약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

요약

약하게 산란 물체의 3 차원 위치를 고유 표준 현미경에 사소한 변형을 수반 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용하여 식별 될 수있다. 우리의 소프트웨어는 삼차원 위치 및 미세한 위상 객체의 형상을 수득 레일리-펠드 역 전파 결합 촬상 간단한 휴리스틱을 사용한다.

초록

이러한 작은 콜로이드 입자와 대부분의 생물 세포와 같은 약한 산란 개체는 자주 현미경에서 발생된다. 실제로, 기술의 범위는 더 이러한 위상 객체를 시각화하기 위해 개발되었다; 위상차와 DIC는 콘트라스트를 향상시키기위한 대중적인 방법들이다. 그러나, 밖으로의 영상 평면 방향의 기록 위치와 모양은 도전 남아 있습니다. 이 보고서는 정확하게 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용 위치와 입체적 오브젝트 지오메트리를 결정하기 위해 간단한 실험 방법을 소개한다. 대체로, 액세스 가능한 샘플 볼륨은 횡 방향으로 카메라 센서의 크기, 그리고 축 방향으로 상기 조명 간섭에 의해 정의된다. 일반 샘플 볼륨은 LED 조명을 사용하여 200 ㎛ X 200 ㎛ × 200 μm의에서 범위5mm × 5 ㎜ × 5 ㎜ 이상의 레이저 조명을 사용. 평면파가 시료에 입사되도록이 조명광 구성된다. 샘플 볼륨의 개체는 다음 조명 방향에 수직 인 간섭 패턴을 형성하도록 unscattered 광과 간섭하는 빛을 산란. 이 이미지 (홀로그램) 삼차원 재구성에 필요한 깊이 정보를 포함하고, 이러한 CMOS 또는 CCD 카메라와 같은 표준 촬상 장치에서 캡처 할 수있다. 레일리-펠드 위로 전파 방법은 수치 현미경 이미지를 집중할 채용하고 GOUY 위상에 근거 간단한 촬상 휴리스틱은 변칙 재구성 된 볼륨 내의 개체 산란 식별하기 위해 사용된다. 이 간단하지만 강력한 방법은 미세한 샘플에있는 객체의 위치와 모양의 명확한 모델이없는 측정 결과.

서문

디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)은 수영과 같은 미생물 ^1,2 및 표준 현미경 설치에 최소한의 수정 부드러운 물질 시스템 ^3,4, 같은 미세한 샘플의 빠른 3 차원 화상을 할 수 있습니다. 본 논문에서는 DIHM의 교육적 데모는 우리의 실험실에서 개발 된 소프트웨어를 중심으로 제공된다. 이 논문은, 현미경을 설정 데이터 수집을 최적화 및 3 차원 데이터를 재구성하기 위해 촬영 한 이미지를 처리​​하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 예 이미지 (DG 그리어 등 ^(5)에 의해 개발 된 소프트웨어에 부분적으로 기반) 소프트웨어는 우리의 웹 사이트에 자유롭게 사용할 수 있습니다. 설명은 현미경을 구성 홀로그램으로부터 입체 볼륨을 재구성 및 소프트웨어 패키지를 추적 자유로운 선을 사용하여 그 생성 된 볼륨을 렌더링하기 위해 필요한 단계가 제공된다. 신문은 재건의 품질에 영향을 미치는 요인에 대한 논의와 결론한 경쟁 방법에 DIHM의 비교.

DIHM이 (김 ⁶ 참조, 그 원리와 개발의 일반적인 검토를 위해) 몇 시간 전에 설명했지만, 필요한 컴퓨팅 파워 및 이미지 프로세싱 전문 지식은 지금까지 대부분 기기 개발에 초점을 맞춘 전문 연구 그룹에의 사용을 제한하고있다. 이 상황은 컴퓨팅 및 카메라 기술에서의 최근 발전의 관점에서 변화하고 있습니다. 현대 데스크톱 컴퓨터는 쉽게 처리 및 데이터 저장 요구 사항에 대응할 수 있으며, CCD 또는 CMOS 카메라는 대부분 현미경 실험실에 존재하고, 필요한 소프트웨어 기술 개발에 시간을 투자 한 개에 의해 인터넷에서 자유롭게 이용 가능하게되고있다.

