代谢标记和膜分馏的比较蛋白质组学分析<em&gt;拟南芥</em&gt;悬浮细胞培养

摘要

在这里，我们描述了植物细胞质膜的基础上，未标记的混合物分馏成耐洗涤剂和清洁剂的可溶性和膜在体内完全^{15 N}标记的拟南芥细胞培养一个强大的方法。该过程被施加于比较蛋白质组学研究，了解信令进程。

摘要

质膜微区是基于所述脂质和甾醇环境中的物理性质的功能，并有在信令进程特定角色。从植物细胞中提取甾醇富集的膜微区用于蛋白质组分析是一项艰巨的任务，主要是由于多个制备步骤和来源自其它细胞区室的污染。质膜构成大约只有5-20％的在植物细胞中的所有膜的，因而高度纯化的质膜组分的分离是具有挑战性的。经常使用的方法涉及水性两相分配中的聚乙二醇和葡聚糖，这将产生质膜囊泡为^95％1的纯度。质膜内固醇丰富的膜微区是不溶性后用冷的非离子型洗涤剂在碱性pH下处理。此耐洗涤剂膜组分可以从散装质膜中作为分离通过超速离心ucrose梯度^2。其后，蛋白质可以提取从由甲醇/氯仿沉淀的蔗糖梯度密度低频段。提取的蛋白质将被胰蛋白酶消化，脱盐，最后用LC-MS/MS分析。我们的提取协议甾醇富集微区被优化用于从拟南芥细胞培养清洁洗涤剂性膜级分的制备方法。

我们利用拟南芥悬浮细胞培养的全代谢标记为K ¹⁵ NO ₃作为唯一的氮源为后续生物处理的利息³定量比较蛋白质组学研究。通过将标记和未标记的细胞培养物进行联合蛋白质提取的相等比例对最终定量结果的制备步骤的影响被保持在最低限度。还材料的提取过程中的损失将影响控制和以同样的方式处理的样品，一个ð因此光线和升沉肽的比率将保持不变。在所提出的方法无论是标记的或未标记的细胞培养物经历了一个生物处理，而另一作为控制^4。

引言

1972年，乔纳森歌手和加思尼科尔森提出的流体镶嵌模型细胞膜的结构模型，替换被普遍接受的20世纪60年代初的蛋白质 - 脂质 - 蛋白质三明治模型。歌手和尼科尔森推测，生物膜可以被认为是一个两维的液体，所有的脂质和蛋白质分子的自由和方便⁵扩散。自那时起，该膜组合物的质膜和知识的结构模型变得更加复杂。特别是，在质膜内，结构，例如蛋白质复合物和脂质/固醇基础结构紊乱的微区可以观察到。在仿真模型膜^6,7，固醇和鞘脂可以横向与其他脂类物质分离，形成区域与改变的物理特性。细胞膜内偏析这主要是由甾醇及高度SA之间的自相关联的属性phopsho和鞘脂⁸的turated烃链。特别是，刚性甾醇环青睐与硬，直饱和脂质种类以及这些相互作​​用迫使邻近的烃链为更长时间的构象，增加膜的厚度和硬度的相互作用。

之一的甾醇富集的膜微区中通常观察到的特征是其不溶性，在治疗与非离子洗涤剂如曲通X-100或的Brij 35。这些组分被认为是相同的膜微区，并根据其生化制备方法^2，被称为耐洗涤剂膜（DRM）。非离子型洗涤剂的DRM提取过程中使用接收到的一些批评作为生化DRM制剂可以不直接对应于活细胞⁹中的任何特定的膜隔室。特别是，所述洗涤剂蛋白质比率似乎在这类制剂是至关重要的，一s个不同的清洁剂，以及不同量的洗涤剂可以产生不同的耐洗涤剂的膜部分¹⁰的组合物。然而，有证据表明，特定蛋白的物种特异性与这些细胞的甾醇富集膜域相关联，并且这些蛋白质以及富含洗涤剂耐膜部分¹¹的生化制剂。被发现在植物的DRM级分，并针对其存在的DRM中是固醇依赖性蛋白质的核心，是特别GPI锚定的蛋白质，如fasciclin状阿拉伯半乳聚糖蛋白（FLAS）和SKU蛋白家族的成员。也有一些信号蛋白，如受体样激酶或磷脂酶被发现^11。这些结果与对哺乳动物的膜微区^12,13许多蛋白质组研究是一致的。此外，在植物有越来越多的证据表明膜微的应激反应¹⁴方面的作用^-16。

