Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Riepilogo

Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente ¹⁵ N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.

Abstract

Plasma microdomini di membrana sono caratteristiche basate sulle proprietà fisiche dell'ambiente lipidi e steroli e particolari ruoli nei processi di segnalazione. Estrazione microdomini di membrana arricchiti di steroli dalle cellule vegetali per l'analisi proteomica è un compito difficile, soprattutto a causa molteplici fasi di preparazione e le fonti di contaminazioni provenienti da altri compartimenti cellulari. La membrana plasmatica costituisce solo circa il 5-20% di tutte le membrane in una cellula vegetale, e quindi l'isolamento della frazione di membrana plasmatica altamente purificato è impegnativo. Un metodo utilizzato frequentemente comporta acquosa partizionamento bifase in polietilene glicole e destrano, che produce vescicole della membrana plasmatica con una purezza del 95% ^1. Ricchi di steroli microdomini di membrana all'interno della membrana plasmatica sono insolubili in seguito al trattamento con detergenti non ionici fredde a pH alcalino. Questa frazione di membrana resistente ai detergenti può essere separato dalla membrana plasmatica bulk mediante ultracentrifugazione in quantogradiente ucrose ^2. Successivamente, le proteine ​​possono essere estratti dalla banda bassa densità del gradiente di saccarosio da metanolo / cloroformio precipitazione. Proteina estratta sarà poi tripsina digerito, dissalato e, infine, analizzato da LC-MS/MS. Il nostro protocollo di estrazione per microdomini ricchi di steroli è ottimizzato per la preparazione di detergenti puliti resistente membrana frazioni da colture cellulari Arabidopsis thaliana.

Usiamo piena marcatura metabolica di Arabidopsis thaliana colture cellulari sospensione con K ¹⁵ NO ₃ come unica fonte di azoto per studi di proteomica comparativi quantitativi in seguito al trattamento biologico di interesse ^3. Mescolando uguali indici di colture cellulari etichettati e non etichettati per l'estrazione delle proteine ​​congiunta l'influenza della procedura di preparazione sul risultato quantitativo finale è mantenuta ad un minimo. Anche la perdita di materiale durante l'estrazione interesserà sia il controllo e campioni di trattamento nello stesso modo, und quindi il rapporto di luce e sollevamento peptide rimarrà costante. Nel metodo proposto sia etichettato o coltura cellulare non marcato subisce un trattamento biologico, mentre l'altro serve come controllo ^4.

Introduzione

Nel 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson proposto il modello a mosaico fluido un modello struttura delle membrane cellulari, sostituendo il modello panino proteina-lipide-proteina che è stata generalmente accettata nei primi anni 1960. Singer e Nicolson postulato che la membrana biologica può essere considerato come un liquido bidimensionale in cui tutte le molecole lipidiche e proteiche diffondersi liberamente e facilmente ^5. Da allora, struttura tipo della membrana plasmatica e la conoscenza della composizione membrana è diventata ancora più complessa. In particolare, all'interno della membrana plasmatica, strutture come complessi proteici basati lipidi / steroli microdomini strutturalmente disordinate possono essere osservati. In membrane modello artificiali ^6,7, steroli e sfingolipidi possono separare lateralmente da altre specie di lipidi per formare regioni con caratteristiche fisiche alterate. Questa segregazione all'interno della membrana cellulare è causato principalmente dalle proprietà di auto-associazione tra steroli e altamente sacatene di idrocarburi insaturi di phopsho-e sfingolipidi ^8. In particolare, gli anelli rigidi steroli favoriscono le interazioni con più rigido e specie lipidiche dritto saturi e queste interazioni costringono vicine catene idrocarburiche in più conformazioni estese, aumentando lo spessore della membrana e durezza.