다양한 방식들은 입체 샘플 볼륨에 미세한 개체의 구성을 묘화 제안되어있다. 이들의 대부분은 화상의 스택이 m에 의해 기록되어있는, ^{7,8보기 기술을} 스캔 할echanically 샘플을 통해 영상면을 번역. 스캐닝 공 초점 형광 현미경은 아마도 가장 익숙한 예입니다. 통상적으로, 형광 염료는 샘플 콘트라스트의 허용 가능한 수준을 달성하기 위해 위상 객체에 추가하고, 공 초점 배열은 공간적으로 형광 발광성을 집중하기 위해 사용된다. 이 방법은 시스템 혼잡 ^9-11의 입체 역학에 대한 액세스를 허용 한 콜로이드 과학 분야에서, 예를 들어 상당한 진보되었다. 라벨의 사용은 형광 공 초점 현미경과 DIHM 사이의 중요한 차이가 있지만, 두 가지 기술의 다른 기능은 비교 가치가있다. DIHM이 장치는 움직이는 부분이없는 점에서 상당한 속도의 장점이 있습니다. 공 초점 시스템의 기계적 주사 거울은 데이터 획득 속도에 상한을두고 - 512 X 512 픽셀의 화상은 통상적으로 약 30 프레임 / 초. 다른 초점면에서 이러한 이미지의 스택 물리적 transl 얻을 수있다30 프레임 스택에 대한 초당 하나의 볼륨의 최종 캡처 속도로 이어지는, 프레임 사이의 샘플 단계 또는 대물 렌즈를 ating. 이에 비해, 현대 CMOS 카메라에 근거 홀로그램 시스템은 동일한 이미지 크기 및 해상도로 2000 프레임 / 초를 캡처 할 수 있으며, 각 프레임은 샘플 볼륨의 독립 스냅 샷을 제공하는 '오프라인'으로 처리된다. 반복하려면 시스템이 형광 대상 ^12의 홀로그램 재건을 수행하는 개발되었지만 형광 샘플, DIHM 필요하지 않습니다. 뿐만 아니라 입체적인 볼륨 정보가 DIHM 또한 정량적 위상차 이미지 ^(13)를 제공하는 데 사용될 수 있지만, 여기서는 설명의 범위를 벗어난다.

원시 DIHM 데이터 이미지는 두 가지 차원, 그리고 몇 가지 측면에 초점이기는하지만, 표준 현미경 이미지처럼 보이게. DIHM 표준 명 시야 현미경의 주요 차이점은 객체를 둘러싸 회절 고리에 놓여 IN 시야는, 이러한 조명의 특성에 기인한다. 일반적으로 LED 또는 레이저 - DIHM는 시야보다 더 일관성있는 소스가 필요합니다. 홀로그램의 회절 고리는 3 차원 화상을 재구성하는데 필요한 정보를 포함한다. 직접 피팅 및 수치 재 집중, DIHM 데이터를 해석하는 두 가지 방법이 있습니다. 첫번째 접근법은 사전에 ^3,4 회절 패턴의 수학적 형태가 알려진 경우에 적용 가능하다;이 조건은 구, 실린더, 반 평면 장애물 같은 간단한 객체 작은 소수에 의해 충족된다. 직접 피팅은 또한 개체의 축 방향 위치가 알려진 경우에 적용 가능하며, 화상은 화상 템플릿 ^(14)의 룩업 테이블을 이용하여 장착 할 수있다.

두 번째 방법 (숫자는 집속) 다소 더 일반적이며 수치로 광학 필드를 재구성 이차원 이미지 홀로그램에 회절 고리 사용에 의존샘플 볼륨에 걸쳐 (임의의 간격) 초점면의 수. 관련된 여러 방법이 ^{6 일을} 위해 존재 리와 그리어 ^(5)에 의해 설명 된대로이 작품은 다시 전파 기술을 레일리 - 좀머 펠트를 사용합니다. 이 절차의 결과는 수동 현미경 초점면 (따라서 이름`수치 집속 ')을 변화시키는 효과를 복제하는 이미지의 스택이다. 이미지의 스택이 생성되면, 초점 체적 피사체의 위치가 획득되어야한다. 이러한 로컬 강도 변동 또는 공간 주파수 내용 등의 화상 해석 추론의 수는, 시료 ^(15)에 다른 지점에서 포커스의 선명도를 수치화하기 위해 제시되었다. 특정 이미지 메트릭이 최대화 (또는 최소화) 할 때 각각의 경우에, 객체가 초점에있는 것으로 간주된다.

