비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

요약

여기에서 우리는 완전히 ¹⁵ N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

초록

세포막 마이크로 도메인은 지질 및 스테롤 환경의 물리적 특성에 기초하여 기능하고 신호 전달 프로세스에서 특정 역할이있다. 프로테옴 분석을 위해 식물 세포에서 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인을 추출하면 여러 준비 단계 및 다른 세포 구획에서의 오염 물질에 대한 소스에 주로 어려운 작업입니다. 세포막은 식물 세포에있는 멤브레인의 단지 대략 5-20 %에 구성하고, 따라서 고순도 세포막 분획의 분리 도전적이다. 자주 사용하는 방법은 95 % ^(1)의 순도 세포막 소포를 산출 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스 트란의 수성 두 단계의 분할을 포함한다. 세포막 내 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인은 알칼리 pH에서 차가운 비 이온 계 계면 활성제 치료에 불용성이다. 이 세제 저항 막 분획은 초 원심 분리에 의해 대량 세포막으로부터 분리 될 수있다ucrose 그라데이션 ^2. 이어서, 단백질은 메탄올 / 클로로포름 침전 자당 구배 저밀도 대역으로부터 추출 될 수있다. 추출 된 단백질은 소화 탈염 마지막 LC-MS/MS 분석 트립신됩니다. 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인에 대한 우리의 추출 프로토콜은 애기 장대의 세포 배양에서 청소 세제 저항 막 분수의 준비를 위해 최적화되어 있습니다.

우리는 또한 ^3의 생물학적 처리 다음과 같은 정량적 인 비교 프로테오믹스 연구를위한 유일한 질소원으로 K ¹⁵ NO _3와 애기 장대 서스펜션 세포 배양의 전체 신진 대사 라벨을 사용합니다. 조인트 단백질 추출을위한 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 동등한 비율을 혼합하여 최종 정량 결과의 준비 단계의 영향은 최소로 유지된다. 또한 추출 중 물질의 손실은 제어와 같은 방법으로 처리 샘플 모두에 영향을 미칠 것이다D 따라서 빛과 올림 펩타이드의 비율이 일정하게 유지됩니다. 제안 된 방법으로 표시하거나 다른 컨트롤 ⁴ 역할을하면서 레이블이없는 세포 배양은 생물학적 처리를 거쳐 하나.

서문

1972 년, 조나단 가수와 거스 니콜슨은 일반적으로 1960 년대 초에 허용 된 단백질 지질 단백질 샌드위치 모델을 교체, 유체 모자이크 모델에게 세포막의 구조 모델을 제안했다. 가수 니콜슨은 생체막 모든 지질 및 단백질 분자는 자유롭게하고 쉽게 확산 ⁵ 이차원 액체로서 고려 될 수 있음을 가정했다. 그때 이후로, 막 조성의 세포막 및 지식의 구조 모델은 더 복잡하게되었다. 특히, 세포막 내에 그러한 단백질 복합체 및 지질 / 스테롤 기반 구조적 무질서 같은 마이크로 도메인 구조를 관찰 할 수있다. 인공 모델 막을 ^6,7에서 스테롤과 스핑 고리 피드 가로 방향으로 변형 된 신체 기능과 영역을 형성하기 위해 다른 지질 종에서 분리 할 수 있습니다. 세포막 내에서이 분리는 주로 스테롤 높은 SA의 자기 연관 특성에 의해 발생합니다phopsho 및 스핑 고지 ⁸ turated 탄화수소 사슬. 특히, 강성 스테롤 반지 엄격한 및 똑바로 포화 지질 종과 이들의 상호 작용이 막 두께와 경도를 증가, 더 확장 된 입체 형태로 이웃 탄화수소 사슬을 강제로와의 상호 작용을 선호.

