Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

Resumen

Las ubicaciones tridimensionales de objetos débilmente-dispersión puede ser identificada usando microscopía holográfica digital de línea (MHDL), que implica una modificación menor a un microscopio estándar. Nuestro software utiliza una heurística simple de formación de imágenes junto con Rayleigh-Sommerfeld de propagación hacia atrás para producir la posición en tres dimensiones y la geometría de un objeto de fase microscópica.

Resumen

Objetos débilmente-dispersión, tales como pequeñas partículas coloidales y la mayoría de las células biológicas, se encuentran con frecuencia en la microscopía. De hecho, una amplia gama de técnicas se han desarrollado para visualizar mejor estos objetos de fase; de ​​contraste de fases y DIC se encuentran entre los métodos más populares para mejorar el contraste. Sin embargo, la grabación de posición y la forma en la dirección fuera de la proyección de imagen del plano sigue siendo un reto. Este informe presenta un método experimental sencillo para determinar con precisión la ubicación y la geometría de los objetos en tres dimensiones, utilizando microscopía holográfica digital de línea (MHDL). En términos generales, el volumen de muestra accesible se define por el tamaño del sensor de la cámara en la dirección lateral, y la coherencia de iluminación en la dirección axial. Volúmenes de las muestras típicas oscilan entre 200 micras x 200 m x 200 m utilizando iluminación LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm o más grande, utilizando iluminación láser. Esta luz de iluminación está configurado de manera que las ondas planas son incidente sobre la muestra. Los objetos en el volumen de la muestra y luego dispersan la luz, lo cual interfiere con la luz dispersada para formar patrones de interferencia perpendicular a la dirección de la iluminación. Esta imagen (el holograma) contiene la información de profundidad requerida para la reconstrucción en tres dimensiones, y puede ser capturado en un dispositivo estándar de formación de imágenes tal como un CMOS o una cámara CCD. El método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld se emplea para reorientar numéricamente imágenes de microscopio, y un simple heurística de imagen basado en la fase de Gouy anomalía se utiliza para identificar la dispersión de objetos dentro del volumen reconstruido. Este método simple pero robusta resulta en una medición inequívoca, modelo libre de la ubicación y la forma de los objetos en muestras microscópicas.

Introducción

Línea digital microscopía holográfica (MHDL) permite rápida obtención de imágenes tridimensionales de muestras microscópicas, tales como microorganismos natación ^1,2 y sistemas de materia blanda ^{de 3,4,} con una mínima modificación a una configuración de microscopio estándar. En este trabajo se ofrece una demostración pedagógica de MHDL, en torno a un software desarrollado en nuestro laboratorio. Este documento incluye una descripción de cómo configurar el microscopio, optimizar la adquisición de datos y procesar las imágenes grabadas para reconstruir los datos en tres dimensiones. El software (basado en parte en software desarrollado por la DG Grier y otros ⁵⁾ y imágenes de ejemplo están disponibles gratuitamente en nuestro sitio web. Se describen los pasos necesarios para configurar el microscopio, reconstruir volúmenes tridimensionales a partir de hologramas y rendir los volúmenes resultantes de interés utilizando un rayo libre de rastreo de paquete de software. El artículo concluye con una discusión de los factores que afectan la calidad de la reconstrucción, Y una comparación de MHDL con métodos que compiten.

Aunque MHDL se describió hace algún tiempo (para una revisión general de sus principios y el desarrollo, ver Kim ^6), la potencia de cálculo necesaria y la experiencia de procesamiento de imágenes que hasta ahora se ha limitado en gran medida su uso a grupos de investigación especializados, con un enfoque en el desarrollo de instrumentos. Esta situación está cambiando a la luz de los últimos avances en informática y tecnología de la cámara. Computadoras de escritorio modernas pueden hacer frente fácilmente con los requisitos de almacenamiento de datos y procesamiento; cámaras CCD o CMOS están presentes en la mayoría de los laboratorios de microscopía, y el software necesario se está a libre disposición en Internet por parte de grupos que han invertido tiempo en el desarrollo de la técnica.