개체가 '포커스'는 특정 초점면을 확인하고자 다른 방식과는 달리,이 작품의 방법은 P를 선택합니다초점 평면의 넓은 범위에 걸쳐 연장 될 수있다 또한 오브젝트 내부 놓여 oints. 이 방법은 피사체의 넓은 범위에 적용 가능하며 봉상 콜로이드, 박테리아의 사슬 또는 진핵 편모 같은 확장 약하게 산란 샘플 (위상 개체)에 특히 적합하다. 개체가 초점 평면을 통과 할 때 이러한 샘플 화상 콘트라스트 변화, 그것은 다른에있는 경우 개체가 초점면과 어두운 센터의 일측에있는 경우 defocused 표시 화상 광 중심을 갖는다. 그들은 초점면에 정확하게 거짓말을 할 때 순수한 위상 객체는 명암이 거의있다. 대비 반전이 현상은 다른 저자 ^{(16, 17)에} 의해 논의 인해 이상 ¹⁸ GOUY 단계로 궁극적으로하고 있습니다. 이 밖에, 기술의 한계가 평가되는 곳 홀로그래피의 맥락에서보다 엄격한 입장에서 투입되어, 위치에 일반적인 불확실성이 EAC에서 150 nm의 (약 1 픽셀)의 순서이다H 방향 ^19. GOUY 상 이상 방법은 세 가지 차원에서 확장 된 개체의 구조를 결정하는 몇 가지 잘 정의 된 DIHM 방식 중 하나이지만, 그럼에도 불구하고 일부 개체는 재구성 할 문제가 있습니다. (카메라를 가리키는) 광학 축에 직접 거짓말을 객체를 정확하게 재구성하기 어려운, 물체의 길이와 위치에 불확실성이 커질. 이러한 제한으로 인해, 홀로그램 (카메라가 기록 할 수있는 별개의 그레이 레벨의 수)를 기록 화소의 제한된 비트 깊이로 부분적이다. 관심의 대상은 초점면에 매우 가까이있을 때 또 다른 문제가 구성이 발생합니다. 이 경우, 오브젝트의 실제 및 가상 이미지를 해석하기 어려운 복잡한 광학 필드를 야기한, 근접 재구성된다. 여기서 제 약간 덜 중요한 관심사 얻어진 회절 프린지이 성긴 INF보기 이미지 센서의 적은을 점유하고 있다는 것이다ormation는 가난한 품질의 재건에 이르게한다.

실제로, 간단한 그라데이션 필터는 상기 조명 방향으로 강한 강도 반전을 검출하도록 삼차원 재구성 된 볼륨에인가된다. 강도가 어두운, 또는 그 반대로 빛을 신속하게 변경 지역은 다음 산란 지역과 연결되어 있습니다. 이러한 개별 기여 합 쉽게 레일리 - 좀머 펠트 다시 전파 방법을 사용하여 반전 총 흩어져있는 필드를 제공하기 위해, 약하게 산란 개체가 아니라 같은 요소 ^(20)의 비 간섭의 컬렉션으로 설명되어 있습니다. 본 논문에서는 축 강도 그라데이션 기법은 연쇄상 구균 세포의 체인에 적용된다. 세포체는 위상 객체이다 (종 E. 콜라이가 파장 λ = 589 ㎚에서 1.384로 ^(21)를 측정 한 굴절률을 가지고, 스트렙토 코커스 균주 유사 할 가능성이있다)와 접속하는 얼룩 고강도 사슬로 나타나는 일그라데이션 필터 후의 E 샘플 볼륨이 적용되었다. 이 필터링 된 볼륨에 적용되는 기본 임계 값 및 기능 추출 방법은 세포 내부의 지역에 해당하는 부피 픽셀 (복셀)를 추출 할 수 있습니다. 이 방법의 특별한 장점은 축 방향으로 객체의 위치를​​ 모호 재구성을 허용한다는 것이다. 비슷한 방법은 (적어도, 현미경 목표를 통해 이미지가 개체에 가까운 그 기록하는 홀로그램은)이 변위의 기호를 확인할 수없는 단점이있다. 레일리 - 좀머 펠트 재건 방법도 있지만 서명에 관계없이 이러한 의미에서, 그라데이션 작업은 우리가 초점면에서 위 아래로 약한 단계의 개체를 구별 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 설정 및 데이터 수집