Una delle caratteristiche comuni delle steroli arricchito microdomini di membrana è stata loro insolubilità in seguito al trattamento con detergenti non ionici come un Triton X-100 o Brij 35. Queste frazioni sono stati pensati per essere identico a microdomini di membrana e sono stati chiamati membrane resistenti ai detergenti (DRM) basato sul loro metodo di preparazione biochimica ^2. L'uso di detergenti non ionici durante l'estrazione DRM ricevuto qualche critica come la preparazione DRM biochimico potrebbe non corrispondere direttamente a qualsiasi compartimento di membrana specifico all'interno della cellula vivente ^9. In particolare, il detersivo rapporto proteina sembra cruciale in tali preparati, uns diversi detergenti, e anche diverse quantità di detersivo può produrre diversa composizione del resistente detersivo frazione di membrana ^10. Tuttavia, vi sono prove che particolari specie proteiche specificamente associare a questi domini di membrana ricchi di steroli cellulari, e che queste proteine ​​sono ben arricchiti in preparazioni biochimiche di detersivo resistente membrana frazioni ^11. Il nucleo di proteine ​​che sono stati trovati in frazione DRM impianti, e per i quali la presenza di DRM era steroli dipendente, erano in particolare le proteine ​​GPI-ancorate, come le proteine ​​fasciclin-come Arabinogalattano (FLA) e membri della famiglia di proteine ​​SKU. Anche alcune proteine ​​di segnalazione, come chinasi o fosfolipasi recettore-like sono stati trovati ^11. Questi risultati sono coerenti con numerosi studi di proteomica su microdomini di membrana mammiferi ^12,13. Anche nelle piante è sempre più evidente per il ruolo di microdomini di membrana nel contesto della risposta allo stress ^{14 -}16.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo robusto per frazionamento di microdomini di membrana del plasma e in particolare utilizza una proteina di concentrazione di detersivo che ci permette di rappresentare lo stress indotto alterazioni della ricca di steroli vano membrana ^4,11,14.

Protocollo

PROCEDURA

Reagenti e tamponi comunemente utilizzate nel protocollo di estrazione:

1. JPL mezzo per Arabidopsis thaliana colture cellulari di sospensione
   • 3 mM H ₃ BO ₃
   • 3 micron MnSO ₄ x H ₂ O
   • 1.1 micron ZnSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0.15 micron KJ
   • 0,03 mM Na ₂ MoO ₄ x 2 H ₂ O
   • 3 nM CoCl ₂ x 6 H ₂ O
   • 3 nM CuSO ₄ x 5 H ₂ O
   • 0.9 mM CaCl ₂ x 2 H ₂ O
   • 0.5 MgSO mm ₄ x 7 H ₂ O
   • 0,5 micron FeSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0,5 mM Na ₂ EDTA x 2 H ₂ O
   • 0.12 micron tiamina HCl
   • 0.16 micron acido nicotinico
   • 0,097 micron piridossina HCl
   • 0.107 micron NAA
   • 0.375 mM KH ₂ PO ₄
   • 0.061 NaH mM2 PO ₄ x 2 H ₂ O
   • 0,039 mM Na ₂ HPO ₄
   • Glicina 0,027 mM
   • 0.56 mM mio-inositolo
   • 1,5% di saccarosio
   • 10 mM K ¹⁴ NO ₃ o 10 mm K ¹⁵ NO ₃

NOTA: pH del mezzo JPL deve essere regolato a 5,7 con KOH. Il terreno deve essere sterilizzata mediante filtrazione o autoclave prima dell'uso.