스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인의 일반적으로 관찰 된 기능 중 하나는 비 이온 계면 활성제 등의 트리톤 (Triton) X-100 BRIJ (35) 치료에 따라 자신의 불용성했다. 이 분획을 막 마이크로 도메인과 동일한 것으로 생각하고, 그들의 생화학 제조 방법 ^2에 따라 세제 저항 막 (DRM)라고했다. DRM 추출시 비이 온성 세제의 사용은 생화학 DRM 준비가 직접 사는 셀 ⁽⁹⁾ 내에서 특정 막 칸에 해당하지 않을 수 있으므로 약간의 비판을 받았다. 특히, 단백질의 비율 세제 등 준비에 중요한 것의 다른 세제뿐만 아니라 다른 세제 양의 세제 저항 막 분획 ^(10)의 다른 구성을 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 단백질의 종류는 특히 이러한 세포 스테롤이 풍부한 막 도메인과 연결하고,이 단백질이 잘 세제 저항 막 분수 ^(11)의 생화학 적 준비에 충실하는 증거가있다. 식물 DRM 분획에서 발견되었고,의 DRM에 존재 종속 스테롤했다하는 단백질의 핵심은, 이러한 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄 단백질 (FLAs) 및 SKU 단백질 가족의 일원으로, 특히 GPI-고정 단백질이었다. 또한 수용체 같은 키나제 또는 포스 포 리파제 등 일부 신호 단백질은 ¹¹ 발견되었다. 이러한 결과는 포유류 막 마이크로 도메인 ^12,13 많은 프로테오믹스 연구와 일치한다. 또한 식물에 스트레스 반응 ^(14)의 맥락에서 막 마이크로 도메인의 역할에 대한 증거가 증가하고있다 ^-16.

여기에 설명 된 프로토콜은 세포막 분획의 마이크로 도메인을위한 강력한 방법을 제공하고, 특히주세요 스테롤 풍부한 세포막 구획 ^4,11,14의 스트레스 유도 변화를 묘사 할 수의 세제 농도의 단백질을 사용한다.

프로토콜

절차

추출 프로토콜에서 사용되는 일반적인 시약 및 버퍼 :

1. 애기 장대 서스펜션 세포 배양에 대한 JPL 매체
   • 3 μM의 H ₃ BO ₃
   • 3 μM MnSO ₄ 개의 x H ₂ O
   • 1.1 μM ZnSO _{4 ×} 7 H ₂ O
   • 0.15 μM의 KJ
   • 0.03 μM 나 ₂ 무 _{4 ×} 2 H ₂ O
   • 3 _nm의의 CoCl2 x 6 H ₂ O
   • 3 nm의 CuSO ₄ × 5 H ₂ O
   • 0.9 mM의 염화칼슘 _{2 ×} 2 H ₂ O
   • 0.5 ㎜ _망초 X 7 H ₂ O
   • 0.5 μM FeSO _{4 ×} 7 H ₂ O
   • 0.5 μM ₂ EDTA × 2 H 나 ₂ O
   • 0.12 μM 티아민 염산
   • 0.16 μM 니코틴산
   • 0.097 μM의 리드 키신 염산
   • 0.107 μM의 NAA
   • 0.375 밀리미터 KH ₂ PO ₄
   • 0.061 밀리미터의 NaH2 PO _{4 ×} 2 H ₂ O
   • 0.039 밀리미터 나 ₂ HPO ₄
   • 0.027 mM의 글리신
   • 0.56 mM의 미오 이노시톨
   • 1.5 % 자당
   • 10 mM의 K ¹⁴ NO ₃ 또는 10 mM의 K ¹⁵ NO ₃

참고 : JPL 매체의 pH가 KOH와 5.7로 조정해야합니다. 매체는 여과 또는 고압 증기 멸균에 사용하기 전에 소독해야합니다.