1. 냉동 보관 ^{(22)로부터} 구균 균주 V4051-197 KTY 매체 (부드러운 수영) 세포의 문화를 성장. 포화, 35 ° C에서 150 rpm에서 하룻밤 회전 통에 품어.
2. 포화 문화의 500 μL 신선한 KTY 매체의 10 ㎖를 접종한다. 세포가 λ = 600 nm의 (약 5 ^× 108 세포 / ml)에서 약 1.0의 광학 밀도에 도달 할 때까지 35 ° C, 150 rpm에서 추가로 3.5 시간 동안 배양한다.
3. 운동성 세포의 최종 농도를 얻기 위해 신선한 배지에서 1:400 희석.
4. 현미경 슬라이드에 높이 1 ㎜의 주위에 (예를 들어 석유 젤리로 가득 주사기부터) 그리스의 고리를 만들어 중앙에 시료 용액 한 방울을 배치합니다. 밀봉 가장자리에 가기를 눌러 가볍게 커버 유리를 놓고, 그 액체를 보장하는 슬라이드 및 커버 유리 모두와 접촉한다. 그 결과 샘플 챔버는 arou에 있어야한다깊이 차 100 ~ 200 μm의.
5. 유리와 렌즈 사이의 오일의 기포의 형성을 방지하기 위해주의 깊게 커버 유리가 아래를 향 현미경 샘플 챔버를 배치하고.
6. 샘플 챔버의 바닥면에 현미경을 집중하고, 집중 응축기를 가져온다.
7. 표준 조명을 끄고 현미경의 콘덴서 구멍 뒤에 LED 헤드를 배치합니다. 최대 출력의 LED 전원 공급 장치를 설정합니다.
8. 그 한도 내에서 콘덴서 조리개를 닫고, 필요한 경우 조명이 대물 렌즈의 조리개를 중심으로 될 때까지, 그 산에있는 LED를 슬쩍 찌르다.
9. 컴퓨터와 카메라를 전환하고 현미경의 카메라 포트에 모든 빛을 리디렉션합니다. 화상 획득 소프트웨어에 프레임 레이트 및 화상 크기를 조정한다.
10. 여전히 양호한 콘트라스트를 유지하면서 가능한 한 프레임 노출 시간을 짧게한다. 화상 채도가되지 않도록 이미지 세기 히스토그램을 점검테드 또는 노출.
11. 필요한 경우 그 개체가 약간 (일반적으로 10 ~ 30 μm의에 의해) 디 포커스되도록 현미경을 집중할. 개체와 초점면 (즉, 초점면 샘플 챔버 내부 거짓말을한다) 같은 매체에 있어야합니다.

2. 재건

처리 된 데이터의 첫 번째 단계는 수치 적 영상의 스택을 제조, 다른 깊이의 시리즈에서 비디오 프레임을 집중할 것이다. 이 작업을 수행하기위한 사용자 친화적 인 소프트웨어는 여기에서 찾을 수있다 http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html (거꾸로 현미경을 사용하여 획득하고, 60X 기름 침지 대물 렌즈) 예를 이미지와 함께 와 레이의 장면 파일 렌더링을 추적.

1. 인터페이스의 해당 상자에 입력 관심 프레임과 별도의 이미지 파일로 각각의 배경. 배경 이미지는 프레임 F 그airly는 홀로그램 부재에서, 동영상의 배경을 나타내고, 홀로그램 지역화 및 분석을 방해 할 수있는 임의의 고정 패턴 잡음을 억제하기 위해 사용될 것이다.
2. 프로그램을 실행하기 전에 화면 왼쪽 전역 설정 상자에 값을 입력. 처음 세 개의 출력 스택 매개 변수입니다 : 첫 번째 프레임의 축 방향 위치 ( '초점을 시작합니다'); 재구성 스택의 조각의 수 ( '스텝 수') 스택의 각 조각 사이의 축 방향 거리 ( '스텝 크기') .
3. 정확한 비율을 가진 객체를 재구성하기 위해, 스텝 크기는 횡 방향의 화소 간격과 같은 크기이어야한다. 마지막 두 상자의 '픽셀 / 마이크론 상자, 조명 파장과 중간 굴절률에 카메라의 측면 샘플링 주파수 (1/pixel 간격)를 입력합니다. 이 프로그램의 기본 값은 예를 들어 데이터를 재구성하기에 적합합니다.
4. '플립 Z-그라데이션'버튼을 누르면 OBJE의 중심CT는 홀로그램에 어두운 (예 : 프레임 2005 자세한 내용은 설명 절을 참조하십시오).
5. 온 / 오프 상태에서 대역 통과 필터를 확인하십시오 (기본값입니다). 그라데이션 플립 스위치 아래의 박스에있는이 선택적 대역 통과 필터는 노이즈 픽셀의 기여를 억제하기위한 책임이 있습니다. 대역 통과 필터가 즉시 생성 후에 각 이미지 슬라이스에 적용된다.
6. 온 / 오프 상태 (기본값입니다)의 중간 출력 스위치를 확인합니다. 중간 분석 단계는 비 압축으로, 두 개의 출력 비디오에 기록 된 AVI 파일 :. 첫 번째는 다시 초점을 스택 ( '_stack.avi'로 끝나는 파일 이름), 두 번째는 축 방향 구배 작업 후 스택입니다 (파일 이름이 끝나는 '입니다 _gradient.avi '). 이상적으로,이 두 번째 스택은 관심의 대상이 어두운 배경에 밝은 물체로 강조가 포함됩니다.
7. 메인 창에 모든 매개 변수를 눌러 '실행'을 설정 한 후. 선택된 프레임은 소프트웨어의 주요 상자에 나타납니다.
8. 사용(왼쪽 클릭) 확대와 (+ 왼쪽 클릭을 이동) 축소 할 이미지의 왼쪽에있는 도구 모음에서 발견 돋보기 도구입니다. 관심 (ROI)의 지역을 선택하려면 도구 모음에서 사각형 도구를 사용합니다. 이 재건을 최적화하므로, 사각형 내부 가능한 홀로그램의 변두리의 많은 캡처.
9. 두 이미지 스택을 생성하는 '프로세스'버튼을 누릅니다. (에서 무료로 얻을 수있다 ImageJ에 사용하여 결과 스택 검사 http://rsb.info.nih.gov/ij/을 ). 또한 개체가 명확 그라데이션 화상 스택에서 알 수있는 경우에, 오브젝트의 좌표를 추출하는 다음 단계로 진행한다.