Se han propuesto varios esquemas para obtener imágenes de la configuración de los objetos microscópicos en un volumen de muestra de tres dimensiones. Muchos de estos están escaneando técnicas ^7,8, en el que una pila de imágenes es registrado por mechanically traducir el plano de la imagen a través de la muestra. Microscopía de fluorescencia confocal de barrido es quizás el ejemplo más conocido. Típicamente, se añade un colorante fluorescente a un objeto de fase con el fin de lograr un nivel aceptable de contraste de la muestra, y la disposición confocal utiliza para localizar espacialmente la emisión fluorescente. Este método ha dado lugar a avances significativos, por ejemplo en la ciencia coloidal donde se ha permitido el acceso a la dinámica en tres dimensiones de sistemas de hacinamiento ^09.11. El uso del etiquetado es una diferencia importante entre la microscopía confocal de fluorescencia y MHDL, pero otras características de las dos técnicas son dignos de ser comparados. MHDL tiene una significativa ventaja de velocidad en que el aparato no tiene piezas móviles. Los espejos de barrido mecánico en los sistemas confocales ponen un límite superior en la velocidad de adquisición de datos - por lo general alrededor de 30 cuadros / seg una imagen de píxeles 512 x 512 para. Una pila de tales imágenes de diferentes planos focales se puede conseguir por físicamente translAting la etapa de la muestra o lente de objetivo entre los marcos, que conduce a una tasa de captura final de alrededor de un volumen por segundo para una pila 30 de trama. En comparación, un sistema holográfico sobre la base de una cámara CMOS moderno puede capturar 2000 cuadros / seg en el mismo tamaño y resolución de la imagen; cada trama se procesa `desconectado 'para dar una instantánea independiente del volumen de muestra. Para reiterar: muestras fluorescentes no son necesarios para MHDL, aunque un sistema ha sido desarrollado que realiza la reconstrucción holográfica de un sujeto fluorescente ^12. Además de la información de volumen tridimensional, MHDL también puede ser utilizado para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativa ^13, pero que está más allá del alcance de la discusión aquí.

Imágenes de datos Raw Dihm son de dos dimensiones, y en algunos aspectos se parecen a las imágenes de microscopio estándar, aunque fuera de foco. La principal diferencia entre MHDL y microscopía de campo claro estándar está en los anillos de difracción que rodean a los objetos in el campo de vista, que son debido a la naturaleza de la iluminación. MHDL requiere una fuente más coherente que en campo claro - por lo general un LED o láser. Los anillos de difracción en el holograma contienen la información necesaria para reconstruir una imagen tridimensional. Hay dos enfoques principales para la interpretación de datos; MHDL reorientación y adaptación numérica directa. El primer enfoque es aplicable en los casos en que la forma matemática de la figura de difracción se conoce de antemano ^3,4; esta condición se cumple por un pequeño puñado de objetos simples como esferas, cilindros, y los obstáculos semiplano. Montaje directo también es aplicable en los casos en que se conoce posición axial del objeto, y la imagen se puede montar usando una tabla de búsqueda de plantillas de la imagen ^14.

El segundo enfoque (reorientación numérica) es bastante más general y se basa en el uso de los anillos de difracción en la imagen del holograma de dos dimensiones para reconstruir numéricamente el campo óptico enun número de espaciados (arbitrariamente) planos focales en todo el volumen de la muestra. Existen varios métodos relacionados para hacer esto ^6; este trabajo se utiliza el Rayleigh-Sommerfeld volver técnica de propagación según lo descrito por Lee y Grier ^5. El resultado de este procedimiento es una pila de imágenes que reproducen el efecto de cambiar manualmente el plano focal del microscopio (de ahí el nombre de `reorientación numérica '). Una vez que una pila de imágenes ha sido generada, se debe obtener la posición del sujeto en el volumen focal. Una serie de heurísticas de análisis de imágenes, tales como la varianza intensidad local o el contenido de frecuencia espacial, se han presentado para cuantificar la agudeza de enfoque en diferentes puntos de la muestra ^15. En cada caso, cuando se maximiza una métrica imagen en particular (o minimizar), el objeto se considera que está en el foco.