2. Buffer H
   • 100 mM HEPES-KOH (pH 7.5)
   • 250 mM saccarosio
   • 10% (w / v) di glicerolo
   • 5 mM EDTA
   • Acido ascorbico 5 mM
   • 0,6% (w / v) PVP K-25 o K-30
   • 5 mM DTT (aggiungere fresco)
   • 1 PMSF mm (aggiungere fresco)
   • inibitori della proteasi e fosfatasi (aggiungere fresco)
     • 50 mM NaF
     • 1 mM Na ₃ VO ₄
     • 1 mM benzamidin
     • 0,3 micron mikrocystin
     • 4 micron leupeptina
     • inibitore della proteasi cocktail
3. Buffer R
   • Fosfato di potassio 5 mM
   • 0.33 M saccarosio
   • 3 mM KCl
   • 0,1 mM EDTA
   • 1 mM DTT (aggiungere fresco)
4. Buffer TNE
   • 25 mM Tris-HCl, pH 7.5
   • 150 mM NaCl
   • 5 mM EDTA
5. Sistema bifasico (6 g-sistema è adatto per un massimo di 15 g di peso fresco campione) Metodo di preparazione
   In 15 ml Falcon ingredienti della miscela tubo di seguito elencati e mescolare accuratamente:
   • 20% (w / w) destrano T500 - 2.6 g
   • 40% (w / w) poli (etilene glicole) (PEG 3350) - 1.3 g
   • saccarosio - 0,678 g
   • 0,2 M fosfato di potassio, pH 7,8-0,15 ml
   • 2 M KCl - 0.014 ml
   • aggiungere acqua fino massa totale del sistema bifasico è 6 g.
6. Soluzioni di saccarosio in tampone TNE
   • 2.4 M, 1,6 m, 1,4 m, 0,15 M
7. Reagenti per la digestione tripsina
   • UTU: 6 M urea, 2 M tiourea (pH 8,0 con 10 mM Tris-HCl)
   • Riduzione del buffer (1 mg / mL DTT in acqua, 6,5 mm)
   • Tampone Alchilazione (5 mg / ml iodoacetamide in acqua, 27 mm)
   • LysC endopeptidasi (0,5 mg / mL)
   • Tripsina, grado sequenza modificata (0,4 mg / mL)
8. Reagenti per peptide dissalazione oltre C ₁₈
   • soluzione di risospensione: acido 2% trifluoroacetico (TFA), 5% acetonitrile in acqua
   • soluzione A: 0,5% di acido acetico
   • Soluzione B: 80% acetonitrile, 0,5% di acido acetico
9. Reagenti per fosfopeptide arricchimento
   • Soluzione A: 0,1% TFA, 5% acetonitrile
   • Soluzione B: 0,1% TFA, 80% acetonitrile
   • TiO ₂ 10 micron
   • Ammoniaca (soluzione 25%)
   • Piperidina (magazzino 100%)

PROTOCOLLI

1. Etichettatura metabolica di Arabidopsis thaliana Culture sospensione cellulare

1. Grow Arabidopsis Col-0 cellcolture in sospensione derivate da foglie ¹⁷ in totale ¹⁴ N-JPL medio ^(18, vedere la sezione "reagenti comuni e tamponi") e una serie di culture in ¹⁵ N-JPL medio nel pallone sterile in condizioni di luce costante a 80-100 mmol / m ² s, 23 ° C, sotto costante agitazione a 120 rpm.
2. Per mantenere le colture cellulari, inoculare 400 ml di mezzo fresco JPL con 40 ml di sette giorni vecchia cultura di cellule in 1 L fiaschi.
3. La raccolta delle colture cellulari avviene attraverso aspirazione di vuoto attraverso un ampio imbuto di vetro con una maglia in acciaio inox. Cellule si accumulano sulla piastra e maglia nell'imbuto e possono essere facilmente raccolti da lì. Le cellule sono raccomandati per essere congelati a -80 ° C o in azoto liquido prima della macinazione.

NOTA: Per ¹⁵ N colture di cellule marcate metabolicamente usa il K ¹⁵ NO ₃ come unica fonte di azoto per almeno due passaggi in due settimane ^19. In esperiments per proteomica comparativa, usa una coltura di cellule etichettate ¹⁵ N ed anche mantenere una cultura senza etichetta in mezzo normale. Trattamento biologico sarà poi applicata alla cultura sia marcato o non marcato, mentre l'altro serve come controllo (Figura 1). Per la preparazione di proteine, entrambe le culture saranno combinati ^20. Quando si pianifica la configurazione sperimentale, si suggerisce di considerare una configurazione etichettatura reciproca ^4, in cui lo stesso trattamento viene applicato una volta al ¹⁵ celle N-etichettati e una volta alle cellule non marcate e la rispettiva senza etichetta o ¹⁵ celle N-etichettati servono come controlli. In questo caso, sono necessari i doppi quantità di colture cellulari.

2. Plasma membrana Purificazione

NOTA: Tutte le fasi successive sono effettuate in camera fredda e / o su ghiaccio meno che non sia indicato diversamente.

1. Omogeneizzare cellule da circa 1 L di 7 giorni di età colture in sospensione di cellule in azoto liquido.Il materiale può essere conservato a -80 ° C fino all'utilizzo.
2. Mescolare le stesse quantità di colture cellulari congelati etichettati e non etichettati in base al peso fresco in un becher e aggiungere 2 volumi di tampone H immediatamente. In caso di membrana preparazione microdominio si consiglia di utilizzare almeno 7 g peso fresco di entrambe le cellule etichettati e senza etichetta.
3. Porre il becher su un agitatore e agitare fino a quando il materiale viene fuso e la soluzione è liquido e senza cristalli di ghiaccio.
4. Filtrare l'omogeneizzato attraverso uno strato di miracloth in 50 ml provette da centrifuga.
5. Campioni di equilibrio con tampone H e centrifugare a 10.000 xg per 8 min.
6. Caricare il surnatante in tubi ultra-centrifuga pre-raffreddato (ad esempio per il rotore Beckman Coulter SW31Ti), con un volume di circa 32 ml
7. Campioni equilibrio con tampone H e pellet microsomi per centrifugazione a 100.000 xg a 4 ° C per 30 minuti con rotore Beckman SW32Ti.
8. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione.

NOTA: Il surnatante contiene proteine ​​solubili. Una piccola quantità di questa frazione può essere salvato per ulteriore precipitazione della proteina e successiva analisi anche di proteine ​​solubili.

9. Risospendere il pellet membrana di ciascun campione in quantità corrispondente di tampone R e caricare sulla sommità del U1 sistema bifasico (Figura 2). Se viene utilizzato il 6 g sistema bifasico, caricare esattamente 2 g di pellet risospeso membrana.

NOTA: Il volume finale di tampone R dipende dalle dimensioni del sistema a due fasi che sta per essere usato (~ 1,6 ml di tampone R è necessaria quando si utilizza il sistema 6 g). Si raccomanda di utilizzare meno buffer per risospensione in modo tampone puro può essere aggiunto su sistema bifasico per ottenere il peso richiesto, piuttosto che usando troppo buffer per solubilizzazione e non essere in grado di caricare l'intero campione sul sistema a due fasi.

10. Caricare lo stesso volume di tampone puro R come usato per the campione risospensione su U2.
11. Lentamente mescolare tubi U1 e U2 invertendo loro 30x (circa 1 inversione / sec).

NOTA: Non scuotere vigorosamente il sistema a due fasi. Può causare una mancanza di separazione delle fasi nel passo ultracentrifugazione.

12. Centrifugare i campioni a 1500 xga 4 ° C per 10 min.
13. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione.
14. Trasferire la fase superiore da U1 su U2 e ripetere centrifugazione a 1500 xga 4 ° C per 10 min.
15. Spostare la fase superiore degli U2 nei tubi ultracentrifuga SW41Ti e diluirlo con cinque volumi di tampone R e mescolare accuratamente.

NOTA: La fase superiore finale può essere diviso in tubi ultracentrifuga separati prima che possa essere diluito cinque volte.

16. Centrifugare i campioni a 200.000 xg a 4 ° C per un'ora utilizzando il rotore SW41Ti.
17. Risospendere membrana pellet in smalquantità l di tampone TNE (tipicamente 200 microlitri di buffer è usata) per l'isolamento di membrane resistenti detergenti.

NOTA: Una piccola quantità di questa frazione può essere salvato per l'analisi di membrana plasmatica non frazionata.

NOTA: La frazione di membrana plasmatica può essere conservato a 4 ° C per una notte prima di frazionamento nelle membrane resistenti detergenti e frazioni solubili detergenti.