2. 버퍼 H
   • 100 mM의 HEPES-KOH (산도 7.5)
   • 250 ㎜ 자당
   • 10 % (w / v) 글리세롤
   • 5 mM의 EDTA
   • 아스코르브 산 5mM
   • 0.6 % (w / v)의 PVP K-25 K-30
   • 5 mM의 DTT (신선한 추가)
   • 1 ㎜ PMSF (신선한 추가)
   • 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제 (신선한 추가)
     • 50 mM의 불화 나트륨
     • 1 ㎜ 나 ₃ VO ₄
     • 1 ㎜ benzamidin
     • 0.3 μM mikrocystin
     • 4 μM의 류 펩틴
     • 프로테아제 억제제 칵테일
3. 버퍼 R
   • 5 mM의 인산 칼륨
   • 0.33 M 자당
   • 3 밀리미터의 KCl
   • 0.1 mM의 EDTA
   • 1 mM의 DTT (신선한 추가)
4. 버퍼 TNE
   • 25 mM 트리스-HCl, pH7.5
   • 150 mM의 NaCl을
   • 5 mM의 EDTA
5. 두 개의 상 시스템 (6 G-시스템은 샘플 신선한 무게의 최대 15g에 적합하다) 제조 방법
   아래의 15 ML 팔콘 튜브 혼합 재료에 잘 혼합 :
   • 20 % (w / w) 덱스 트란 T500 - 2.6 g
   • 40 % (w / w) 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG 3350) - 1.3 g
   • 크로스 - 0.678 g
   • 0.2 M 인산 칼륨, pH를 7.8-0.15 ML
   • 2 M의 KCl - 0.014 ML
   • 2 상 시스템의 총 질량은 6g 때까지 물을 첨가.
6. TNE 버퍼 자당 솔루션
   • 2.4 M, 1.6 M, 1.4 M, 0.15 M
7. 트립신 소화 용 시약
   • UTU : 6 M 요소, 2 M 티오 우레아 (10 MM 트리스 - 염산으로 pH 8.0)
   • 감소 버퍼 (물에 1 ㎍ / ㎕의 DTT, 6.5 ㎜)
   • 알킬화 버퍼 (물에 5 ㎍ / ㎕의 요오도 아세트 아미드, 27 MM)
   • 의 lysC 엔도 펩 티다 제 (0.5 ㎍ / μL)
   • 트립신, 수정 시퀀싱 등급 (0.4 ㎍ / μL)
8. C _{18 세} 이상 펩타이드 탈염 용 시약
   • 재 부유 용액 : 2 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 물 중 5 % 아세토 니트릴
   • 용액 A : 0.5 % 초산
   • 용액 B : 80 % 아세토 니트릴, 0.5 % 초산
9. 포스 포 농축을위한 시약
   • 해결 방법 : 0.1 % TFA, 5 % 아세토 니트릴
   • 솔루션 B : 0.1 % TFA, 80 % 아세토 니트릴
   • 티오 ₂ 10 ㎛
   • 암모니아 (주식 25 % 용액)
   • 피 페리 딘 (주식 100 %)

의정서

1. 애기 장대의 세포 현탁액의 문화 대사 라벨링

1. 애기 장대 골 - 0 셀을 성장전체 ¹⁴ N-JPL 매체에 잎 ^17에서 파생 된 서스펜션 문화, 80 ~ 100 μmol / m에서 일정한 빛 조건에서 멸균 플라스크에 ¹⁵ N-JPL 매체와 문화의 한 세트 ⁽¹⁸ "일반적인 시약 및 버퍼"절을 참조하십시오) 120 rpm으로 흔들어 일정에 따라 ² 초, 23 ° C,.
2. 세포 배양을 유지하기 위해, 1 L 플라스크 일곱 일 된 세포 배양의 40 ㎖와 신선한 JPL 배지 400 ㎖를 접종.
3. 세포 배양의 수확은 스텐레스 메쉬 넓은 유리 깔때기를 통해 진공 흡인을 통해 발생한다. 세포는 메쉬 접시에와 깔때기에 축적 쉽게 거기에서 수집 할 수 있습니다. 세포를 분쇄하기 전에 -80 ° C에서 액체 질소에 냉동하는 것이 좋습니다.

참고 : ¹⁵ N의 경우 대사라는 세포 배양 2 주 ^19에 적어도 두 구절 질소의 유일한 소스로 K ⁽¹⁵⁾ NO _3을 사용합니다. expe을의비교 프로테오믹스에 대한 riments는 ¹⁵ N 표시된 세포 배양을 사용하고 또한 일반 매체에 레이블이없는 문화를 유지한다. 다른 하나는 (그림 1) 제어 역할을하는 동안 생물학적 처리는 레이블 또는 레이블이없는 하나의 문화에 적용됩니다. 단백질 준비를 위해, 두 문화 ^(20)을 결합됩니다. 실험 설정을 계획 할 때, 우리는 상호 라벨 같은 처리를 한 번 레이블이없는 세포에 ¹⁵ N-라는 세포에 한 번 적용되는 설정 ^(4)와 각각의 레이블이없는 ¹⁵ N-라는 세포가 컨트롤 역할을 고려하는 것이 좋습니다. 이 경우, 세포 배양의 두 배 금액이 필요합니다.

2. 플라즈마 막 정화

참고 :이 달리 명시하지 않는 한 모든 추가 단계가 냉장실 및 / 또는 얼음에서 실시된다.

1. 액체 질소 7 일 이전 세포 현탁액 문화의 약 1 L의 세포를 균질화한다.소재는 더 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 비커에 신선한 중량을 기준으로 레이블과 레이블이없는 냉동 세포 배양의 같은 양을 혼합 즉시 버퍼 H 2 볼륨을 추가합니다. 막 마이크로 도메인 준비의 경우는 최소 7g에게 두 레이블과 레이블이 지정되지 않은 세포의 신선한 무게를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 쉐이커에 비커를 넣고 재료가 녹아 용액이 액체와 얼음 결정없이 될 때까지 흔들어.
4. 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 Miracloth의 한 층을 파쇄를 필터링합니다.
5. 8 분 10,000 XG에 버퍼 H 원심 분리기와 균형 샘플.
6. 약 32 ㎖의 부피로, 사전 냉각 초 원심 분리기 튜브 (회 전자 베크만 쿨터 SW31Ti에 대한 예를 들어)에 뜨는로드
7. 밸런스 버퍼 H와 샘플 및 베크 SW32Ti 로터를 사용하여 30 분 동안 4 ° C에서 10 만 XG에 원심 분리하여 미세 소체 펠렛.
8. 원심 분리 후 상층 액을 제거합니다.

참고 : 뜨는는 수용성 단백질이 포함되어 있습니다. 이 분획의 소량은 또한 가용성 단백질의 추가의 단백질 침전 및 후속 분석을 위해 저장 될 수있다.

9. 버퍼 R의 각각의 양의 각 샘플의 막 펠렛을 재현 탁하고 U1이 상 시스템의 상부 (도 2) 상에로드. 6g 개의 상 시스템을 사용하는 경우, 재 부유 막 펠릿 정확히 2g로드.

NOTE : 버퍼 R의 최종 부피는 (6g 시스템을 사용할 때 버퍼 R의 1.6 ㎖을 필요 ~)에 사용 예정이 상 시스템의 크기에 달려있다. 그것은 너무 순수 버퍼가 오히려 2 단계 시스템에 전체 샘플을로드 할 수 가용화 너무 많은 버퍼를 사용하지 않고 요구 무게를 얻기 위해 두 단계의 시스템에 추가 할 수있는 재 부상에 대한 작은 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다.

10. 회 사용으로 순수한 버퍼 R의 동일한 볼륨을로드U2 상에 전자 샘플 재 부상.
11. 천천히 그들에게 30 배 (약 1 반전 / 초)를 반전 U1과 U2 튜브를 혼합한다.

참고 : 적극적으로 2 단계 시스템을 흔들지 마십시오. 이 원심 분리 공정에서 상 분리의 부족을 일으킬 수있다.

12. 10 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 샘플을 원심 분리기.
13. 원심 분리 후 상층 액을 제거합니다.
14. U2에 U1에서 상위 단계를 전송하고 10 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 원심 분리를 반복합니다.
15. SW41Ti의 초원 심 분리기 튜브에 U2에서 상위 단계를 이동하고 버​​퍼 R의 5 권으로 희석하고 철저하게 섞는다.

참고 : 최종 상위 단계는 다섯 배 희석되기 전에 별도의 초원 심 분리기 튜브로 분할해야 할 수 있습니다.

16. SW41Ti 로터를 사용하여 한 시간 동안 4 ° C에서 20 만 XG에서 샘플을 원심 분리기.
17. 스말에 재현 탁 막 펠렛TNE 버퍼의 L 양 세제 저항 막 분리를 위해 (일반적으로 버퍼 200 μL가 사용됩니다).

주 :이 분획의 소량 분획 원형질막의 분석을 위해 저장 될 수있다.

참고 : 세포막 분획 하룻밤 세제 저항 막 및 세제 용해 분수로 분류하기 전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 세제 저항 막 준비

1. 브래드 포드 분석에 의해 세포막 분획의 농도를 확인한다.
2. 세포막 분획에 트리톤 X-100을 추가. 세제의 최종 농도는 0.5 % 사이에서 유지해야한다. 중량 비율로 단백질 무게 세제는 13 ~ 15 사이에 유지해야합니다.
3. 30 분 동안 4 ° C에서 약 100 rpm으로 흔들어 샘플.
4. 자당의 1.8 M 최종 농도를 얻기 위해 처리 세포막의 하나의 볼륨에 2.4 M 자당의 세 볼륨을 추가합니다.
5. (그림 3) 1.8 M 분수의 상단에 각각 자당 솔루션을로드하여 SW41Ti의 초원 심 분리기 튜브에 자당 기울기를 준비합니다.
6. 베크 SW41Ti 로터를 사용하여 18 시간 동안 4 ° C에서 25 만 XG에서 샘플을 원심 분리기.
7. 조심스럽게 0.15 M/1.4 M의 자당의 인터페이스에서 우유 링으로 볼 수있다 저밀도 밴드의 교란을 방지하기 위해 회 전자에서 초원 심 분리기 튜브를 제거합니다. 때로는 아무 것도 볼 수 없습니다 만, 일부는 여전히 세제 저항하는 단백질 부분이 포함되어 있습니다.
8. 그라데이션의 상단에서 825 ml의 볼륨의 일부를 제거합니다. 상간 링 아래 0.5 ㎖ 이상 1.5 ㎖의 주위의 볼륨을 커버 분획 2 및 3은 세제 저항 막 분획을 나타낸다. 15 ML 팔콘 튜브에이 분수를 수집합니다. 분획 15 및 10는 세제 용해 막 분획을 포함하고 또한 비교를 위해 수집 될 수있다. 추가 분석, 풀 Fract에 들어이온 2 및 3뿐만 아니라 분획 (9, 10).

4. 메탄올 / 클로로포름에 의한 세제 저항 분수에서 단백질의 추출

NOTE : 모든 단계가 실온에서 수행된다.

1. 철저하게 수집 된 분수와 소용돌이에 메탄올 4 볼륨을 추가합니다.
2. 1 클로로포름의 양, 소용돌이 철저를 추가합니다.
3. 철저하게 물을 3 권, 소용돌이를 추가합니다.
4. 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)를 이용하여 5 분 동안 2,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
5. 계면에서의 단백질 층 위 수성 단계를 제거합니다.
6. 철저하게 메탄올의 전 3 권, 소용돌이를 추가합니다.
7. 10 분 동안 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
8. 상층 액을 제거하고 펠렛을 건조. 건조 된 펠렛의 솔루션이 소화에 대한 준비가되어 있습니다.

5. 의 - 솔루션 트립신 소화

참고 :이 절차의 모든 단계에서 수행합니다변성제에 의해 아미노산 측쇄의 불필요한 유도체를 줄이기 실온.

1. 6 M 요소, 2 M의 thiurea, pH가 8 (UTU)의 작은 양의 샘플을 녹입니다. 샘플 (일반적으로 약 40 μL)와 호환되는 최저 볼륨을 사용합니다.
2. 불용성 물질을 펠렛 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5,000 XG에서 UTU에 용해 회전 샘플.
3. 최종 용액의 pH는 최적의 트립신 소화 8.0 근처에 있어야한다. 산도 스트립 확인합니다.
4. 시료 단백질의 매 50 μg위한 환원 완충액 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분간 배양한다.

주 : 단백질 함량 만 대략적인 견적이 필요합니다. 시료의 양이 제한되는 경우에는 오히려 단백질 분석에서 샘플을 낭비보다 정확도를 희생하는 것이 낫다.

5. 모든 50 μg 샘플 단백질 알킬화 버퍼 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 알을 품다.
6. 50 μg 샘플 당 단백질의 lysC의 0.5 μl를 추가하고 상수는 700 rpm에서 진탕하면서 실온에서 3 시간 동안 배양한다. 필요한 경우, 다이제스트로는 밤새 수행 될 수있다. 그러나, 따뜻한 온도에서 확장 된 시간은 그것에 의한 수용액의 pH 8 조건에서 플라스틱 튜브 소재에 흡착 펩타이드 손실을 증가시킬 수 있습니다 사용하지 않는 것이 좋습니다.
7. 4 권 10 MM 트리스 - 염산, pH가 8 샘플을 희석.

참고 :이 단계는 트립신, 염분에 매우 민감 같은 요소 농도를 희석하기 위해 절대적으로 필요하다.

8. 50 μg 샘플의 단백질 당 트립신 1 μl를 추가하고 상수는 700 rpm에서 진탕하면서 실온에서 밤새 품어.
9. 산도 2 (2 % 트리 플루오로 산의 약 1 / 10 볼륨을 추가)에 도달하는 0.2 % TFA 최종 농도 샘플을 산성화.

참고 : 샘플에 저장할 수 있습니다 - 추가 사용 20 ° C까지,하지만 저장하는 것이 더 좋습니다4 ° C에서 StageTips에 그들은 짧은 시간 (1 주) 또는 StageTips 탈염 후 보관됩니다.

6. C ₁₈ StageTips의 제조

1. 이러한 일회용 플라스틱 페트리 접시로 평평하고 깨끗한 표면에 Empore 디스크 C18를 놓습니다.
2. 1.5 mm의 직경이 무딘 팁 피하 주사 바늘을 사용하여 작은 디스크를 펀치. 디스크가 바늘에 붙어 피펫 팁으로 전송할 수 있습니다.
3. 바늘 밖으로 디스크를 밀어 용융 실리카 또는 바늘의 안쪽에있는 피팅 튜브의 조각에 의해 피펫 팁의 테이퍼에 고정합니다.

참고 : StageTips 실내 온도 ^21에서 건조 저장 될 수있다.

7. 펩타이드 탈염 및 농축을위한 C ₁₈ StageTips의 사용

1. 준비된 StageTip에 솔루션 B의 50 μl를 배치하여 C ₁₈ StageTip을 정돈한다. 벤치 탑 C에서 2 분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리기에 끝 스핀entrifuge (예 : 에펜 도르프 5417R).

참고 : 에펜 도르프 원심 분리기에 StageTips를 회전하는 데 사용하는 어댑터, 액체 2 ㎖의 반응 관에 수집됩니다. 큰 규모의 준비를 위해 무대 팁은 200 ㎕의 팁 (96) 팁 랙에 배치 할 수있는 액체는 마이크로 플레이트에서 수집 할 수 있습니다.

참고 : 인해 끝에서 C ₍₁₈₎ 디스크를 회전의 위험에 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 3,000 XG보다 더 높은 속도를 사용하지 마십시오.

2. 100 μL 솔루션 A.는 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5,000 XG에서 원심 분리기에 끝 스핀 사용 StageTip을 평형.
3. 2 단계를 반복합니다.
4. 신중하게 내부 디스크와 피펫 팁으로 샘플을 피펫으로 디스크에로드 샘플.

참고 : 하나의 디스크가 약 바인딩 할 수 있습니다. 단백질 100 μg.

5. CE의 팁을 회전ntrifuge 샘플의 전체 볼륨이 C ₁₈ 디스크를 통과 할 때까지.
6. 솔루션 A. 100 ㎕의 원심 분리기에서 팁을 스핀 StageTips 두 번 씻으십시오.

참고 : 세척 및로드 StageTips은 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

7. 새로운 1.5 ㎖의 반응 관에 용출액을 수집 솔루션 B. 40 ㎕의 샘플을 용출.
8. 속도 진공 청소기에 샘플을 집중한다. 왼쪽 막 1 또는 2 ㎕의 액체가로 이상적인 조건에서 탈수 프로세스를 중지합니다.

참고 : 말린 샘플 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

9. 시료에 재 부유 용액 15 μL의 최종 부피를 추가하고 질량 분석 분석을위한 마이크로 타이로 전송.

NOTE : 사용 재 부유 버퍼의 최종 부피는 실험자와 질량 분석의 민감도의 요구에 의존사용.

8. 포스 포 농축을위한 대체 프로토콜

참고 : 포스 포 농축를 들어, 2 단계에서 단백질 추출은 인산 가수 분해 효소 억제제의 존재에서 수행해야합니다.

주 : 실제 단백질 농도는 다음 단계를 위해 결정될 필요가 없다. 그것은 불필요한 샘플 손실을 방지하기 위해 단백질 함량의 개산을 갖도록 충분한

1. C ₈ StageTips을 (6 단계에서 C ₁₈ StageTips의 준비를위한 동일한 프로토콜을 따라) 준비합니다.
2. 준비 C ₈ StageTips의 상단에 전송 티오 ₂ 구슬의 1 밀리그램 (단백질 100 μg 당 사용 1 밀리그램의 티오 _2).
3. 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5 분 2,000 XG에서 솔루션 C, 스핀의 100 μL와 티오 ₂ - 팁을 평형.
4. (이 용액 100 μL에 있어야 단계 7.7에서 소화 및 탈염 펩타이드 100 μg을 혼합B) 솔루션 A. 100 μL와
5. 1,000 XG, 5 분에 스핀, 평형 티오 ₂ 열에 혼합 된 샘플을로드합니다.
6. 흐름을 통해 수집하고 (두 번째 패스를 통해 흐름을 유지) 다시 같은 팁에로드합니다.
7. 용액 100 ㎕ 씩 팁을 세척, 2,000 XG에 스핀, 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5 분.
8. 5 %의 암모니아를 50 ㎕의 샘플을 용출.
9. 5 %의 피 페리 딘 50 μL (모두 용출액은 결합 될 수있다)로 샘플을 용출.
10. 즉시 20 % 인산 50 μL를 사용하여 샘​​플을 산성화. pH는 약 2에 있어야합니다.

참고 : 티오 ₂ 팁을 저장하고 파우더를 검색 할 수 있습니다. 이 용액 B로 세척하고, 하나 또는 두 개 이상의 회전을 위해 다시 사용될 수있다.

11. 또 (8 단계 참조) C ₍₁₈₎ 팁을 통해 산성화 된 샘플을 탈염.

9. 펩타이드 혼합물의 LC-MS/MS 분석

1. 탈염 phosph을 재현 탁재 부유 버퍼 opeptides.
2. 로드 선택의 LC-MS/MS 시스템에 샘플을 재현 탁하고 반값 60,000 전체 폭의 권장 해상도에서 데이터 종속 모드의 스펙트럼을 획득.

참고 : 최적의 분열은, 중성 손실 스캔 하나는 다단계 활성화 ^{23 22인가,} 또는 가능하면해야한다. ETD를 사용할 수있는 경우에는 인산 ^(24)의 손실없이 펩티드 백본 조각을 수 있습니다.

참고 : 원시 데이터에서 피크 목록을 추출하여 데이터베이스를 식별뿐만 아니라 정량을 위해 제출해야합니다. 여기, 우리는 마스코트와 LTQ, LTQ-Orbitrap 및 LTQ-FT 악기 (온도 과학)에서 원시 데이터 파일을 작동 MSQuant를 사용하여 설정을 설명합니다.

3. MSQuant에서 "도우미"메뉴 내에서 DTAsupercharge를 사용하여 피크 목록을 추출합니다. 기본 설정을 사용합니다.
4. 마스코트의 검색 엔진에 피크 목록 파일을 결과로 제출합니다. CRitical 설정 : 질량 허용 오차는 10 ppm 이온 전구체, MS / MS 질량 허용 오차 0.5 다. 고정 수정 : 시스테인의 carbamidomethylation, 변수 수정 : 메티오닌의 산화, 세린의 인산화, 트레오닌, 타이로신. 정량 방법 : ¹⁵ N 대사 라벨링.
5. 웹 페이지 파일로 마스코트 결과를 저장합니다.
6. MSQuant에 마스코트 결과 파일과 RAW 파일을로드합니다. 그 모든 단백질을 선택하고 "자동 정량"을 실행합니다. 이 프로그램은 원시 파일에서 전체 검사 스펙트럼을 읽고 각 펩타이드의 레이블과 레이블이없는 파트너 피크 통합을 할 것입니다.
7. 스프레드 시트 프로그램 또는 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 내보내기 정량 결과. 데이터는 Excel에서 또는 Statquant ²⁵ 크래커 ^26으로 추가 소프트웨어 패키지를 사용하여 추가 통계 분석에 제출 될 수있다.

결과

대사 적으로 표지 된 애기 세포 배양을 이용하여 제시된 프로토콜로는 식물 조직 (STEP2가, 2 및도 4)에서 원형질막을 분리하고, 세포막 내에 세제 저항 막 분획에 대한 풍부 할 수있다 (단계 3, 4 및도 5). 이어서, 프로토콜은 수있는 세제 저항 막 분획 (단계 4) 및 비교 프로테옴 분석 (단계 5)에 대한 단백질의 소화로부터 단백질의 추출. 마지막으로, 포스 포 (8 단계)의 ?...

토론

본 논문에서 제시하는 프로토콜은 여러 단계를 포함하고, 그들 모두는 세제 저항 막 및 세제 용해 분수에 식물 세포막의 순수하고 대표 분별을 얻을 매우 중요합니다. 따라서 지침에 따라 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다.

비 - 이온 성 세제 (단계 3.2)와 세포막 분획의 치료는 막 마이크로 도메인 분획의 품질에 강한 영향을 미친다. 상이한 제제 사이 재현 가능한 결과를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph