Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

Summary

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמה של מולקולות קטנות; פרוטוקולים לשימושם של DT להדמית MALDI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות על ידי חיובי יון MALDI-MS במכשיר quadrupole-FTICR רזולוציה ultrahigh מסופקים כאן.

Abstract

הדמיה ספקטרומטריית מסה (MSI) קובע את דפוסי לוקליזציה ופריסה המרחבית של תרכובות על פני השטח של קטע רקמה, בעיקר באמצעות MALDI (desorption / יינון מטריצת סיוע לייזר) מבוססת טכניקות אנליטיות. מטריצות חדשות למולקולה קטנה MSI, אשר יכול לשפר את הניתוח במשקל מולקולרי נמוך תרכובות (MW), יש צורך. מטריצות אלה אמורות לספק אותות אנליטי מוגבר תוך הפחתת אותות רקע MALDI. בנוסף, השימוש במכשירים ברזולוציה ultrahigh, כגון התמרת התהודה הציקלוטרון יון (FTICR) ספקטרומטר מסות, יש לו את היכולת לפתור את אותות אנליטי מאותות מטריקס, וזה באופן חלקי יכול להתגבר על בעיות רבות הקשורות לרקע שמקורם MALDI מטריצה. ההפחתה בעוצמות של אשכולות מטריצת metastable ידי FTICR טרשת נפוצה יכולה גם לעזור להתגבר על חלק מההפרעות הקשורות לפסגות מטריצה ​​על מכשירים אחרים. ברזולוציה גבוההמכשירים כגון ספקטרומטר מסות FTICR הם יתרון כפי שהם יכולים לייצר דפוסי הפצה של תרכובות רבות בו זמנית תוך מתן אמון בהזדהויות כימיות. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמות. בעבודה זו, פרוטוקול לשימוש בDT הדמיה MALDI של שומני אנדוגני מהמשטחים של חלקי רקמות של יונקים, על ידי חיובי יון MALDI-MS, בquadrupole היברידי הרזולוציה ultrahigh מכשיר FTICR כבר סיפק.

Introduction

הדמיה ספקטרומטריית מסה (MSI) היא שיטה אנליטית לקביעת דפוסי לוקליזציה ופריסה המרחבית של תרכובות על פני השטח של קטע רקמת ^1,2. desorption / יינון לייזר מטריקס סייע (MALDI) MSI לניתוח של פפטידים וחלבונים היה בשימוש כבר למעלה מעשור וחל שיפור רב בשיטות להכנת מדגם, רגישות זיהוי, ברזולוציה מרחבית, שחזור ועיבוד נתונים ^3,4. על ידי שילוב מידע מסעיפים מוכתמים בהיסטולוגיה וניסויים MSI, פתולוגים יכולים לתאם את החלוקה של תרכובות ספציפיות עם תכונות מעניינות pathophysiologically ^5.

דפוסי ההפצה של מולקולות קטנות, כוללים תרופות אקסוגניים ^6,7 ומטבוליטים שלהם ^8-10 גם נחקרו על ידי ההדמיה של רקמות MALDI-MS ^11. שומנים הם אולי CLA הנפוץ ביותר למדss של תרכובות עם ההדמיה MALDI, הן ^ב18 מצבי MS ^12-17 ו-MS / MS. השימוש בMALDI MSI הדמיה מולקולה קטנה היה מוגבל על ידי מספר גורמים: 1) מטריצות MALDI הם עצמם מולקולות קטנות (בדרך כלל מ '/ z <500), אשר יוצרות אותות יון בשפע. אותות בשפע אלה יכולים לדכא היינון של analytes מולקולה קטנה ולהפריע ^ל19,20 זיהוי שלהם. ציפוי ממס ללא מטריצה ^​​21, סובלימציה מטריצת ^22, ומטריצת precoated MALDI MS ^23, בין השאר, פותחו על מנת לשפר את MSI של מולקולות קטנות.

מטריצות חדשות שיכול לשפר את הניתוח של תרכובות הנמוך MW הן עניין רב במולקולה הקטנה MSI. מטריצות אלה אמורות לספק אותות אנליטי מוגבר עם אותות מטריקס ירד. במצב החיובי יון, 2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) וα-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) הם שתי מטריצות MALDI MS נפוצות ^ל24 MSI . המטריצה ​​האידיאלית תהיה ליצור גבישים קטנים, כדי לשמר את הלוקליזציה המרחבית של analytes. DHB נוטה ליצור גבישים גדולים יותר, ולכן החלת המטריצה ​​באמצעות סובלימציה פותחה באופן חלקי להתגבר על בעיה זו, ואפשרה את השימוש במטריצה ​​זו להדמיה רגישה של פוספוליפידים ^22,25. 9-Aminoacridine שמש במשך MSI של analytes protic במצב ²⁶ חיובי יון ולנוקלאוטידים ופוספוליפידים ^ב26-29 המצב השלילי יון. 2-Mercaptobenzothiazole כבר מצא לתת גילוי MALDI יעיל של שומנים ^30, ומאז משמש עבור ההדמיה של מוח עכבר gangliosides ^{ביום 31.} הרזולוציה ultrahigh של התמרת התהודה הציקלוטרון יון (FTICR) ספקטרומטר מסות מעט יכול להקל על בעיה זו על ידי פתרון אותות אנליטי מאותות מטריצת ^32. יתרון נוסף של השימוש בFTICR-MS הוא שהעוצמות של אשכולות מטריצת metastable הן reduc³³ אד, אשר גם מפחית הפרעות אלה ^27.

השימוש בdithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמות כבר דווחה בעבר ^34. בעבודה הנוכחית, פרוטוקול מפורט מסופק לשימושם של DT לMSI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות עדשת שור, במצב החיובי יון.

Protocol

1. חתך רקמה

1. פלאש להקפיא את דגימות הנושא, שנקטפו ברגע, תוך שימוש בחנקן נוזלי, לשלוח אותם בקרח יבש (אם נדרש משלוח), ולאחסן אותם ב-80 ° C עד חתך רקמות. (אם דוגמאות מסחריות נמצאות בשימוש, להבטיח כי הדגימות שהוכנו באופן זה.)
2. לחתוך איברים לגודל לניהול כדי שיתאים ליעד MALDI. לקצץ את כל חלקים לא רצויים של האיבר. במחקר זה שתואר כאן, עדשות עגל שור היו decapsulated באמצעות הליך בעבר תאר ³⁵ לפני חתך רקמות.
3. הסר את כל האיברים מ-80 ° C במקפיא ולתקן אותם על במה חיתוך רקמות קירור. כדי לתקן עדשת עגל שור, הנח טיפות מים אחד או שתיים על הבמה חיתוך הרקמות של cryostat. במהירות למקום העדשה במים לפני שהוא מתמצק. לחלופין, הוא יכול לשמש גם תרכובות טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) כדי לתקן רקמה על הבמה החיתוך. אם תרכובות אוקטובר משמשות, מיניסכום mal של אוקטובר צריך להיות מיושם ויש להקפיד על מנת להבטיח כי חלקי רקמות קיצוץ לא יהיו מזוהמים בתרכובות אוקטובר אשר יכול להפריע ליינון וזיהוי של analytes ^5,36,37.
4. לאפשר את הטמפרטורה בתוך cryostat לאזן ל-18 ° C. טמפרטורות קרות או חמים יותר יכולות לשמש לרקמות רכות יותר או קשים יותר, בהתאמה. ואז לחתוך את הרקמה equatorially ל20 מיקרומטר פרוסות עבות. השתמש 10-15 פרוסות עבות מיקרומטר עבור רוב הרקמות, עם זאת, בשל האופי השברירי של רקמת עדשת שור, 20 מיקרומטר פרוסות עבות היו בשימוש. לרקמת עדשת שור, לבטל את סעיפי הרקמות הראשונים ולהשתמש רק בפרוסות שהם קרובים או במטוס המשווני.
5. אם רקמת עדשת העין היא הדמיה, השתמש 1.5 μl של חומצה פורמית (98% בטהרה, הכיתה LC-MS) לprewet פני השטח של תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) מצופה שקופיות זכוכית.
6. להעביר בזהירות את חלקי רקמות אל פני השטח של איטו השותףשקופיות זכוכית מיקרוסקופיות ated בתוך cryostat. קטע הרקמה יהיה להפשיר במהירות וביהפוך בחוזקה מודבקת אל פני השטח של השקופית. בדרך כלל, יכולים להיות מותקנים סעיפי רקמות מרובים על אותו שקף מצופה איטו בדרך זו.
7. Lyophilize השקופית ל15 דקות לפני יישום מטריצת MALDI.
8. לבדיקת מטריקס, לפזר את המטריצות בודדות בממסים מתאימים. באופן ידני במקום 1 μl של כל פתרון מטריצה ​​על קטע הרקמה. בנוסף, במקום סטנדרטי כיול מולקולה קטנה על הרקמות לצורך האימות של רגישות MALDI.
9. מוסיף שלושה סימני הוראה לשקופית זכוכית איטו המצופה על ידי כתיבה על פני השטח nonconductive של שקופיות זכוכית איטו מצופים עם עט תיקון נוזל. קח את התמונה אופטית של שקופית הרקמות באמצעות סורק ולשמור אותו בפורמט מתאים, כגון TIFF או jpg.

2. מטריקס ציפוי

2.1. אוטומטי מטריקס ציפוי

1. Apפתרונות מטריקס רובדי, המכילים אצטוניטריל או אצטוניטריל / מים מעורבים כממסים, באופן אוטומטי למשטחים של חלקי רקמות באמצעות ImagePrep ברוקר או מרסס מטריצה ​​אלקטרונית דומה.
2. כסה את הקצוות של המשטח הקדמי של שקופית הזכוכית המצופה-איטו עם קלטת כך שהמטריצה ​​לא מעיל הקצוות של השקופיות. הדבר מבטיח כי סימני ההוראה על פני השטח ההפוך יכולים לשמש ליישור שקופיות רקמות. אל תכסה את הקצוות של השקופיות עם מטריצה ​​כפי שהם משמשים כנקודות מגע כדי לשמור על מוליכות החשמלית של השקופית מצופה איטו.
3. מעיל שקופיות הזכוכית באמצעות עשרים מחזורים של ציפוי מטריקס (תרסיס 2-sec, דגירה 30-sec, ו60-sec זמן ייבוש לכל מחזור).

2.2. ציפוי מטריקס ידני

1. אם ממסים אורגניים (למשל כלורופורם ואתיל אצטט) שאינם מתיישבים עם חומרי הייצור של מרסס המטריצה ​​האלקטרוני הם requiאדום, להשתמש במרסס airbrush pneumatically בסיוע ליישם את המטריצה. מוסיף את פתרון המטריצה ​​מוכן למאגר הממס של אקדח airbrush ולהחיל זרימה עדינה של גז חנקן בלחץ לראש התרסיס.
2. כסה את הקצוות של המשטח הקדמי של שקופיות זכוכית מצופים איטו עם קלטת כך שהמטריצה ​​לא מעיל הקצוות של השקופיות. הדבר מבטיח כי סימני ההוראה על פני השטח ההפוך יכולים לשמש ליישור שקופיות רקמות. אל תכסה את הקצוות של השקופיות עם מטריצה ​​כפי שהם משמשים כנקודות מגע כדי לשמור על מוליכות החשמלית של השקופית מצופה איטו.
3. לאחר תרסיסים יציבים וקנס כבר ציינו, לרסס באופן ידני את המטריצה ​​כך שמעיילי קטע הרקמה לחלוטין. להחיל את הסכום המינימאלי של פתרון המטריצה ​​נדרש בקושי להרטיב את פני השטח במהלך כל מחזור כדי למנוע delocalization אנליטי האפשרי. באופן כללי, השתמש כ 10 מחזורים של ספריי מטריצה ​​למעייל קטע רקמה; מספר המחזורים הואתלוי בסוג הרקמה ובהרכב מטריצה.

3. MALDI MS

1. הכן פתרון כיול המוני על ידי דילול הפתרון "ES כוונון המיקס" הסטנדרטי בפקטור של 1:200 ב60:40 isopropanol: מים (המכיל חומצה פורמית 0.1% בתערובת הסופית).
2. מציג 2 μl / min של הפתרון המדולל "ES כוונון המיקס" ליינון electrospray מצב הכפול / מקור MALDI יון בספקטרומטר מסת FTICR, מהצד ESI (ESI).
3. הפעלת מכשיר FTICR במצב ESI החיובי יון, עם זיהוי פס רחב וגודל רכישת נתונים של 1,024 קילו / sec. פרמטרים ESI אופייניים הם מתח electrospray נימים, 3,900 V; לרסס מתח מגן, 3,600 V; גז nebulizer (N ₂₎ זרימה, 2 ליטר / דקה; גז יבש (N ₂₎ לזרום וטמפרטורה, 4 ליטר / דקה ו200 מעלות צלזיוס; רחפן מתח 1, 15 V; זמן של הטיסה (TOF), 0.009 שניות; זרימת גז התנגשות (Ar), / s 0.4 L; זמן הצטברות יון מקור, שניות 0.1;וזמן הצטברות יון תא התנגשות, 0.2 שניות. כוון את הפרמטרים פעולת FTICR על מנת למקסם את הרגישות אנליטית על פני הטווח ההמוני ממ '/ z 200 עד 1,400, תוך שמירה על ריקבון חופשי אינדוקציה טובה תחום בזמן אותות (FID). בדרך כלל, הפרמטרים פעולת ICR הם מתח העוזר, 8 V; העוזר מתח היסט, 8 V; הגברה עירור של 10; זמן דופק עירור, .01-.015 שניות; מתח צלחת מלכודת קדמי, 1.5 V; מתח צלחת מלכודת בחזרה, 1.6 V ו מתח כניסת מנתח, -4 V. לאחר סט של פרמטרים פעולת FTICR כבר נקבע, לרכוש הספקטרום ההמוני ESI ולכייל את המכשיר באמצעות המוני התייחסות של התרכובות סטנדרטיות בפתרון "ES כוונון המיקס".
4. כדי לכוון את המכשיר לפעולת MALDI, לפזר כמה aliquots μl 1 של terfenadine מעורב ופתרון סטנדרטי reserpine בפתרון המטריצה ​​בריכוז של 1 מיקרומטר כל אחד, ולזהות את הפתרונות הללו ישירות על גבי אחת מTissuסעיפי דואר (כלומר, קטע רקמת מבחן) אשר כבר רכוב על שקופיות מצופות איטו. מניחים את השקף המצופה איטו למתאם שקופיות רקמות (כלומר יעד MALDI מיוחד) ולטעון את המתאם מהצד MALDI למקור יון ESI / MALDI הכפול. לייעל את הפרמטרים התפעוליים MALDI המתאימים לכוח הלייזר ומספר יריות לייזר להצטברות MALDI אות עבור כל סריקה המונית, ועוד פרמטרים פעולת MALDI אופייניים הם: יריות לייזר, 50; ומתח צלחת MALDI של 300 V.
5. לאחר כוונון, כיול, ואופטימיזציה של המכשיר לניסויי MALDI-MSI, ליישר את המיקום הפיזי של קטע רקמה להיות צילם עם תמונה האופטית נרשמה בתוך תוכנת ההדמיה. השתמש בשלושת הסימנים "תיקון נוזל", שהוצבו בעבר בצד השני של משטח השקופיות מצופה איטו (שלב 1.9), למערך הזה בשיטת טריאנגולציה של שלוש נקודות.
6. בצע ESI בו זמנית וMALפעולת DI, כך שכל ספקטרום המוני מכיל את הפסגות המוני התייחסות של הפתרון "ES כוונון המיקס" לכיול מסה הפנימית שלאחר רכישה. זה יגרום במדידת המסה מדויקת ביותר במהלך MALDI טרשת נפוצה. לשם כך, להחליש ראשון אות ESI על ידי הפחתת מתח הנימים עד אותות MALDI להשתלט על הספקטרום ואילו אותות calibrant ESI עדיין גבוהים מספיק לצורך כיול מסה הפנימי.
7. בשלב הבא, להגדיר את שיטת rastering אוטומטית להקרנת לייזר. הגדר את אזורי הרקמה להיות צילם ולהגדיר את גודל צעד סריקה הלייזר המתאים. שים לב שגודל צעד סריקה קטנה יותר לספק תמונות רקמת רזולוציה גבוהות יותר, אך דורש באופן משמעותי יותר מסת רפאים זמן רכישה ועוד שטח אחסון נתונים. מספר פיקסלים בתמונה תלוי בגודל סריקה לייזר צעד להתקנה ולגודל הרקמה. עבור עדשה טיפוסית שור שבו יש גודל רקמה 1 סנטימטר ^2, תמונת רקמה מורכבת בדרך כלל של CA. פיקסלים 5,000 אם גודל צעד סריקה לייזר של 200 מיקרומטר משמש במכשיר FTICR. השתמש בניתוח "אקראי מקום", כפי שזה מונע הטיה מבוססת מיקום בשל הנחתה אות הדרגתית במהלך הניסוי.

4. ניתוח נתונים

1. כייל את הספקטרום ההמוני MALDI באמצעות כיול פנימי להשוואה הראשונית ולבחור פסגות עבור MS / MS. De-איזוטופ ובחר את פסגות monoisotopic כפי שתואר לעיל, תוך שימוש בסקריפט של VBA מותאם אישית ^38.
2. יצוא וכתוצאה מרשימות שיא monoisotopic וקלט הערכים מ '/ z נמדדו ^ל39 METLIN ו / או מאגרי מידע metabolome HMDB ⁴⁰ להתאמה המונית עם ערכי הספרייה. קחו למשל את (M + H) ^+, (M + Na) ^+, ו( M + K) ⁺ יונים במהלך החיפושים במאגר הנתונים, עם שגיאה המונית המותרת של ± 1 עמודים לדקה.
3. ליצור תמונות MALDI לכל אחד מהגופים השומנים זוהו על פני קטע הרקמה כולה באמצעות מתאר לעצמידואר ניתוח תוכנה, עם רוחב מסנן מסה של 1 עמודים לדקה בשיא השיא.
4. ברגע שתמונות כבר נוצרו עבור כל הערכים מ '/ z התואמים את ערכי מסד נתונים, להפיק תמונות לכל פסגות אחרות, כמו גם לחפש דפוסי הפצה ייחודיים שיכול להיחקר מאוחר יותר.

5. אישור על זהותם של השומנים צילמו

1. לאשר את זהותם של שומנים בשפע הגבוה, אשר יש יוני שבר אופייניים שניתן לאתרם באמצעות מכשיר FTICR (למשל 184.073 לפוספוליפידים), על ידי MALDI-MS/MS. בצע MALDI-MS/MS באמצעות ניתוק הנגרם התנגשות (CID) ישירות על הרקמה.
2. לאלו מינים שומנים שלא ניתן לאשר באופן ישיר על ידי MALDI-MS/MS, להשתמש במערכת UPLC מצמידים את ספקטרומטר מסה ש-TOF ^34.
   1. ידני לנתח aliquots מכילים ~ 10 מ"ג של רקמה מהאזור שבו המינים של ריבית מקומי. הנח aliquots הרקמות הללו ל2צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
   2. Homogenize aliquot כל רקמה ב250 μl מים, תוך שימוש בטחנת מיקסר עם שני כדורי מתכת נירוסטה 5 מ"מ.
   3. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת כלורופורם מתנול (1:3, V / V), ומערבולת הצינורות. בשלב הבא, צנטריפוגה הצינורות באמצעות microcentrifuge ב12,000 XG במשך 10 דקות.
   4. לאסוף supernatants ולייבש אותם ברכז מהיר ואקום רוטרי.
   5. ממיסים את השאריות בשל 30:70 isopropanol 100 μl: מים. הזרק aliquot 10-μl על טור UPLC להפרדה באמצעות elution שיפוע.
   6. השתמש בתנאי chromatographic לLC-MS/MS שומנים בדם באופן מקוון, שכבר פורסם בעבר ^34.
   7. הנוכחי ליצור חילוץ יון (XIC) chromatograms באמצעות הערכים מ '/ z התיאורטי, עם חלון של ± 50 עמודים לדקה ברחבי ההמונים התיאורטי.
   8. אם תרכובות אותנטיות לשומנים אלה הן זמינות, להתאים את זמני שמירה של התרכובות אותנטיות עם אלה של Corresponding פסגות XIC מדגימות הרקמה. אם התרכובות זהות, הפעמים השמירה וספקטרום MS / MS צריכים להתאים.
3. אם מתחם אותנטי אינו זמין, השתמש בתבנית הפיצול של השומנים בדם שזוהה כדי להתאים ספקטרום MS / MS סטנדרטי ממסד נתוני metabolome כגון METLIN או HMDB. השתמש דה נובו פרשנות ספקטרלי המונית כדי לקבוע מבנה אפשרי לשומנים בדם.

תוצאות

דגימות רקמה שהם מחולק והפשרה רכובים על גבי שקופיות זכוכית איטו מצופים צריכה להיות שלמות, ללא קרע גלוי. לרקמות רבות, הפשרת רקמות ישירה לתלייה על גבי שקופיות זכוכית איטו מצופים מקובלת. עבור חלק מרקמות ספציפיות, כגון עדשת שור, קריעה נרחבת של הרקמה נתפסה לעתים קרובות כ...

Discussion

השיקולים החשובים ביותר להצלחת MALDI MSI הם: 1) הכנת רקמה; 2) בחירת מטריצה; 3) יישום מטריקס, ו 4) פרשנות וניתוח של נתונים. כאשר המדגם ומטריקס ערוכים כראוי, רכישת נתונים MS היא אוטומטית. ניתוח נתונים מסוג זה של ניסוי הוא די עתיר עבודה.

הכנת רקמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Liver	Pel-Freez Biologicals	56023-2
Bovine Calf Lens	Pel-Freez Biologicals	57114-2	Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)	Sigma-Aldrich	10608	MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)	Sigma-Aldrich	70990	MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)	Sigma-Aldrich	85707	MALDI Matrix
Reserpine	Sigma-Aldrich	83580
Terfenadine	Sigma-Aldrich	T9652
Formic Acid	Sigma-Aldrich	14265
Ammonium Formate	Sigma-Aldrich	14266
Ammonium Hydroxide	Sigma-Aldrich	320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma-Aldrich	302031
Water	Sigma-Aldrich	39253
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34967
Ethyl Acetate	Sigma-Aldrich	34972
Isopropanol	Sigma-Aldrich	34965
Chloroform	Sigma-Aldrich	366927
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Ethanol	Commercial Alcohols		95%
ES Tuning Mix	Agilent Technologies	G2431A
ITO Coated Glass Slides	Hudson Surface Technology	PSI1207000	Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen	Bic	WOSQP11
Airbrush Sprayer	Iwata	Eclipse HP-CS
ImagePrep	Bruker	249500-LS
MALDI adapter	Bruker	235380