3. Detergente Resistente membrana Preparazione

1. Controllare la concentrazione della frazione di membrana plasmatica mediante saggio Bradford.
2. Aggiungere Triton X-100 alla frazione di membrana plasmatica. La concentrazione finale di detersivo dovrebbe rimanere tra il 0,5-1%. Il detersivo di peso proteine ​​in rapporto al peso dovrebbe rimanere tra i 13-15.
3. Campioni Agitare a circa 100 rpm a 4 ° C per 30 min.
4. Aggiungere tre volumi di 2.4 M saccarosio a un volume della membrana plasmatica trattato per ottenere 1,8 M concentrazione finale di saccarosio.
5. Preparare il gradiente di saccarosio in tubi ultracentrifuga SW41Ti caricando le rispettive soluzioni di saccarosio in cima della frazione 1,8 M come illustrato nella Figura 3.
6. Centrifugare i campioni a 250.000 xg a 4 ° C per 18 ore utilizzando il rotore Beckman SW41Ti.
7. Rimuovere con attenzione i tubi ultracentrifuga dal rotore Per evitare di perturbare della banda a bassa densità che può essere visibile come un anello lattiginoso all'interfaccia di 0,15 M/1.4 M saccarosio. A volte non si vede niente ma la frazione contiene ancora la frazione proteica resistente detersivo.
8. Rimuovere frazione di volume di 0,75 ml dalla parte superiore del gradiente. Frazioni 2 e 3 che coprono volume di circa 1,5 ml di sopra dell'anello interfase e 0,5 ml di sotto rappresentano la frazione di membrana resistente ai detergenti. Raccogliere queste frazioni in provette da 15 ml Falcon. Frazioni 9 e 10 contengono la frazione di membrana solubile detersivo e possono essere rilevati anche per il confronto. Per un'analisi più approfondita, piscina fractioni 2 e 3, nonché frazioni 9 e 10.

4. Estrazione delle proteine ​​dalla Frazione Resistente detergente da metanolo / cloroformio

NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite nella temperatura ambiente.

1. Aggiungere 4 volumi di metanolo per le frazioni raccolte e vortex accuratamente.
2. Aggiungere 1 volume di cloroformio, vortice accuratamente.
3. Aggiungere 3 volumi di acqua, vortice accuratamente.
4. Centrifugare i campioni a 2.000 xg per 5 minuti usando una centrifuga da banco (es Eppendorf 5417R).
5. Rimuovere la fase acquosa di sopra dello strato proteina nell'interfase.
6. Aggiungere 3 volumi di metanolo, vortex accuratamente.
7. Centrifugare i campioni a 4.000 xg per 10 min.
8. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet. Il pellet essiccato è pronto per la digestione in soluzione.

5. In soluzione tripsina Digestione

NOTA: In questa procedura tutti i passi sono fatte atemperatura ambiente per ridurre derivatizzazione indesiderata di aminoacidi catene laterali dai denaturanti.

1. Sciogliere campione in piccolo volume di 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Utilizzare partire volume è compatibile con il campione (di solito circa 40 microlitri).
2. Spin campioni solubilizzati in UTU a 5.000 xg in una centrifuga da banco (es Eppendorf 5417R) per 10 min a pellet qualsiasi materiale insolubile.
3. Il pH della soluzione finale dovrebbe essere vicino a 8,0 per un'ottimale digestione tripsina. Verificare con le strisce di pH.
4. Aggiungere 1 ml di tampone di riduzione per ogni 50 ug di proteina campione e incubare per 30 min a temperatura ambiente.

NOTA: solo una stima approssimativa del tenore di proteine ​​è necessaria. Quando quantità di campione è limitato, è meglio sacrificare la precisione piuttosto che sprecare esempio in un saggio delle proteine.

5. Aggiungere 1 ml di tampone di alchilazione per ogni proteina campione 50 mg e incubare 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
6. Aggiungere 0,5 ml di lysC a 50 ug di proteine ​​del campione e incubare per tre ore a temperatura ambiente con agitazione costante a 700 rpm. Se necessario, il digest può essere eseguita anche durante la notte. Tuttavia, il tempo prolungato a temperature calde non è raccomandato in quanto può aumentare la perdita di peptide a causa di adsorbimento a materiale tubo di plastica sotto acquosi pH 8 condizioni.
7. Diluire il campione con quattro volumi 10 mM Tris-HCl, pH 8.

NOTA: Questo passaggio è assolutamente necessario diluire la concentrazione di urea come tripsina è molto sensibile a alto sale.

8. Aggiungere 1 ml di tripsina per 50 proteine ​​del campione mg e incubare una notte a temperatura ambiente con costante agitazione a 700 rpm.
9. Acidificare i campioni al 0,2% TFA concentrazione finale di raggiungere pH 2 (aggiungere circa 1/10 del volume di 2% di acido trifluoroacetico).

NOTA: I campioni possono essere conservati a - 20 ° C fino riutilizzato, ma è meglio conservareloro su StageTips a 4 ° C, se è per un breve periodo di tempo (una settimana) o memorizzarli dopo StageTips dissalazione.

6. Produzione di C _18-StageTips

1. Inserire un Empore Disk C18 su una superficie piana e pulita, come un piatto di plastica Petri usa e getta.
2. Punch out un piccolo disco utilizzando un ago ipodermico a punta smussata con diametro di 1,5 mm. Il disco infila l'ago e può essere trasferito in un puntale.
3. Spingere il disco esce l'ago e fissarlo nella rastrematura di una punta di pipetta da un pezzo di silice o montaggio nell'interno dell'ago tubo fuso.

NOTA: StageTips possono essere conservati asciutto a temperatura ambiente ^21.

7. L'uso di C _18-StageTips per Peptide Desalting e concentrazione

1. Condizionare una C _18-StageTip ponendo 50 ml di soluzione B sul StageTip preparato. Gira la punta nella centrifuga a 2000 rpm per 2 minuti in un banco centrifuge (es Eppendorf 5417R).

NOTA: utilizzare adattatori a girare StageTips in una centrifuga Eppendorf, verrà raccolto il liquido in un tubo da 2 ml. Per i preparati su più vasta scala, consigli stadio può anche essere posizionato in un rack punta con 96 delle punte di 200 microlitri e liquidi possono essere raccolti in una micropiastra.

NOTA: Non utilizzare velocità superiori di 3.000 xg in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R) a causa del rischio di girare il disco C ₁₈ dalla punta.

2. Equilibrare il StageTip utilizzando una soluzione di 100 ml A. Spin la punta nella centrifuga a 5000 xg in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
3. Ripetere il passo 2.
4. Campione del carico sul disco pipettando attentamente il campione nella punta della pipetta con il disco interno.

NOTA: Un disco può legare ca. 100 mg di proteina.

5. Far girare le punte del centrifuge finché l'intero volume di campione passa attraverso il disco C _18.
6. Lavare le StageTips due volte con 100 ml di soluzione di A. girare le punte nella centrifuga.

NOTA: Le StageTips lavate e caricate possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di una settimana.

7. Eluire campione con 40 ml di soluzione B. Raccogliere l'eluato in un nuovo 1,5 ml tubo di reazione.
8. Concentrare il campione nella speed vac. In condizioni ideali, interrompere il processo di disidratazione in quanto vi è solo 1 o 2 ml di liquido partita.

NOTA: secca campioni possono essere conservati a -80 ° C per anni.

9. Aggiungere un volume finale di 9 ml di soluzione di risospensione al campione e trasferirlo alla piastra di microtitolazione per l'analisi spettrometro di massa.

NOTA: Il volume finale del buffer risospensione usato dipende dalle esigenze di sperimentatore e la sensibilità dello spettrometro di massautilizzato.

8. Protocollo per fosfopeptide arricchimento Alternative

NOTA: Per fosfopeptide arricchimento, l'estrazione delle proteine ​​nel passaggio 2 deve essere realizzata in presenza di inibitori di fosfatasi.

NOTA: la concentrazione di proteine ​​esatta non deve essere determinato per le seguenti fasi. E 'sufficiente avere una stima approssimativa del tenore proteico per evitare la perdita del campione inutili

1. Preparare la C _8-StageTips (seguire lo stesso protocollo per la preparazione di C _18-StageTips al punto 6).
2. Trasferire 1 mg di TiO _2-beads all'inizio preparato C _8-StageTips (uso 1 mg TiO ₂ per 100 mg di proteina).
3. Equilibrare le TiO ₂ punte con 100 ml di soluzione C, centrifuga a 2.000 xg per 5 minuti in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
4. Miscelare 100 mg di peptidi digeriti e dissalate dal passo 7.7 (dovrebbe essere in 100 ml di soluzioneB) con 100 ml di soluzione A.
5. Caricare campione misto sulle equilibrate TiO ₂ colonne; centrifuga a 1000 xg, 5 min.
6. Raccogliere il flow-through e caricarlo sulla stessa punta di nuovo (mantenere il flusso attraverso dopo il secondo passaggio).
7. Lavare punta con 100 ml di soluzione A, centrifuga a 2000 xg, 5 min in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
8. Eluire campione con 50 ml di 5% di ammoniaca.
9. Eluire campione con 50 ml di 5% piperidina (entrambi eluati possono essere combinati).
10. Subito acidificare il campione con 50 ml di 20% di acido fosforico. pH dovrebbe essere di circa 2.

NOTA: Salvare le TiO ₂ punte e recuperare la polvere. Può essere lavato con soluzione B e riutilizzato per uno o due giri più.

11. Ancora una volta desalt campioni acidificati su C ₁₈ consigli (vedi punto 8).

9. LC-MS/MS Analisi del Peptide miscele

1. Risospendere fosf dissalatoopeptides in tampone risospensione.
2. Carico risospeso campione sul sistema LC-MS/MS di scelta e acquisire spettri in modo dipendente dati a suggerito risoluzione di 60.000 larghezza a metà altezza.

NOTA: Per la frammentazione ottimale, sia la scansione neutro perdita deve essere applicato ^{il 22,} o, se disponibile l'attivazione multistadio ^23. Se ETD è disponibile ciò consentirà scheletro peptidico frammentazione senza perdita di acido fosforico ^24.

NOTA: elenchi picco da dati grezzi devono essere estratti e presentata Identificazione database nonché per la quantificazione. Qui, descriviamo le impostazioni per utilizzare Mascot e MSQuant, che lavora per i file di dati grezzi da LTQ, LTQ-Orbitrap e strumenti LTQ-FT (Thermo Scientific).

3. Estrarre elenco di picco utilizzando DTAsupercharge all'interno del menu "Helper" in MSQuant. Utilizzare le impostazioni predefinite.
4. Inviare file risultante elenco di picco motore di ricerca Mascot. CrImpostazioni itical: precursori di ioni di massa tolleranza di 10 ppm, MS / MS tolleranza di massa 0.5 bis. Fisso modifiche: carbamidometilazione di cisteine, modifiche variabili: ossidazione della metionina, fosforilazione di serina, treonina, tirosina. Metodo di quantificazione: ¹⁵ N marcatura metabolica.
5. Salva risultato Mascot come file della pagina web.
6. Caricare file dei risultati della mascotte e il file raw in MSQuant. Selezionare tutte le proteine ​​di interesse ed eseguire "quantificazione automatica". Il programma leggerà spettri a scansione totale del file raw e fare integrazione di picco per i partner etichettati e senza etichetta di ciascun peptide.
7. Risultati Export quantificazione ad un programma di foglio di calcolo o un file di testo delimitato da tabulazioni. I dati possono poi essere sottoposti ad ulteriori analisi statistica in Excel o utilizzando altri pacchetti software come Statquant ²⁵ o CRACKER ^26.

Risultati

Con il protocollo presentato utilizzando colture cellulari Arabidopsis marcate metabolicamente è possibile isolare le membrane plasmatiche da tessuto vegetale (step2, figure 2 e 4), e per arricchire resistente detergenti frazioni di membrana all'interno della membrana plasmatica (passaggio 3, figure 3 e 5). Successivamente, il protocollo consente l'estrazione di proteine ​​da questi detergenti resistente frazioni di membrana (step 4) e digestione della proteina per...

Discussione

Il protocollo qui presentato contiene molti passaggi e tutti sono cruciali per ottenere frazionamento puro e rappresentativo della membrana plasmatica pianta nelle membrane resistenti detersivo e frazioni solubili detergenti. Pertanto, è importante seguire ogni passo le istruzioni.

Trattamento della frazione di membrana plasmatica con detergente non ionico (passo 3.2) ha la più forte influenza sulla qualità della membrana microdomini frazionamento. Per ottenere risultati riproducibili tra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph