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摘要

蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质为小分子的组织成像;对于使用DT的内源性脂质的对的MALDI成像协议这里所提供的组织切片由正离子的MALDI-MS在一个超高分辨率四极-FTICR仪器表面。

摘要

质谱成像（MSI）确定的组织切片的表面上的化合物的空间定位和分布模式，主要使用MALDI（基质辅助激光解吸/电离）为基础的分析技术。需要新的矩阵为小分子的MSI，从而可以提高低分子量（MW）的化合物的分析。这些矩阵应提供增加分析物的信号，同时降低MALDI背景信号。另外，使用超高清晰度的仪器，如傅立叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪，具有从矩阵信号解析分析物信号的能力，这可以部分地克服与来自MALDI背景始发相关的许多问题矩阵。在亚稳态矩阵集群由FTICR MS的强度的降低也有助于克服一些与其他乐器基质峰相关联的干扰。高分辨率文书，如FTICR质谱仪是有利的，因为他们可以同时产生许多化合物的分布模式，同时还提供信心的化学鉴定。蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质用于组织成像。在这项工作中，一个协议的使用DT的用于MALDI成像从哺乳动物组织切片表面的内源性脂的，由正离子的MALDI-MS，对超高清晰度混合四极FTICR仪器已经提供。

引言

质谱成像（MSI）是一种分析技术，用于确定组织部分1,2的表面上的化合物的空间定位和分布模式。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）微星多肽和蛋白质的分析已经使用了十多年，也有过在样品制备，检测灵敏度，空间分辨率，可重复性和数据处理方法3,4很大的改进。从组织学染色切片和MSI实验相结合的信息，病理学家能够具体化合物的分布与病理生理学有趣的功能5相关。

小分子，包括外源性药物6,7及其代谢物8-10的分布格局也被审问MALDI-MS组织成像11。脂类也许是最广泛研究共轭亚油酸SS与MALDI成像化合物，无论是在12-17的MS和MS / MS 18模式。为小分子成像中使用的MALDI MSI的已经被限制由几个因素：1）的MALDI基质本身是小分子（通常为M / Z <500），其产生大量的离子信号。这些丰富的信号可以抑制小分子分析物的电离，干扰他们的检测19,20。无溶剂基质涂料21，矩阵升华22，以及矩阵预涂MALDI MS 23，除其他外，已经开发了改进的小分子的MSI。

新的矩阵，可以提高低分子量化合物的分析是在小分子微星极大的兴趣。这些矩阵应提供增加的信号分析与降低矩阵信号。在正离子模式下，2,5 -二羟基苯甲酸（DHB）和α-氰基-4 -羟基肉桂酸（CHCA）是两种常用的MALDI MS矩阵MSI 24 。理想的基质会形成小晶体，从而保留分析物的空间定位。 DHB容易形成较大的晶体，因此施加利用升华的基质已经开发出来，部分地克服这一问题，并允许使用该矩阵的对磷脂22,25的敏感成像。 9 -氨基吖啶已经用于质子分析物的MSI在正离子模式26和用于核苷酸和磷脂在负离子模式26-29。 2 -巯基苯并已发现，得到高效的MALDI检测脂类30的，并已被用于小鼠脑的成像神经节苷脂31。傅立叶变换的超分辨率变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪可以通过从矩阵信号32解决分析物的信号有所缓解这个问题。利用FTICR-MS法的另一个优点是，亚稳的矩阵簇的强度是红眼版33，这也降低这些干扰27。

使用地蒽酚的（DT; 1,8 -二羟基-9,10 -二氢蒽-9 -酮）作为MALDI基质用于组织成像先前已报道34。在当前的工作中，一个详细的协议提供了一种用于对牛晶状体组织切片的表面上使用DT的内源性脂质的MSI，在正离子模式。

