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요약

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

초록

질량 분석 이미징 (MSI)을 중심으로 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 기반의 분석 기술을 이용하여, 조직 절편 표면에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정한다. 저 분자량 (MW)의 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 작은 분자 MSI 새로운 매트릭스가 필요하다. MALDI 배경 신호를 감소시키면서 이들 행렬들은 증가 된 피 분석 물 신호를 제공한다. 또, 푸리에 변환과 같은 초고 해상도 악기의 사용은 이온 사이클로트론 공명 (FTICR) 질량 분석기를, 변환 매트릭스 신호로부터 피 분석 물 신호를 분해하는 기능을 가지고 있으며, 이는 부분적 배경 MALDI 유래와 관련된 많은 문제점을 극복 할 수있다 행렬. FTICR MS에 의한 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도의 감소는 또한 다른 악기에 매트릭스 피크와 관련된 간섭을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고해상도아직도 화학 물질 식별에 대한 신뢰를 제공하는 동안 그들은 동시에 많은 화합물의 분포 패턴을 생성 할 수 있습니다와 같은 FTICR 질량 분석기 등의 장비는 유리하다. 디 트라 놀 (DT는, 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 조직 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다. 이 연구에서 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 포유 동물 조직 섹션의 표면에서 내인성 지질의 MALDI 이미징에 대한 DT의 사용에 대한 프로토콜은 초고 해상도 하이브리드 극에 FTICR 계기가 제공되었습니다.

서문

질량 분석 이미징 (MSI)는 조직 절편 1,2의 표면 상에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정하기위한 분석 기술이다. 펩타이드 및 단백질의 분석을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI는 년 넘게 사용 된 샘플 준비, 검출 감도, 공간 해상도, 재현성 및 데이터 처리 3,4 방법에서 큰 개선이 있었다. 조직 학적으로 스테인드 섹션과 MSI 실험에서 정보를 결합하여, 병리학 pathophysiologically 흥미로운 기능 5와 특정 화합물의 분포의 상관 관계를 할 수 있습니다.

외인성 약물 6,7과 그 대사 산물 8-10 등의 작은 분자의 분포 패턴은 MALDI-MS 조직 영상 (11)에 의해 심문을하고 있습니다. 지질은 아마도 가장 널리 연구 된 CLA 있습니다MS 12 ~ 17 및 MS / MS 18 모드에서 모두 MALDI 이미징 화합물의 SS. 작은 분자 이미징 MALDI MSI의 사용은 여러 가지 요인에 의해 제한되었다 : 1) MALDI 매트릭스 자체가 풍부한 이온 신호를 생성 작은 ​​분자 (일반적으로 m / z <500)이다. 이러한 풍부한 신호는 작은 분자 분석의 이온화를 억제하고 자신의 검출 (19, 20)을 방해 할 수 있습니다. 무용제 매트릭스 코팅 21, 매트릭스 승화 (22)와, MALDI MS 23 프리 코트 행렬은, 다른 사람의 사이에서, 작은 분자의 MSI를 개선하기 위해 개발되었다.

저 분자량 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 새로운 행렬은 작은 분자 MSI에 큰 관심입니다. 이러한 행렬은 행렬 감소 신호에 따라 증가 분석 신호를 제공한다. 양이온 모드에서, 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB) 및 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (CHCA)는 MSI 24이 일반적으로 사용 MALDI MS 매트릭스 아르 . 분석 물의 공간 지역화를 유지하도록 적합 행렬은 작은 결정을 형성하는 것이다. DHB 그러므로 승화를 이용한 행렬이 부분적으로이 문제를 극복하기 위해 개발되었으며, 인지질 22,25 민감한 이미징이 매트릭스의 사용을 허용 한 적용, 큰 결정체를 형성하는 경향이있다. 9-Aminoacridine는 포지티브 이온 모드 (26)와 음이온 모드에서 26-29 뉴클레오티드 및 인지질에 대한 양성 자성 분석 물의 MSI 사용되고있다. 메틸 아민은 지질 (30)의 효율적인 MALDI 검출을 제공하는 것으로 확인되었으며, 마우스의 뇌 영상 (31) 강글리오사이드 사용되어왔다. 푸리에의 초고 해상도 이온 사이클로트론 공명 (FTICR를) 변환 질량 분석기는 다소 매트릭스 신호 (32) 분석 신호를 해결하여이 문제를 완화 할 수 있습니다. FTICR-MS를 사용하는 또 다른 장점은 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도는 현상 감소는 것이다또한 이러한 간섭의 27을 감소 ED 33.

디 트라 놀의 사용 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 -이 dihydroanthracen -9 - 일) 티슈 이미징 MALDI 매트릭스 (34)는 이전에보고 된 바와 같이. 이 현재 연구에서, 상세한 프로토콜은 양이온 모드에서, 소 렌즈 조직 섹션의 표면에 내인성 지질 MSI 대한 DT의 사용을 위해 제공된다.

프로토콜

1. 조직의 단면

  1. , 액체 질소를 사용하여, 한 번 수확 한 문제의 표본을, 플래시 동결 (배송이 필요한 경우) 드라이 아이스에 그들을 발송하고, 조직 절편 때까지 -80 ° C에 저장합니다. (상용 샘플을 사용하는 경우, 샘플은이 방식으로 제조되도록.)
  2. MALDI 목표에 맞게 관리 크기로 장기를 잘라. 기관의 불필요한 부분을 잘라냅니다. 여기에 설명 된 본 연구의 경우, 소 송아지 렌즈는 조직 절편하기 전에 이전에 설명 된 절차 (35)를 사용하여 디 캡슐화 하였다.
  3. -80 ° C 냉동고에서 전체 장기를 제거하고 저온 ​​조직 절단 무대에 수정합니다. 소 송아지 렌즈를 해결하려면, 저온 유지 장치의 조직을 절단 단계에서 물이 한 두 방울을 배치합니다. 이 응고되기 전에 빨리 물에 렌즈를 배치합니다. 또한, 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물은 또한 절단 단계에 조직 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 의 OCT 화합물을 사용하는 경우, 소형의 OCT 말 량이 적용되어야 손질 컷 조직 절편은 이온화 분석 5,36,37의 검출을 방해 할 수의 OCT 화합물로 오염되지 않도록주의해야한다.
  4. 저온 유지 장치 내부의 온도가 -18 ℃로 평형을 허용 추운 또는 따뜻한 온도는 각각 부드럽게 또는 열심히 조직에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 equatorially 20 μm의 두께 조각으로 조직을 잘라. 대부분의 조직에 대해 10 ~ 15 μm의 두께 조각을 사용; 때문에 소 렌즈 조직의 깨지기 쉬운 특성으로, 그러나, 20 μm의 두께 슬라이스를 사용 하였다. 소 렌즈 용 티슈의 경우, 제 조직 섹션을 버리고 만 적도면에 또는 가까이있는 슬라이스를 사용한다.
  5. 접안 렌즈 티슈가 묘화되는 경우, 산화 인듐 주석 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드의 표면 prewet하는 포름산 (순도 98 %, LC-MS 그레이드) 1.5 μl를 사용한다.
  6. 조심스럽게 ITO-공동의 표면에 조직 섹션을 전송저온 유지 장치 내부 ated 유리 현미경 슬라이드. 조직 절편 신속 해동하고 슬라이드면에 단단히 부착 될 것이다. 일반적으로, 여러 조직 섹션 이와 같이 동일한 ITO 코팅 된 슬라이드 상에 장착 될 수있다.
  7. MALDI 매트릭스 도장 전에 15 분간 슬라이드를 냉동 건조.
  8. 매트릭스 테스트를 위해 적절한 용매에 각각의 행렬을 녹입니다. 수동으로 조직 섹션에 각 매트릭스 용액 1 μl를 발견. 또한, MALDI 감도의 검증 용 티슈 상 저분자 보정 표준을 더럽힐.
  9. 교정 유체 펜으로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 비전 도성 표면에 기록하여 ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 세 교육 마크를 추가합니다. 평판 스캐너를 사용하여 조직 슬라이드의 광학 이미지를 촬영하고는 TIFF 또는 JPG 등의 적절한 형식으로 저장합니다.

2. 매트릭스 코팅

2.1. 자동화 된 매트릭스 코팅

  1. AP자동 브루 커 ImagePrep 또는 유사한 전자 매트릭스 분무기를 이용하여 조직 절편의 표면에 용매로서 아세토 니트릴 또는 혼합 아세토 니트릴 / 물을 함유 플라이 매트릭스 솔루션.
  2. 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다.
  3. 외투 매트릭스 코팅 (2 초 스프레이, 30 초 배양하고, 각 사이클 동안 60 초 건조 시간)의 스물 사이클을 이용하여 유리 슬라이드.

2.2. 수동 매트릭스 코팅

  1. 전자 행렬 분사기의 제조 재료와 호환되지 않는 유기 용매 (예 : 클로로포름, 에틸 아세테이트) requi다면빨강, 매트릭스를 적용 할 공압 보조 에어 브러쉬 스프레이를 사용합니다. 에어 브러쉬 총의 용매 저장소에 제조 된 매트릭스 솔루션을 추가하고 주요 스프레이 가압 질소 가스의 완만 한 흐름을 적용합니다.
  2. 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다.
  3. 안정하고 미세한 스프레이가 관찰 된 후에, 수동 매트릭스 스프레이 완전히 코팅 조직 절편을되도록. 간신히 가능한 피 분석 비편 재화를 방지하기 위해 각 사이클 동안 표면을 적시기 위해 필요한 매트릭스 용액의 최소량을 적용한다. 일반적으로, 코팅하는 매트릭스 스프레이 약 10 사이클 조직 절편을 사용하여, 사이클의 수는티슈 타입 및 매트릭스 조성물에 의존.

3. MALDI MS

  1. 물 (최종 혼합물 중 0.1 % 포름산 함유) : 60:40 이소프로판올 1:200의 요인에 의해 "ES 튜닝 혼합"표준 용액을 희석하여 질량 보정 용액을 준비한다.
  2. 2 μL / 듀얼 모드 전기 분무 이온화 (ESI) ESI 측에서 FTICR 질량 분석기에 / MALDI 이온 소스에 희석 "ES 조정 믹스"솔루션의 분을 소개합니다.
  3. 광대역 검출 1,024 킬로바이트 / 초의 데이터 수집의 제약없이, 포지티브 이온 ESI 모드 FTICR 악기 운항. 일반적인 ESI 매개 변수는 모세관 전기 분무 전압 3,900 V되며 방패 전압 3,600 V 스프레이, 분무기 가스 (N 2) 흐름, 2 L / 분; 건조 가스 (N 2) 흐름과 온도, 4 L / 분 200 ° C; 1 전압, 15 V 분리기에, 비행 (TOF)의 시간 0.009 초, 충돌 가스 (AR) 흐름, 0.4 L / S, 소스 이온 축적 시간, 0.1 초;및 충돌 셀 이온 축적 시간 0.2 초. 좋은 시간 영역 자유 유도 감쇄 (FID) 신호를 유지하면서, m / z 200에서 1,400 질량 범위의 분석 감도를 극대화하기 위해 조정 FTICR 작업 매개 변수를 설정합니다. 일반적으로, ICR 작업 매개 변수 조수의 전압 8 V되며 오프셋 전압, 8 V를 조수, 10의 여기 증폭, 여기 펄스 시간, 0.01-0.015 초, 전면 트랩 플레이트 전압 1.5 V, 다시 트랩 플레이트 전압 1.6 V 및 분석기 입구 전압, -4 FTICR 운전 파라미터들의 세트가 결정되고 나면 V., ESI 질량 스펙트럼을 획득하고 "ES 튜닝 혼합"용액에서 표준 화합물의 레퍼런스 질량을 사용하여 기기를 교정.
  4. 조정에 MALDI 작업을위한 장비는, 1 μM 각각의 농도 매트릭스 용액에 혼합 테르페나딘과 레 세르 핀 표준 용액의 몇 가지 1 μL 씩 분주 녹여 직접 Tissu은 중 하나에이 솔루션을 발견전자 섹션 ITO 코팅 된 슬라이드에 장착 된 (즉, 테스트 조직과). 조직 슬라이드 어댑터 (즉, 특별 MALDI 대상)에 ITO 코팅 된 슬라이드를 놓고 이중 ESI / MALDI 이온 소스에 든 측면에서 어댑터를로드 할 수 있습니다. 각 질량 스캔 MALDI 신호 축적 등을위한 레이저 출력과 레이저 샷의 개수에 대한 적절한 MALDI 동작 파라미터를 최적화 전형적인 MALDI 동작 파라미터는 : 레이저 샷, 50, 및 300 V.의 MALDI 플레이트 전압
  5. 조정 후, 교정, 및 MALDI-MSI 실험을위한 계측기 최적화 이미징 소프트웨어 내에 기록 된 광학 상으로 묘화 될 수있는 조직 절편의 실제 위치를 정렬. 3 점 삼각 측량 방법을 이용하여 이러한 정렬을 위해 이전에 ITO 코팅 된 슬라이드면의 반대측 (단계 1.9)에 넣어왔다 세 "정정 유체"부호를 사용한다.
  6. 동시 ESI와 MAL를 수행DI 작업을 각각의 질량 스펙트럼은 인수 후 내부 질량 교정을위한 "ES 조정 믹스"솔루션의 기준 질량 피크를 포함하도록. 이 MALDI MS 동안 가장 정확한 질량 측정 될 것입니다. 이를 위해, 제 ESI calibrant의 신호가 내부 질량 교정 여전히 높게 유지하면서 MALDI 스펙트럼 신호를 지배 할 때까지 모세관 전압을 감소시킴으로써 ESI 신호를 감쇠.
  7. 다음으로, 레이저 조사에 대한 자동화 된 래스터 링 방법을 설정합니다. 몇 군데 조직의 영역을 정의하고 적절한 레이저 래스터 단계의 크기를 설정합니다. 작은 래스터 스텝 사이즈는 더 높은 해상도의 조직 이미지를 제공한다는 점에 유의하지만, 상당히 긴 질량 스펙트럼 획득 시간 등의 데이터 저장 공간을 필요로한다. 이미지 픽셀의 수를 설정하는 레이저 래스터 스텝 사이즈 및 조직의 크기에 의존한다. 1cm 2 티슈 크기가 일반적인 소 렌즈, 조직 이미지는 일반적으로 주 구성되어있다. 5,000 픽셀 200 ㎛의 레이저 래스터 단계 크기가 FTICR 기기에 사용되는 경우. 이 실험 기간 동안 점진적으로 인해 신호 감쇠에 위치 기반 편견을 방지로, "임의의 장소"분석을 사용합니다.

4. 데이터 분석

  1. 초기 비교를 위해 내부 보정을 사용하여 MALDI 질량 스펙트럼을 측정하고 MS / MS에 대한 피크를 선택합니다. 드 동위 원소 및 사용자 정의 VBA 스크립트 (38)를 사용하여, 전술 한 바와 같이 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크를 선택합니다.
  2. 내보내기 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크 목록 및 METLIN 39 및 / 또는 라이브러리 항목 질량 매칭 HMDB 40 대사 체 데이터베이스에 입력 측정 된 M / Z 값을 결과. ± 1 ppm으로 허용 질량 오류로 데이터베이스를 검색하는 동안 (M + H) +, (M + NA) + 및 (M + K) + 이온을 고려한다.
  3. IMAG을 사용하여 전체 조직 절편을 가로 질러 검출 된 지질 엔티티 모두를위한 이미지를 생성 MALDI피크 꼭대기에서 1 ppm으로의 질량 필터 폭 전자 분석 소프트웨어.
  4. 이미지가 데이터베이스 항목과 일치하는 모든 M / Z 값에 대해 생성되고 나면, 나중에 조사 할 수있는 독특한 분포 패턴을 찾아뿐만 아니라 다른 모든 피크에 대한 이미지를 생성합니다.

5. 군데 지질의 신원 확인

  1. MALDI-MS/MS 의해 FTICR 악기 (인지질 예 : 184.073)를 사용하여 검출 될 수있는 특성 단편 이온이 높은 풍부한 지질의 신원을 확인한다. 직접 조직에 충돌 유발 분해 (CID)를 사용하여 MALDI-MS/MS을 수행합니다.
  2. 직접 MALDI-MS/MS에 의해 확인 될 수없는 그 지질 종 들어, Q-TOF 질량 분석기 (34)에 결합 UPLC 시스템을 사용한다.
    1. 수동으로 관심의 종류가 지역화 된 영역에서 조직의 ~ 10 ㎎을 함유 분주 해부. 2에 이러한 조직 분량 씩 배치ML의 원심 분리기 튜브.
    2. 두 5mm 스테인리스 금속 공 믹서 밀을 사용하여, 물 250 ㎕를 각 조직 나누어지는 균질화.
    3. 클로로포름 - 메탄올 용액 (1:3 V / V), 및 소용돌이 관의 1 ML을 추가합니다. 다음에, 10 분 동안 12,000 XG에서 마이크로 원심 튜브를 사용하여 원심 분리.
    4. 상층 액을 수집하고 회전 속도 진공 농축기에서 그들을 건조.
    5. 물 : 30:70 이소프로판올 100 μL의 잔류 물을 녹인다. 기울기 용리를 사용하여 분리를위한 UPLC 컬럼에 10 ㎕의 분취 량을 주입한다.
    6. 이전에 34 게시 된 온라인 지질 LC-MS/MS에 대한 크로마토 그래피 조건을 사용합니다.
    7. 생성 추출한 이온 전류 (XIC)의 이론 질량 주위 ± 50 ppm으로 윈도우로, 이론적 m / z 값을 이용하여 크로마토 그램.
    8. 그 지질에 대한 본격적인 화합물을 사용할 수있는 경우, 대응의 사람들과 확실한 화합물의 머무름 시간과 일치조직 샘플에서 XIC 피크를하는 번. 화합물이 동일한 경우, 체류 시간 및 MS / MS 스펙트럼은 일치한다.
  3. 본격적인 화합물을 사용할 수없는 경우, 같은 METLIN 또는 HMDB 등의 대사 체 데이터베이스에서 표준 MS / MS 스펙트럼과 일치하도록 감지 지질의 조각 패턴을 사용합니다. 지질에 대한 가능한 구조를 결정하기 위해 새로이 질량 스펙트럼 해석을 사용합니다.

결과

ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 단면과 해동이 장착 된 조직 샘플을 볼 수 찢지 말고 그대로 있어야한다. 많은 조직의 경우, ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 직접 장착 조직 해동이 허용됩니다. 직접 장착 해동이 (그림 1a)를 사용하는 경우 이러한 소 렌즈와 같은 일부 특정 조직의 경우 조직의 광범위한 찢어 종종 볼 수 있습니다. 에탄올 또는 포름산과 ITO 유리 슬라이드의 프리 코팅

토론

성공적인 MALDI MSI에 대한 가장 중요한 고려 사항은 : 1) 티슈 제조 2) 매트릭스 보유 3) 매트릭스 애플리케이션, 4) 데이터 해석 및 분석. 시료와 매트릭스를 적절하게 제조 될 때, MS 데이터 수집이 자동화된다. 이러한 유형의 실험에서 데이터 분석은 매우 노동 집약적이다.

적절한 조직 준비는 성공적인 MALDI MSI 실험을 위해 매우 중요합니다. 조직의 소스 및 취급은 최종 분석에 ?...

공개

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

저자는 플랫폼의 자금 조달 및 지원에 대한 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 원고 및 편집 지원의 중요한 검토를 위해 박사 캐롤 E. 파커 감사합니다. CHL도 지원을위한 감사 브리티시 컬럼비아 단백질 체학 네트워크.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Rat LiverPel-Freez Biologicals56023-2
Bovine Calf LensPel-Freez Biologicals57114-2Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)Sigma-Aldrich10608MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)Sigma-Aldrich85707MALDI Matrix
ReserpineSigma-Aldrich83580
TerfenadineSigma-AldrichT9652
Formic AcidSigma-Aldrich14265
Ammonium FormateSigma-Aldrich14266
Ammonium HydroxideSigma-Aldrich320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)Sigma-Aldrich302031
WaterSigma-Aldrich39253
MethanolSigma-Aldrich34860
AcetonitrileSigma-Aldrich34967
Ethyl AcetateSigma-Aldrich34972
IsopropanolSigma-Aldrich34965
ChloroformSigma-Aldrich366927
AcetoneSigma-Aldrich34850
EthanolCommercial Alcohols95%
ES Tuning MixAgilent TechnologiesG2431A
ITO Coated Glass SlidesHudson Surface TechnologyPSI1207000Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction PenBicWOSQP11
Airbrush SprayerIwataEclipse HP-CS
ImagePrepBruker249500-LS
MALDI adapterBruker235380

참고문헌

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