3. 표현

1. 프레임 재 집속 게다가,이 프로그램은 x, y, z는 또한 개체의 각 복셀에 대한 좌표를 찾을 수있다. 이 기능을 활성화하기 위해 '특징 추출'버튼을 누릅니다.
2. 를 들어, ( 홈 의 output.inc : 예 : C) 확장을 포함하는 경로를 입력출력 파일을 조정합니다. '출력 스타일을 좌표'상자에 'POV-레이 스타일'을 선택합니다. 이것은 프로그램 (로부터 얻어 질 수없는 POV-레이 광선 추적 소프트웨어 패키지를 사용하여 시각 할 수 오브젝트 파일 작성하는 원인 을 http://www.povray.org/ ).
3. 위의 섹션 2와 이미지를 다시 처리합니다. 프로그램은 '출력 좌표'박스에서 파일 이름에 기록 (x, y, z)의 일련의 선택된 ROI 좌표를 제공 할 것이다. 객체 좌표의 추출 스택 세대보다 훨씬 더 오래 걸립니다.
4. 좌표가 바로 생성 된 파일로 (재건 코드를 함께 제공) 샘플 POV-레이 파일이 같은 폴더에 있는지 확인하십시오. 샘플. POV 파일을 편집하고 줄에 인용 부호에 파일 이름을 대체
   # "는 MYFILE.inc"를 포함
   재구성 코드에 의해 생성 된 데이터 파일의 이름.
5. 비트 맵 이미지를 렌더링하는 POV-레이에서 '실행'버튼을 클릭합니다. 티그는 카메라 위치, 조명 및 질감 옵션 POV-레이에서 가능한 사용자 지정의 몇 가지 있습니다, 자세한 내용은 온라인 설명서를 참조하십시오.

결과

DIHM의 기능을 설명하기 위해, 실험은 스트렙토 코커스 박테리아의 체인에서 수행 하였다. 체인 자체가 길이 10.5 mm를 측정하고, 범위 0.6-1 μm의에서 직경 6-7 sphero 원통형 셀 (체인에있는 세포의 두 가지 분열에 가까운)으로 구성되었다. 1A 및도 주요 인터페이스를 보여 1B 재건 및 렌더링 소프트웨어. 수치 집속 절차의 예는 공간적 대역 통과 필터가 적용된 경우,...

토론

이 시험용 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 안정된 실험 장치에서 이미지의 정확한 캡처이다. 가난한 배경 데이터, 높은 정확도의 재건은 불가능 옆에 있습니다. 이것이 재구성 된 이미지를 저하시킬 수로서, (대물의 뒤쪽을보고 어두운 고리로서 표시) 내부 위상차 소자와 대물 렌즈를 방지하는 것도 중요하다. 그 목적은 회절 줄무늬의 몇 쌍 (적절한 추론 defocused 표시 패턴이 포커스가있는 객체...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362