A diferencia de otros sistemas que tratan de identificar a un plano focal particular cuando un objeto es 'in focus', el método en este trabajo escoge points que se encuentran en el interior del objeto de interés, que pueden extenderse a través de una amplia gama de planos focales. Este enfoque es aplicable a una amplia gama de temas y es particularmente adecuado para extendidos, muestras débilmente-dispersión (objetos) de fase, tales como coloides en forma de varilla, cadenas de bacterias o flagelos eucariota. En estas muestras el contraste de la imagen cambia cuando el objeto pasa a través del plano focal; una imagen desenfocada tiene un centro de luz si el objeto está en un lado del plano focal y un centro oscuro si está en el otro. Objetos de fase puros tienen poco o ningún contraste cuando mienten exactamente en el plano focal. Este fenómeno de inversión de contraste ha sido discutido por otros autores ^16,17 y es, en última instancia debido a la fase de Gouy anomalía ^18. Esto ha sido puesto sobre una base más rigurosa en el contexto de la holografía en otros lugares, donde se evalúan los límites de la técnica, la incertidumbre típica de posición es del orden de 150 nm (aproximadamente un pixel) en each Dirección ^19. El método de anomalía fase Gouy es uno de los pocos esquemas Dihm bien definidos para la determinación de la estructura de los objetos extendidos en tres dimensiones, pero sin embargo algunos objetos son problemáticos para reconstruir. Los objetos que se encuentran directamente en el eje óptico (señalando a la cámara) son difíciles de reconstruir con precisión; las incertidumbres en la longitud y la posición del objeto se hacen grandes. Esta limitación se debe en parte a la profundidad de bits restringido de los píxeles de grabación del holograma (el número de niveles de gris diferentes que la cámara puede grabar). Otra configuración problemática se produce cuando el objeto de interés es muy cerca del plano focal. En este caso, las imágenes reales y virtuales del objeto son reconstruidas en estrecha proximidad, dando lugar a campos ópticos complicados que son difíciles de interpretar. Un segundo, un poco menos importante preocupación aquí es que las franjas de difracción resultantes ocupan menos del sensor de imagen, y esta inf más gruesa de granoormación conduce a una reconstrucción de peor calidad.

En la práctica, un filtro de gradiente simple se aplica a los volúmenes tridimensionales reconstruidas para detectar fuertes inversiones de intensidad a lo largo de la dirección de iluminación. Regiones donde la intensidad cambia rápidamente de claro a oscuro, o viceversa, se asocian a regiones de difracción. Objetos débilmente-dispersión se describen bien como una colección que no interactúan de tales elementos ^20, los cuales suma contribuciones individuales para dar al campo dispersado total que se invierte fácilmente utilizando el método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld. En este trabajo, la técnica de gradiente de intensidad axial es aplicada a una cadena de células de Streptococcus. Los cuerpos celulares son objetos de fase (la especie de E. coli tiene un índice de refracción medido ²¹ a ser 1,384 a una λ = 589 nm longitud de onda; la cepa de Streptococcus es probable que sean similares) y aparecerá como una cadena de alta intensidad de gotas conectados en ªvolumen de muestra e después del filtro de gradiente se ha aplicado. Métodos de extracción de umbral y característica estándar aplicadas a este volumen filtrado permiten la extracción de píxeles volumétricos (voxels) corresponden a la región dentro de las células. Una ventaja particular de este método es que permite la reconstrucción no ambigua de la posición de un objeto en la dirección axial. Métodos similares (por lo menos, aquellos que registran los hologramas cerca del objeto, fotografiados a través de un objetivo de microscopio) sufren al no poderse determinar el signo de este desplazamiento. Aunque el método de reconstrucción de Rayleigh-Sommerfeld es también firme-independiente en este sentido, la operación de gradiente nos permite discriminar entre objetos de fase débiles por encima y por debajo del plano focal.

Protocolo

1. Configuración y Adquisición de Datos

1. Haga crecer una cultura de la cepa de Streptococcus células (natación suave) en medio KTY V4051-197 desde el almacén congelado ^22. Incubar en un agitador rotatorio durante la noche a 35 ° C y 150 rpm, a la saturación.
2. Inocular 10 ml de medio KTY fresco con 500 l de la cultura saturada. Incubar durante una 3,5 h más a 35 ° C y 150 rpm hasta que las células alcanzan una densidad óptica de aproximadamente 1,0 en λ = 600 nm (aproximadamente 5 x 10 ⁸ células / ml).
3. Diluir 1:400 en medio fresco para obtener la concentración final de células móviles.
4. En un portaobjetos de microscopio, hacer un anillo de grasa (por ejemplo, de una jeringa llena de vaselina) alrededor de 1 mm de altura y colocar una gota de la solución de la muestra en el centro. Coloque una cubierta de vidrio en la parte superior y presione ligeramente en los bordes para sellar, lo que garantiza que el líquido está en contacto tanto con portaobjetos y cubreobjetos. La cámara de muestra resultante debe ser Arouº 100-200 micras de profundidad.
5. Coloque la cámara de muestra en el microscopio con el vidrio de cubierta hacia abajo, y con cuidado, para evitar la formación de burbujas de aire, en el aceite de entre el vidrio y la lente.
6. Enfocar el microscopio en la superficie inferior de la cámara de muestra, y llevar el condensador para enfocar.
7. Apague la iluminación estándar y coloque el cabezal del LED detrás de la apertura del condensador del microscopio. Establezca la fuente de alimentación del LED para la salida máxima.
8. Cierre la apertura del condensador en toda su extensión, y si es necesario, empujar el LED en su montura hasta que la iluminación se centra en la abertura de la lente objetivo.
9. Encienda el ordenador y la cámara, y reorientar toda la luz al puerto de la cámara del microscopio. Ajuste la velocidad de fotogramas y el tamaño de la imagen en el software de adquisición de imágenes.
10. Hacer que el tiempo de exposición marco lo más corto posible mientras que todavía conserva un buen contraste. Echa una intensidad histograma de la imagen para que la imagen no es la saturaciónted o subexpuesta.
11. Si es necesario, vuelva a enfocar el microscopio para que objeto de interés es ligeramente desenfocado (típicamente un 10-30 micras). El objeto y el plano focal debe estar en el mismo medio (es decir el plano focal debe estar dentro de la cámara de muestra).

2. Reconstrucción

El primer paso de procesamiento de datos es volver a centrar numéricamente un fotograma de vídeo en una serie de diferentes profundidades, la producción de una pila de imágenes. Software de fácil uso para hacer esto se puede encontrar aquí: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html junto con imágenes de ejemplo (adquiridos usando un microscopio invertido, y una inmersión en aceite lente objetivo de 60X) y un archivo de escena para ray remontar renderizado.

1. Ingrese el marco de su interés y su respectivo fondo como archivos de imagen independientes, en las casillas correspondientes en la interfaz. Una imagen de fondo es una trama que fAirly representa el fondo de la de vídeo, en ausencia del holograma, y ​​se puede usar para suprimir el ruido de patrón fijo que podrían interferir con la localización holograma y análisis.
2. Introduzca valores en los cuadros de configuración global en el lado izquierdo de la pantalla antes de ejecutar el programa. Los tres primeros son parámetros de chimenea de salida: Posición axial del primer cuadro ('Iniciar enfoque'); número de cortes en la pila reconstruido ("Número de pasos"), la distancia axial entre cada rebanada en la pila ("Tamaño del paso ') .
3. Con el fin de reconstruir los objetos con las proporciones correctas, el tamaño de paso debe ser del mismo tamaño que la separación de píxeles lateral. Introduzca la frecuencia de muestreo lateral de la cámara (el espaciado 1/pixel) en el cuadro de "pixel / micron ', la longitud de onda de la iluminación y el índice de refracción medio en las dos últimas cajas. Valores predeterminados del programa son apropiados para la reconstrucción de los datos de ejemplo.
4. Pulse el botón 'Flip Z-pendiente' si el centro de la object es oscuro en el holograma (véase el ejemplo del marco de 2005 y la sección de discusión para más detalles).
5. Revise el filtro de paso de banda en estado / apagado (por defecto es activado). Este filtro de paso de banda opcional, situado en una caja debajo del interruptor de gradiente-flip, es responsable de la supresión de la contribución del ruido píxeles. El filtro de paso de banda se aplica a cada corte de imagen inmediatamente después de la generación.
6. Compruebe el interruptor de salida intermedia estados activado / desactivado (por defecto está activado). Pasos de análisis intermedio se escriben en dos videos de salida, como sin comprimir archivos AVI:. La primera es la pila reorientado (nombre de archivo que termina en '_stack.avi'), la segunda es la pila después de la operación de gradiente axial (nombre de archivo con extensión ' _gradient.avi '). Idealmente, esta segunda pila contendrá el objeto de interés destacó como un objeto brillante contra un fondo oscuro.
7. Después de configurar todos los parámetros, presione "Ejecutar" en la ventana principal. El marco seleccionado aparecerá en el cuadro principal del software.
8. Utilice elmagnificar herramienta vidrio que se encuentra en la barra de herramientas a la izquierda de la imagen para ampliarla (clic izquierdo) y alejar (shift + clic izquierdo). Utilice la herramienta de rectángulo en la barra de herramientas para seleccionar una región de interés (ROI). Capturar la mayor cantidad de franjas de holograma como sea posible dentro del rectángulo, ya que esto optimizar la reconstrucción.
9. Pulse el botón de "Proceso" para generar las dos pilas de imágenes. Inspeccione las pilas resultantes utilizando ImageJ (que se puede obtener de forma gratuita en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Si el objeto de interés se puede ver claramente en la pila de imagen de gradiente, continúe con el siguiente paso para extraer las coordenadas del objeto.

3. Representación

1. Además de la reorientación marco, este programa puede localizar el x, y, z las coordenadas para cada voxel en el objeto de interés. Pulse el botón 'Extracción de características "para activar esta función.
2. Escriba una ruta, incluyendo la extensión (por ejemplo: c: home output.inc), para lasalida coordina archivo. Seleccione 'estilo POV-Ray "en la caja" de coordenadas de salida estilo'. Esto hace que el programa para escribir un archivo de objeto que puede ser visualizado utilizando el paquete de software libre raytracing del POV-Ray (que se puede obtener de http://www.povray.org/ ).
3. Vuelva a procesar las imágenes como en el apartado 2 anterior. El programa ofrecerá una serie de (x, y, z) las coordenadas en el ROI seleccionada, escrito al nombre del archivo en el cuadro de 'Salida de coordenadas ". La extracción de coordenadas del objeto tarda mucho más que la generación de pila.
4. Asegúrese de que el archivo de POV-Ray muestra (se entrega con el código de la reconstrucción) se encuentra en la misma carpeta que el archivo de coordenadas sólo generan. Edite el archivo pov muestra. Y reemplazar el nombre de archivo entre comillas en la línea
   # Include "MYFILE.inc"
   con el nombre del archivo de datos generado por el código de la reconstrucción.
5. Haga clic en el botón "Ejecutar" en POV-Ray para hacer una imagen de mapa de bits. Tque la posición de la cámara, la iluminación y opciones de textura son sólo algunas de las personalizaciones posibles en POV-Ray, consulte la documentación en línea para obtener más información.

Resultados

Para demostrar las capacidades de MHDL, los experimentos se realizaron en una cadena de bacterias Streptococcus. La propia cadena mide 10,5 mm de largo, y se compone de 6-7 células esfero-cilíndrica (dos de las células en la cadena están cerca de dividiendo) con diámetros en el intervalo 0,6-1 micras. Las figuras 1a y 1b muestran la interfaz principal de la reconstrucción y el software de renderización. Ejemplos del procedimiento de reorientación numérica se ven en

Discusión

El paso más importante en este protocolo experimental es la captura precisa de las imágenes de un montaje experimental estable. Con los pobres datos de fondo, reconstrucción de alta fidelidad es casi imposible. También es importante evitar lentes de objetivo con un elemento de contraste de fase interna (visible como un anillo oscuro cuando se mira a través de la parte posterior del objetivo), ya que esto puede degradar la imagen reconstruida. El objeto de interés debe ser lo suficientemente lejos del plano focal q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362