研究方案

1。组织切片

  1. 闪光冻结问题的标本，一次采收，使用液氮，把它们运干冰上（如需要运费），并将其存储于-80℃直至组织切片。 （如果商业样品的使用，保证了样品制备以这种方式。）
  2. 剪下机关管理的大小以适合MALDI靶。修剪过的器官任何不需要的部分。在这项研究中这里所描述，小牛镜头采用组织切片之前，先前描述的方法35解封装。
  3. 从-80℃冰箱中取出整个器官和解决这些问题上的低温组织切割阶段。要修复与小牛的镜头，放置在低温恒温器的组织切段一两滴的水。迅速将透镜在水中凝固之前。可选地，最佳切割温度（OCT）化合物也可用于修复组织到切割阶段。如果OCT化合物时，微型OCT的正常量应该被应用，并应小心，以确保切的组织切片不会与十月化合物可与电离和检测分析物5,36,37的干扰污染。
  4. 使低温恒温器内的温度平衡至-18℃。寒冷或温暖的温度，可用于较软或较硬的组织，分别为。然后切组织平展到20微米厚的切片。用10-15微米厚的薄片对于大多数组织;，因为牛晶状体组织的脆弱性，然而，20微米厚的切片使用。牛镜头纸，舍弃前组织切片，并只用切片，其中接近或在赤道平面。
  5. 如果目镜组织进行拍摄，使用1.5微升甲酸（98％的纯度，LC-MS级），以预湿的铟锡氧化物（ITO）涂覆的玻璃载片的表面上。
  6. 组织切片小心转移至ITO的共同的表面低温恒温器内ATED玻璃显微镜幻灯片。组织切片将迅速解冻，将成为紧紧地贴在滑动面。通常，多个组织切片可以安装到这样一个相同的ITO膜的滑动。
  7. 冻干幻灯片的MALDI基质申请前15分钟。
  8. 对于矩阵测试，溶于适当溶剂中的各个矩阵。手动发现1微升每个矩阵解决方案到组织切片。此外，发现一个小分子校准标准到组织核实MALDI灵敏度。
  9. 加3教学马克在ITO涂覆的玻璃载片的记录对与校正液笔在ITO涂覆的玻璃载片上的不导电的表面上。采取使用平板扫描仪的组织切片的光学图像并将其保存在一个合适的格式，如TIFF或JPG格式。

2。矩阵涂层

2.1。自动化矩阵涂层

  1. 美联社帘布层基质溶液，其中含有乙腈或混合的乙腈/水作为溶剂，自动使用Bruker的ImagePrep或类似的电子矩阵喷雾器中的组织切片的表面。
  2. 用胶带贴在带ITO膜的玻璃载片的前表面的边缘，以使基质不涂层的滑动的边缘。这确保了可用于组织切片对准的相反表面上的教学痕。不覆盖矩阵滑动的边缘，因为它们被用​​作接触点维持ITO涂覆载片的导电性。
  3. 涂层通过使用矩阵涂层（2 - 仲丁基喷雾，30秒温育，和60秒的干燥时间为每个周期）的20个循环的载玻片上。

2.2。人工基质涂层

  1. 如果有机溶剂（ 例如氯仿和乙酸乙酯），它们与电子矩阵喷雾器的制造材料是不兼容的，地磁红色，使用一个气动辅助喷枪喷涂应用矩阵。所制备的基质溶液加入到喷枪枪的溶剂储存并应用加压氮气水流平缓，以最优惠的喷雾。
  2. 覆盖ITO涂布的载玻片用磁带的前表面的边缘，以使基质不涂层的滑动件的边缘。这确保了可用于组织切片对准的相反表面上的教学痕。不覆盖矩阵滑动的边缘，因为它们被用​​作接触点维持ITO涂覆载片的导电性。
  3. 经过稳定和精细喷雾已经观察到，手动喷矩阵，使其完全覆盖在组织切片。应用的每个周期期间，以勉强润湿表面，以防止可能的分析物的离域所需的基质溶液的最小量。在一般情况下，使用约10个循环矩阵喷雾涂覆的组织切片;周期数是依赖于组织类型和基质组合物。

3。 MALDI质谱

  1. 水（含0.1％甲酸的最终混合物）：通过稀释“ES调谐混合”标准由1:200的因子在60:40异丙醇溶液中制备一个质量校准溶液。
  2. 引入2微升/稀释的“ES调谐混合”溶液到双模式电喷雾电离（ESI）/ MALDI离子源上的FTICR质谱计，从ESI侧最小。
  3. 操作的FTICR仪器中的正离子ESI模式，随着宽带检测和1024字节/秒的一个数据采集的大小。典型ESI参数是毛细电电压，3900伏;喷屏蔽电压，3600伏;雾化气体（N 2）流量，2升/分钟;干气（N 2）流量和温度，4升/分钟和200℃;撇油器1电压，15伏;的飞行（TOF）的时间，0.009秒;碰撞气（Ar）流量0.4升/秒;源离子累积时间，0.1秒;和碰撞池的离子累积时间，0.2秒。调，以便最大限度地在质量范围从M / Z 200至1400的分析灵敏度，同时保持良好的时域的自由感应衰减（FID）信号的FTICR操作的参数。通常情况下，ICR操作参数搭档电压8伏; Sidekick的失调电压，8 V，10励磁放大;激励脉冲时间，0.01-0.015秒;前面的活板电压，1.5伏;回来的活板电压，1.6 V和分析器入口电压，-4 V后一组FTICR运行参数已经确定，收购ESI质谱和使用参考群众的标准化合物中的“ES调音混音”的解决方案校准仪器。
  4. 要调整仪器用于MALDI操作，溶解混合特非那定和利血平标准溶液中在每个1微米的浓度基质溶液的几个1微升等份，并发现这些解决方案直接到布甲之一Ë部分（ 即一个测试组织切片），已安装在涂有ITO的幻灯片。将ITO涂层滑入一个组织切片转接器（ 即一种特殊的MALDI靶），并从电离侧加载适配器插入双ESI / MALDI离子源。优化激光功率和激光发射的数目为每个质量扫描MALDI信号积累等适当的MALDI操作参数典型的MALDI操作参数包括：激光枪，50和300 V. MALDI板上电压
  5. 调谐后，校准和优化工具用于MALDI-MSI的实验中，使组织切片与成像软件中的记录的光学图像进行成像的物理位置。使用三点三角测量方法使用三个“校正流体”标记，这先前已经提上了ITO膜的滑动面的相反侧（步骤1.9），此对齐。
  6. 执行同步ESI和MALDI操作，使每个质谱图包含了收购后的内部质量校准的“ES调音混合”解决方案的参考质量峰。这将导致在MALDI MS的最准确的质量测定。要做到这一点，首先通过降低毛细管电压，直到电离信号主宰谱，而ESI校准信号仍然不够高，内部质量校准衰减ESI信号。
  7. 接下来，建立一个自动化的光栅扫描方法，激光照射。定义组织区域进行成像并设置适当的激光光栅步长。需要注意的是较小的栅格步长提供更高的分辨率组织图像，但需要一个较长的显著质谱采集时间和更多的数据存储空间。该图像的像素的数目是依赖于激光光栅的步长来设置和组织的大小。对于一个典型的牛晶状体具有1cm 2的面积的组织中，组织图像通常由约的。 的，如果为200微米的激光光栅的步长是用在一个FTICR仪器5000像素。使用一个“随机点”的分析，因为这可以防止基于位置的偏差是由于渐进信号的衰减在实验过程中。

4。数据分析

  1. 使用内部校准的初始比较来校准MALDI质谱和选择的MS / MS峰。德同位素，并选择如前所述的单一同位素峰，使用自定义的VBA脚本38。
  2. 导出所得到的单一同位素峰列表和输入测量的m / z值到METLIN 39和/或用于质量匹配的库条目的HMDB 40代谢组数据库。在数据库检索数据考虑（M + H）+，（M + Na）的+和（M + K）+离子，具有±1ppm的可允许的误差质量。
  3. 生成图像的MALDI所有在用IMAG整个组织切片检测脂质实体电子分析软件，具有1 ppm在峰顶一个质量过滤器的宽度。
  4. 一旦图像已生成匹配数据库中的条目，所有m / z值，生成图像的所有其他峰，以及寻找可以在以后调查独特的分布格局。

5。成像的脂质中的身份确认

  1. 确认的高丰度的脂质，其具有可以利用的FTICR仪器（ 如 184.073为磷脂）进行检测，通过MALDI-MS/MS特征碎片离子的身份。使用碰撞诱导解离（CID）直接对组织进行MALDI-MS/MS。
  2. 对于不能由MALDI-MS/MS直接证实了这些脂质物种中，使用耦合到Q-TOF质谱仪34 UPLC系统。
    1. 手动解剖含有〜10从其中所关注的物种是局部的区域毫克组织的等分试样。把这些组织等分成2毫升离心管中。
    2. 均质组织各等分在250微升的水，用搅拌机磨用两个5毫米的不锈钢金属球。
    3. 加入1毫升氯仿 - 甲醇溶液（1:3，V / V），和涡流管。接着，离心分离用离心，12,000 xg离心10分钟，在试管中。
    4. 收集上清液并擦干他们在一个转速真空浓缩。
    5. 溶解残留物中加入100μl30:70异丙醇：水。注入10微升等分到UPLC色谱柱使用梯度洗脱分离。
    6. 使用的色谱条件为在线脂质LC-MS/MS，先前已公布的34。
    7. 产生提取的离子电流（XIC）色谱图使用的理论m / z值，为±百万分之50左右的理论质量的一个窗口。
    8. 如果可用正宗的化合物对于那些血脂，搭配地道的化合物的保留时间与那些对应的从组织样本对应XIC峰。如果化合物是相同的，保留时间和MS / MS谱图应该匹配。
  3. 如果一个地道的化合物是不可用的，使用检测脂质碎片模式匹配从代谢组数据库，如METLIN或HMDB标准的MS / MS谱。用从头质谱解释，确定一个可能的结构脂质。

结果

被切片，解冻安装在ITO镀膜载玻片组织样本应完好，无明显的撕裂。对于许多组织，直接组织解冻安装到的ITO镀膜玻璃幻灯片是可以接受的。对于一些特定的组织如牛晶状体中，组织的广泛撕裂常常看到时直接解冻安装时（ 图1a）。用乙醇或甲酸在ITO玻璃载玻片的预涂（ 图1b）有助于保持组织切片的组织安装时的完整性。

矩阵两者的选择和溶剂?...

讨论

最重要的考虑因素，成功MALDI微星是：1）组织准备; 2）基质的选择; 3）矩阵的应用，以及4）数据的解释和分析。当样品和基质被适当地制备时，MS数据采集是自动化的。从这种类型的实验的数据分析是相当费力。

适当的组织准备是成功的MALDI微星实验的关键。组织的来源和处理可以对最终的分析有很大的影响。样品必须立刻闪在液氮中冷冻并储存在-80℃，并且它们不应被存储...

披露声明

我们什么都没有透露。

致谢

作者要感谢加拿大基因组和基因组不列颠哥伦比亚省为平台的资金和支持。我们也感谢博士卡罗尔E.帕克的稿件和编辑援助的严格审查。 CHL也感谢不列​​颠哥伦比亚省蛋白质组学网络支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Rat LiverPel-Freez Biologicals56023-2
Bovine Calf LensPel-Freez Biologicals57114-2Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)Sigma-Aldrich10608MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)Sigma-Aldrich85707MALDI Matrix
ReserpineSigma-Aldrich83580
TerfenadineSigma-AldrichT9652
Formic AcidSigma-Aldrich14265
Ammonium FormateSigma-Aldrich14266
Ammonium HydroxideSigma-Aldrich320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)Sigma-Aldrich302031
WaterSigma-Aldrich39253
MethanolSigma-Aldrich34860
AcetonitrileSigma-Aldrich34967
Ethyl AcetateSigma-Aldrich34972
IsopropanolSigma-Aldrich34965
ChloroformSigma-Aldrich366927
AcetoneSigma-Aldrich34850
EthanolCommercial Alcohols95%
ES Tuning MixAgilent TechnologiesG2431A
ITO Coated Glass SlidesHudson Surface TechnologyPSI1207000Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction PenBicWOSQP11
Airbrush SprayerIwataEclipse HP-CS
ImagePrepBruker249500-LS
MALDI adapterBruker235380

参考文献

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