这里所描述的协议提供了一个可靠的方法对质膜微区分离，特别是使用蛋白质洗涤剂浓度，使我们能够描绘固醇丰富的膜隔^4,11,14应激诱导的改变。

研究方案

程序

在提取协议中常用的试剂和缓冲液：

1. 喷气推进实验室的培养基拟南芥悬浮细胞培养
   • 3μM的H ₃ BO ₃
   • 3微米硫酸锰_{4×H 2 O}的
   • 1.1微米的ZnSO _4×7 H _{2 O}
   • 0.15微米KJ
   • 0.03微米的Na ₂的MoO _4×2 H _{2 O}的
   • 3纳米氯化钴_2×6 H _{2 O}
   • 3纳米硫酸铜_4×5 H _{2 O}
   • 0.9毫米氯化钙_2×2 H _{2 O}的
   • 0.5毫米硫酸镁_4×7 H _{2 O}
   • 0.5微米的FeSO _4×7 H _{2 O}
   • 0.5微米的Na ₂ EDTA×2 H _{2 O}的
   • 0.12微米盐酸硫胺素
   • 0.16微米烟酸
   • 0.097微米盐酸吡哆醇
   • 0.107μMNAA
   • 0.375 mM的KH ₂ PO ₄
   • 0.061毫米的NaH2 PO _4×2 H _{2 O}的
   • 0.039毫米的Na ₂ HPO ₄
   • 0.027 mM的甘氨酸
   • 0.56毫肌醇
   • 1.5％的蔗糖
   • 10毫米的K ¹⁴ NO ₃或10毫米的K ¹⁵ NO ₃

注：pH值在JPL介质应调整到5.7，用KOH。该介质必须通过过滤或在使用前高压灭菌进行灭菌。

2. 缓冲液H
   • 100mM的HEPES-KOH（pH 7.5）中
   • 250mM的蔗糖
   • 10％（重量/体积）甘油
   • 5毫米EDTA
   • 5mM的抗坏血酸
   • 0.6％（重量/体积），PVP K-25或K-30
   • 5 mM的DTT（补充新鲜）
   • 1 mM的PMSF（补充新鲜）
   • 蛋白酶和磷酸酶抑制剂（补充新鲜）
     • 50毫米氟化钠
     • 1毫米的Na ₃ VO ₄
     • 1毫米苄脒
     • 0.3微米mikrocystin
     • 4微米亮肽素
     • 蛋白酶抑制剂混合物
3. 缓冲液R
   • 5mM磷酸钾
   • 0.33M的蔗糖
   • 3毫米氯化钾
   • 0.1毫米EDTA
   • 1 mM的DTT（补充新鲜）
4. TNE缓冲液
   • 的25mM的Tris-HCl，pH值7.5
   • 150 mM氯化钠
   • 5毫米EDTA
5. 两相系统（6克 - 系统适用于高达15克样品鲜重）的制备方法
   在下面列出和15毫升猎鹰管组合成分调匀：
   • 20％（W / W）的葡聚糖​​T500 - 2.6克
   • 40％（W / W），聚乙二醇（PEG 3350） - 1.3克
   • 蔗糖 - 0.678克
   • 的0.2M磷酸钾，pH 7.8 - 0.15毫升
   • 2米氯化钾 - 0.014毫升
   • 加水，直到两相体系的总质量为6克
6. 蔗糖溶液在TNE缓冲液
   • 2.4 M，1.6 M，1.4 M，0.15M的
7. 试剂胰蛋白酶消化
   • UTU：6M尿素，2M硫脲（pH值为8.0的10mM的Tris-HCl）
   • 还原缓冲液（1微克/微升DTT水; 6.5毫米）
   • 烷基化反应缓冲液（5微克/微升碘乙酰胺在水中，27毫摩尔）
   • LYSC内肽酶（0.5微克/微升）
   • 胰蛋白酶，修改测序级（0.4微克/微升）
8. 试剂肽脱盐超过C ₁₈的
   • 悬浮液：2％三氟乙酸（TFA），在水中的5％乙腈
   • 溶液A：0.5％醋酸
   • 溶液B：80％乙腈，0.5％乙酸
9. 试剂磷酸化肽富集
   • 溶液A：0.1％TFA，5％乙腈
   • 溶液B：含0.1％TFA，80％乙腈
   • TiO ₂的10微米
   • 氨（股票25％溶液）
   • 哌啶（股100％）

PROTOCOLS

1。 拟南芥悬浮培养细胞代谢标记

1. 种植拟南芥 Col-0中的细胞在整整¹⁴ N-JPL媒体来自¹⁷叶悬浮培养^（18;请参阅“常用试剂和缓冲液”部分）的恒定光照条件下，在80〜100微摩尔/平方米的无菌瓶中¹⁵ N-喷气推进实验室中，一组文化²秒，23℃，在不断摇动在120rpm。
2. 维持细胞培养物，接种400毫升新鲜JPL培养基用40ml七日龄的细胞培养物在1升烧瓶中。
3. 通过真空抽吸，通过用不锈钢丝网广泛的玻璃漏斗细胞培养收获发生。细胞积聚在网状板和在漏斗和可以容易地从那里收集。细胞被推荐在-80℃或在液氮中研磨之前将冻结。

注：对于^{15 N}代谢标记细胞培养用K ¹⁵ NO ₃为氮的唯一来源，至少有两个通道，两个多星期^19。在忠武riments的比较蛋白质组学，用^{15 N}标记的细胞培养，同时在普通培养基上保持未标记的文化。生物处理将被应用到任何标记的或未标记的培养，而其他用作对照（ 图1）。对于蛋白质制剂，两种文化将被合并^20。在规划的实验装置，我们建议考虑相互的标签设置⁴中相同的处理，一旦应用到¹⁵ N-标记的细胞，一旦到了未标记细胞和未标记的分别或¹⁵ N标记的细胞作为对照组。在这种情况下，需要细胞培养物的双值。

2。质膜的纯化

注：所有其他步骤都进行了冷室和/或冰面上，除非它被注明。

1. 从大约1升的液态氮7天前细胞悬浮培养细胞均质化。该材料可以储存在-80℃直至进一步使用。
2. 基于鲜重混合标记的和未标记的冷冻的细胞培养物的相同量的烧杯中，并立即添加2体积的缓冲液H的。若膜微区的准备，建议至少使用7克两个标记和未标记细胞的鲜重。
3. 将烧杯在振荡器上振摇直到材料被熔化，并将溶液是液体和没有冰晶。
4. 通过一层的Miracloth的过滤匀浆入50ml离心管中。
5. 平衡的样品用缓冲液H和以10,000 xg离心8分钟。
6. 加载上清液进入预冷超离心管（ 如转子Beckman Coulter公司SW31Ti），与约32毫升的量
7. 用缓冲液H平衡的样品和通过以100,000×g离心离心在4℃下用贝克曼SW32Ti转子30分钟沉淀的微粒。
8. 离心后去除上清。

注：上清液含有可溶性蛋白质。少量的这部分可被保存以供进一步的蛋白质沉淀也可溶性蛋白和随后的分析。

9. 重新悬浮在缓冲液中的R各自量每个样品的膜沉淀并加载到U1的两相体系的顶部（ 图2）。如果6克两相系统时，加载刚好是2克重悬膜沉淀。

注意：缓冲器的R的终体积取决于将要使用的（〜1.6缓冲液的R毫升使用6克系统时，需要的话）的两相系统的大小。它建议使用以下的缓冲液重悬如此纯净缓冲器可以被添加到两相体系中，以获得所要求的重量，而不是使用太多的缓冲液溶解，并不能在整个样品加载到两相体系。

10. 加载纯缓冲r作为用于日相同体积Ë样品再悬浮到U2。
11. 慢慢地倒置他们30倍（约1反转/秒）混合U1和U2管。

注意：不要大力摇晃两相体系。它可以引起缺乏的阶段，在超速离心步骤分离。

12. 离心样品在1500×g离心4℃10分钟。
13. 离心后去除上清。
14. 从U1的转移上相到U2和在1500×g离心重复离心在4℃下10分钟。
15. 将上阶段从U2到SW41Ti超速离心管和五卷缓冲的R稀释调匀。

注：最终上相可能不得不被分成独立的超速离心管之前，它可稀释5倍。

16. 离心样品以200,000×g离心在4℃下用SW41Ti转子一小时。
17. 重悬膜沉淀在SMaL公司的TNE缓冲液升量（通常为200μL缓冲液使用）耐洗涤剂膜隔离。

注：少量这一部分可以被保存为普通肝素质膜的分析。

注：该质膜组分可贮存于4℃过夜分馏成耐洗涤剂膜和洗涤剂可溶部分之前。

3。耐洗涤剂膜的制备

1. 检查通过Bradford测定细胞膜级分的浓度。
2. 加的Triton X-100至质膜组分。洗涤剂的最终浓度应保持之间0.5-1％。洗衣粉蛋白质重量的重量比应保持13-15之间。
3. 摇样品在约100rpm转速，在4℃下进行30分钟。
4. 添加三卷2.4米蔗糖的处理质膜的一个量，获得1.8米决赛中蔗糖的浓度。
5. 通过加载为图3中所示的1.8M的级分的顶部的各自的蔗糖溶液制备在SW41Ti超速离心管的蔗糖梯度。
6. 离心样品以250,000×g离心在4℃下18小时使用贝克曼SW41Ti转子。
7. 小心地从转子拆下超速离心管，以避免这可能是因为在0.15 M/1.4 1M蔗糖界面乳状环可见低密度带的妨害。有时什么也看不到，但部分仍包含耐洗涤剂的蛋白质部分。
8. 除去为0.75毫升的量从渐变的顶部馏分。馏分2和3，其覆盖大约150毫升相间环和下面0.5毫升以上体积表示的耐洗涤剂的膜部分。收集这些部分分为15毫升猎鹰管。级分9和10中包含的洗涤剂溶解的膜级分，并且还可以收集用于比较。作进一步的分析，池FRACT离子2和3以及馏分9和10。

4。提取蛋白，从耐洗涤剂组分由甲醇/氯仿

注：所有步骤均在室温下进行。

1. 加入4倍体积的甲醇收集到的分数和涡彻底。
2. 加入1体积的氯仿，涡旋彻底。
3. 加入3体积的水，旋涡彻底。
4. 离心样品在2000×g下使用台式离心机（ 如的Eppendorf 5417R）5分钟。
5. 除去蛋白层中的相间上面的水相。
6. 加入3倍体积的甲醇，涡旋彻底。
7. 离心样品在4000×g离心10分钟。
8. 除去上清液，并干燥沉淀。将干燥的沉淀物是准备在溶液消化。

5。在溶液中的胰蛋白酶消化

注意：在此过程中的所有步骤都完成时室温下用变性剂，以减少氨基酸侧链的不必要的衍生化。

1. 在体积6M尿素，2M thiurea，pH值8（UTU）小溶解样品。如与样品（通常大约40微升）兼容使用尽可能低的音量。
2. 10分钟，以沉淀任何不溶性物质溶解在UTU在5000×g离心在台式离心机（ 如 Eppendorf公司5417R）自旋样品。
3. 最终溶液的pH值应接近8.0的最佳胰酶消化。请与pH值条。
4. 加入1μl的还原缓冲液每50微克样品蛋白质孵育30分钟，在室温下进行。

注：蛋白质含量只有一个粗略的估计是必要的。当样品量是有限的，最好是牺牲精度，而不是在蛋白质测定浪费样品。

5. 加入1μl的烷基化反应缓冲液，每50微克样品蛋白质孵育20分钟，在室温下在黑暗中。
6. 加入0.5微升的lysC的每50微克样品蛋白质和在室温下3小时孵育恒定振摇在700rpm。如果有必要，摘要也可过夜进行。但是，不建议在温暖的温度延长时间，因为它可以增加肽损失，由于水pH值为8的条件下吸附到塑料管材料。
7. 稀释样品用4倍体积的10mM Tris-盐酸，pH为8。

注意：此步骤是绝对必要的，以稀释的尿素浓度为胰蛋白酶，是高盐非常敏感。

8. 加入1μl每50微克样品蛋白质的胰蛋白酶孵育过夜，在室温下用恒定振摇在700rpm。
9. 酸化样品，以0.2％TFA的终浓度，以达到pH为2（添加约1/10体积的2％三氟乙酸）。

注：样品可以储存在 - 20°C，直到进一步的使用，但它是更好地存储他们StageTips在4℃，如果它是很短的时间（一周），或将其StageTips脱盐后存储。

6。的C ₁₈ - StageTips制造

1. 在平坦，干净的表面上放置一个Empore磁盘C18如一次性塑料培养皿中。
2. 用钝头皮下注射针头直径为1.5mm的切出一个小圆盘。磁盘坚持在针和可转移到枪头。
3. 推盘出针和由一片熔凝硅石或管道中的针的内配合的固定在移液管尖的锥形。

注：StageTips可在室温下²¹贮存干燥。

7。使用C _18-StageTips肽脱盐和浓缩

1. 通过将50微升溶液B到准备StageTip条件为C _{18-StageTip。}旋转的离心分离机的前端在2,000 rpm持续2分钟在台式Çentrifuge（ 如 Eppendorf公司5417R）。

注意：使用的适配器旋转StageTips在Eppendorf离心机，液体将被收集在2 ml反应管中。对于较大规模的制剂，舞台技巧也可以放置成一个尖端机架的200μl的提示96和液体可收集在微量滴定板。

注意：切勿使 ​​用更高的速度超过3000 XG在台式离心机（ 如 Eppendorf公司5417R）由于从尖端纺出了C ₁₈盘的风险。

2. 用100微升溶液A旋转尖端的离心机在5000 XG在台式离心机（ 如 Eppendorf公司5417R）平衡的StageTip。
3. 重复步骤2。
4. 由样品仔细吹打成枪头与椎间盘内将样品到磁盘上。

注：一个光盘可以结合约。 100微克蛋白质。

5. 旋在CE的提示ntrifuge直到样品的总容积通过了C ₁₈盘。
6. 用100微升溶液A的附带的秘诀在离心洗StageTips两次。

注意：洗涤并加载StageTips可以储存在4℃下进行长达一周。

7. 洗脱的样品用40微升溶液B的收集在一个新的1.5毫升的反应管中的洗脱液。
8. 浓缩样品中的快速真空。在理想条件下，停止脱水过程，因为这里仅有大约1或2个微升的液体。

注：干样品可以储存在-80℃多年。

9. 加的9微升悬浮液对样品的最终体积，并将其转移到微量滴定板进行质谱分析。

注意：所使用的重悬浮缓冲液的最终体积是依赖于实验者和质谱仪的灵敏度的需要使用。

8。用于磷酸化肽富集的替代协议

注：对于磷酸化肽富集，蛋白质提取步骤2中，必须在磷酸酶抑制剂的存在下进行。

注意：实际蛋白质浓度不需要被用于下面的步骤确定。它足以具有的蛋白质含量的粗略估计，以避免不必要的样品损失

1. 编写的C _{8-StageTips（}后续步骤6相同的协议，用于制备C ₁₈ - StageTips）。
2. 转移1毫克的TiO _2-珠准备C ₈ - StageTips的顶部（使用1毫克的TiO _2，每100微克蛋白质）。
3. 平衡在TiO ₂的提示用100微升溶液C，自旋在2000×g离心5分钟，在台式离心机（ 如 Eppendorf公司5417R）。
4. 混合100从步骤7.7消化和脱盐肽微克（应该是在100微升的解决方案B）用100μl溶液A的
5. 加载混合样品到平衡的TiO ₂列;旋在1000×g离心5分钟。
6. 收集流过，再重新放入到同一个提示（通过第二遍后，保持流量）。
7. 用100微升溶液A洗尖;旋在2000×g离心5分钟在台式离心机（ 如 Eppendorf公司5417R）。
8. 洗脱样品与50微升5％的氨水中。
9. 洗脱的样品用50μl5％哌啶的（洗脱液都可以组合）。
10. 立即用50微升20％磷酸酸化的样品。 pH应在约2。

注：除在TiO ₂的提示和检索粉末。可以用溶液B，并再次用于一个或两个以上的回合。

11. 再次脱盐酸化过的样品C ₁₈的提示（见第8步）。

9。肽混合物的LC-MS/MS分析

1. 悬浮脱盐phosphopeptides在悬浮缓冲液。
2. 负载重悬样品到所选择的LC-MS/MS系统并获取光谱数据依赖模式在60000全宽的半峰建议的解决方案。

注：为了获得最佳的碎片，无论是中性丢失扫描，应适用^22，如果可用多级激活^23。如果扣除非经常性可用它将使肽骨架碎片而不磷酸²⁴的损失。

注意：需要从原始数据峰值列表要被提取，并提交给数据库的识别以及定量。在这里，我们描述了使用吉祥物和MSQuant，它适用于从LTQ，LTQ-的Orbitrap和LTQ-FT工具（Thermo Scientific的）原始数据文件的设置。

3. 使用DTAsupercharge在MSQuant的“助手”菜单中提取峰列表。使用默认设置。
4. 提交产生的​​峰值列表文件，以吉祥物的搜索引擎。铬itical设置：母离子的质量误差为10ppm，MS / MS质量公差0.5大。固定修饰：carbamidomethylation半胱氨酸，可变修饰：甲硫氨酸的氧化，磷酸化的丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。定量方法^{：15 N}代谢标记。
5. 除吉祥物结果作为网页文件。
6. 加载吉祥物结果文件和原始文件到MSQuant。选择感兴趣的所有蛋白质并运行“自动定量”。该程序将读取全扫描谱图从原始文件，并执行峰积分为每个肽的标记和未标记的合作伙伴。
7. 导出定量结果以电子表格程序或制表符分隔的文本文件。这些数据可以被提交到Excel或再使用软件如Statquant ²⁵或饼干²⁶进一步的统计分析。

结果

使用代谢标记的拟南芥细胞培养物中所提出的协议，可以从植物组织中（步骤2， 图2和图4）分离血浆膜，血浆膜中富集耐洗涤剂的膜部分（步骤3， 图3和图5）。其后，该协议允许提取从这些耐洗涤剂的膜部分（步骤4）和消化的蛋白质进行比较蛋白质组学分析（步骤5）的蛋白质。最后，磷酸（第8步）的可选的富集是研究细胞信号传导过程特别有趣。最后一步则是?...

讨论

在本文提出的协议包含了许多步骤，所有的人都非常重要，以获得植物质膜到洗涤剂耐膜和清洁剂的可溶性组分的纯净和有代表性的分馏。因此，作为指示要按照每个步骤是很重要的。

质膜组分与非离子型去污剂（步骤3.2）的治疗有对的膜微区分馏质量最强的影响。以获得可再现的结果不同制剂之间，并以能够从相同的实验比较不同样品，精确地评估蛋白质在细胞膜的浓度?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph