Bodenfläche der Probenkammer, und bringen den Kondensator zu konzentrieren.
7. Schalten Sie die Standardbeleuchtung und legen Sie den LED-Kopf hinter dem Kondensator Apertur des Mikroskops. Stellen Sie die LED-Stromversorgung für maximale Leistung.
8. Schließen Kondensorapertur in vollem Umfang, und wenn nötig, verschieben die Leuchtdiode in der Halterung, bis die Beleuchtung auf der Objektivlinse Öffnung mittig.
9. Schalten Sie den Computer und der Kamera, und leiten alles Licht, um Kamera-Anschluss des Mikroskops. Passen Sie die Bildrate und die Bildgröße in der Bildaufnahme-Software.
10. Machen Sie den Bild-Belichtungszeit so kurz wie möglich unter Beibehaltung guten Kontrast. Überprüfen einer Bildintensitätshistogramm, um sicherzustellen, dass das Bild nicht saturaTED-oder unterbelichtet.
11. Wenn nötig, neu auszurichten, so dass das Mikroskop Objekt von Interesse leicht (in der Regel von 10 bis 30 um) defokussiert. Das Objekt und der Brennebene sollten im gleichen Medium (dh die Brennebene sollten innerhalb der Probenkammer liegen).

2. Wiederaufbau

Der erste Schritt der Datenverarbeitung ist die numerisch refokussieren ein Videobild in einer Reihe von verschiedenen Tiefen, wodurch ein Stapel von Bildern. : Benutzerfreundliche Software, dies zu tun finden Sie hier http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html zusammen mit B. Bilder (mit einem inversen Mikroskop erfasst und einem 60X Ölimmersions-Objektiv) und eine Szene-Datei für Raytracing Rendering.

1. Eingang der Rahmen von Interesse und deren jeweiligen Hintergrund als separate Bilddateien in die entsprechenden Felder auf der Schnittstelle. Ein Hintergrundbild ist ein Rahmen, fairly stellt den Hintergrund des Videos, in Abwesenheit des Hologramms, und wird verwendet, um eine Festmusterrauschen, das mit dem Hologramm Lokalisierung und Analyse stören könnten, zu unterdrücken.
2. Werte eingeben, bevor Sie das Programm in den globalen Einstellungen Boxen auf der linken Seite des Bildschirms. Die ersten drei sind Stack-Parameter Ausgang: Axial Position des ersten Rahmen ('Start Fokus'), Anzahl der Scheiben in der rekonstruierten Stapel ('Anzahl der Schritte'); axiale Abstand zwischen jeder Scheibe im Stapel ('Schrittweite') .
3. Um Objekte mit den richtigen Proportionen zu rekonstruieren, sollte die Schrittweite die gleiche Größe wie die laterale Pixelabstand sein. Geben Sie der Kamera seitlichen Abtastfrequenz (1/pixel Abstand) in der 'Pixel / micron' Box, die Belichtungswellenlänge und mittleren Brechungsindex in den letzten zwei Boxen. Die Standardwerte des Programms sind für die Rekonstruktion der Daten beispielsweise geeignet.
4. Drücken Sie die Taste 'Flip Z-Gradienten ", wenn der Mittelpunkt der object ist dunkel in dem Hologramm (siehe Beispiel Rahmen 2005 und die Diskussion Abschnitt für weitere Details).
5. Überprüfen Sie die Bandpassfilter ein / aus (default ist). Diese optionale Bandpass-Filter, in einer Box unter dem Verlaufs-Flip-Schalter befindet, ist für die Unterdrückung der Beitrag laut Pixel verantwortlich. Der Bandpass-Filter auf jedem Bild Scheibe unmittelbar nach Generation angewendet.
6. Überprüfen Sie die Zwischenausgangs Ein-/ Aus-Zustände (Standard ist). Zwischenanalyse Schritte sind in zwei Ausgangsvideos als unkomprimierte geschrieben, avi Dateien:. Ist die erste der neu ausgerichteten Stapel (Dateinamen, die auf '_stack.avi'), der zweite ist der Stapel nach der axialen Gradienten Operation (Dateiname, die auf ' _gradient.avi). Im Idealfall wird diese zweite Stapel enthalten das Objekt von Interesse hervorgehoben als ein helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund.
7. Nach Einstellung aller Parameter, drücken Sie "Ausführen" im Hauptfenster. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt.
8. Verwenden Sie dieLupe-Werkzeug in der Werkzeugleiste auf der linken Seite das Bild, um es zu vergrößern (linke Maustaste) und verkleinern (Shift + linke Maustaste) gefunden. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um eine Region of Interest (ROI) zu wählen. Zu erfassen, wie viele Streifen des Hologramms wie möglich innerhalb des Rechtecks, da dies die Wieder optimieren.
9. Drücken Sie die "Process"-Taste, um die beiden Bildstapeln zu generieren. Überprüfen Sie die resultierende Stapel mit ImageJ (die kostenlos zur erhalten werden können http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Wenn das Objekt von Interesse eindeutig im Gradienten Bildstapel gesehen werden, zu dem nächsten Schritt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren.

3. Rendering

1. Neben Rahmen Neuausrichtung kann dieses Programm finden die x-, y-, z-Koordinaten für jedes Voxel in dem Objekt von Interesse. Drücken Sie die "Feature Extraction"-Taste, um diese Funktion zu aktivieren.
2. Geben Sie einen Pfad, einschließlich Erweiterung (zB: c: home output.inc), für dieAusgangskoordinaten-Datei. Wählen Sie "POV-Ray-Stil" in der "Ausgabe-Koordinaten Stil"-Box. Dies bewirkt, dass das Programm auf eine Objektdatei, die mit der kostenlosen POV-Ray Raytracing-Software-Paket (das gewonnen werden kann visualisiert werden kann schreiben http://www.povray.org/ ).
3. Nachbearbeiten der Bilder, wie in Abschnitt 2 oben. Das Programm wird eine Reihe von (x, y, z)-Koordinaten in der gewählten ROI, an den Dateinamen in der "Output koordinieren" Feld geschrieben. Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als Stack-Generation.
4. Stellen Sie sicher, dass die Probe POV-Ray-Datei (mit der Rekonstruktion Code geliefert) in dem gleichen Ordner wie die Datei nur Koordinaten erzeugt. Bearbeiten Sie die Probe. Pov-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen auf der Linie
   # Include "MYFILE.inc"
   mit dem Namen der durch den Rekonstruktionsdatendatei Code generiert.
5. Klicken Sie auf den "Ausführen"-Button in POV-Ray, ein Bitmap-Bild zu machen. Ter Kameraposition, Beleuchtung und Textur-Optionen sind nur einige der Anpassungen in POV-Ray möglich, siehe die Online-Dokumentation.

Ergebnisse

Um die Funktionen des Dihm zu demonstrieren, wurden Versuche an einer Kette von Streptococcus-Bakterien durchgeführt. Die Kette selbst gemessen 10,5 mm lang und wurde von 6-7 sphärozylindrische Zellen (zwei der Zellen in der Kette sind in der Nähe Division) mit Durchmessern im Bereich von 0,6 bis 1 um zusammen. 1a und 1b die wichtigste Schnittstelle zeigen des Wiederaufbaus und der Rendering-Software. Beispiele der numerischen Refokussierung Verfahrens sind in Fig. 2...

Diskussion

Der wichtigste Schritt in diesem Versuchsprotokoll ist die genaue Erfassung von Bildern von einer stabilen experimentellen Aufbau. Bei schlechten Hintergrunddaten, ist High-Fidelity-Rekonstruktion unmöglich. Es ist auch wichtig, Objektivlinsen mit einer internen Phasenkontrastelement (als dunkler Kreisring beim Blick durch die Rückseite des Ziels sichtbar ist) zu vermeiden, da dies das rekonstruierte Bild verschlechtern. Das Objekt des Interesses sollte weit genug von der Brennebene, die ein paar Paare von Beugungsstr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362