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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a été précédemment rapporté comme une matrice MALDI pour l'imagerie des tissus de petites molécules, des protocoles pour l'utilisation de DT pour l'imagerie MALDI des lipides endogènes sur l' surface des coupes de tissus par ions positifs MALDI-MS sur un ultra-résolution quadripolaire FTICR instrument sont fournies ici.

Résumé

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) détermine la localisation et de la distribution spatiale des motifs de composés sur la surface d'une coupe de tissu, en utilisant principalement MALDI (laser assistée par matrice de désorption / ionisation) à base de techniques analytiques. Nouvelles matrices pour petite molécule MSI, ce qui peut améliorer l'analyse de bas poids moléculaire (MW) composés, sont nécessaires. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d'analyte tout en diminuant les signaux de fond MALDI. En outre, l'utilisation d'instruments très haute résolution, telles que la transformée de Fourier à résonance cyclotronique ionique (FTICR) des spectromètres de masse, a la capacité de résoudre des signaux d'analyte à partir des signaux de la matrice, ce qui peut partiellement surmonter de nombreux problèmes associés à l'arrière-plan provenant de la MALDI matrice. La réduction de l'intensité des métastables grappes de matrice par FTICR MS peut également aider à surmonter certains des interférences associées aux pics de la matrice sur d'autres instruments. Haute résolutioninstruments tels que les spectromètres de masse FTICR sont avantageux car ils peuvent produire des modèles de distribution de nombreux composés simultanément tout en offrant la confiance dans les identifications chimiques. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a déjà été rapporté comme une matrice MALDI pour l'imagerie des tissus. Dans ce travail, un protocole pour l'utilisation de MALDI DT pour l'imagerie des lipides endogènes à partir des surfaces des sections de tissus de mammifères, par-ion positif MALDI-MS, sur un hybride quadripolaire à ultra-haute résolution FTICR instrument a été fournie.

Introduction

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est une technique d'analyse pour déterminer la localisation et de distribution la répartition spatiale des composés sur la surface d'une coupe de tissu 1,2. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) MSI pour l'analyse des peptides et des protéines a été utilisé pour plus d'une décennie et il ya eu de grandes améliorations dans les méthodes de préparation des échantillons, la sensibilité de détection, la résolution spatiale, la reproductibilité et le traitement des données de 3,4. En combinant les informations des sections histologiques colorées et expériences MSI, les médecins sont en mesure de corréler les distributions de composés spécifiques avec des caractéristiques intéressantes sur le plan physiopathologique 5.

Les modes de distribution de petites molécules, y compris les médicaments exogènes 6,7 et de leurs métabolites 8-10 ont également été interrogés par MALDI-MS imagerie des tissus 11. Les lipides sont peut-être le cla plus largement étudiéart de composés avec l'imagerie MALDI, à la fois dans les MS 12-17 et MS / MS 18 modes. L'utilisation de MALDI MSI pour l'imagerie du petit molécule a été limitée par plusieurs facteurs: 1) des matrices MALDI sont eux-mêmes de petites molécules (typiquement m / z <500), qui génèrent des signaux d'ions abondantes. Ces signaux abondantes peuvent supprimer l'ionisation des analytes à petites molécules et interférer avec leur 19,20 de détection. Sans solvant matrice revêtement 21, matrice sublimation 22, et de la matrice MALDI prérevêtue MS 23, entre autres, ont été développées pour améliorer MSI de petites molécules.

Nouvelles matrices qui peuvent améliorer l'analyse des composés de faible poids moléculaire sont d'un grand intérêt dans une petite molécule MSI. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d'analyte avec les signaux de la matrice diminué. Dans le mode ions positifs, le 2,5-dihydroxybenzoïque acide (DHB) et-4-hydroxycinnamique α-cyano acide (ACSSD) sont les deux matrices MALDI MS couramment utilisés pour MSI 24 . L'idéal serait de former une matrice de petits cristaux, de façon à préserver la localisation spatiale des analytes. DHB a tendance à former des cristaux plus grands, par conséquent, l'application de la matrice à l'aide de sublimation a été développé pour surmonter partiellement ce problème, et a permis l'utilisation de cette matrice pour l'imagerie sensible de phospholipides 22,25. 9-aminoacridine a été utilisé pour des analytes MSI protiques dans le mode ions positifs, et 26 pour les nucleotides et les phospholipides dans la négative, le mode ions 26 à 29. 2-mercaptobenzothiazole a été trouvée pour donner détection de MALDI efficace des lipides 30, et a été utilisée pour l'imagerie du cerveau de souris 31 gangliosides. La très haute résolution de la transformée de Fourier ion résonance cyclotron (FTICR) spectromètres de masse peuvent quelque peu atténuer ce problème en réglant les signaux d'analyte à partir des signaux de la matrice 32. Un autre avantage de l'utilisation de MS-FTICR est que les intensités des pôles de la matrice sont métastables réductioned 33, ce qui réduit également ces interférences 27.

L'utilisation de dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) sous forme de matrice MALDI pour l'imagerie des tissus a été précédemment rapporté 34. Dans ce travail en cours, un protocole détaillé est fourni pour l'utilisation de DT pour la MSI des lipides endogènes sur les surfaces des sections de tissu de lentille bovine, dans le mode ions positifs.

Protocole

Une. sectionnement des tissus

  1. Flash geler les spécimens d'émission, une fois récoltés, en utilisant de l'azote liquide, les expédier sur de la glace sèche (si l'expédition est requise), et de les stocker à -80 ° C jusqu'à ce que le sectionnement de tissu. (Si les échantillons commerciaux sont utilisés, veiller à ce que les échantillons sont préparés de cette manière.)
  2. Couper les organes à une taille gérable pour s'adapter à la cible MALDI. Coupez les parties non désirées de l'organe. Pour cette étude décrit ici, les lentilles de veau bovins ont été décapsulés en utilisant une procédure décrite précédemment 35 avant découpe de tissu.
  3. Retirer des organes entiers de -80 ° C congélateur et fixez-les sur une scène de coupe de tissu cryogénique. Pour fixer un objectif de veau, placer une ou deux gouttes d'eau sur la scène d'un cryostat tissu coupe. Placez rapidement la lentille dans l'eau avant qu'elle se solidifie. Sinon, la température de coupe optimale (OCT) composés peuvent également être utilisés pour fixer un tissu sur la scène de coupe. Si les composés de l'OPO se servir, un minimal quantité d'octobre doit être appliqué et il faut prendre soin de s'assurer que les sections de tissu coupées ne sont pas contaminés par des composés octobre qui peut interférer avec l'ionisation et la détection des analytes 5,36,37.
  4. Laisser la température à l'intérieur du cryostat à s'équilibrer à 18 ° C. Les températures plus froides ou plus chaudes peuvent être utilisés pour les tissus plus doux ou plus durs, respectivement. Ensuite, couper le tissu équatoriale en 20 um tranches épaisses. Utilisez 10-15 um tranches épaisses pour la plupart des tissus, mais, en raison de la nature fragile du tissu de verre de bovins, 20 um tranches épaisses ont été utilisés. Pour le tissu de verre de bovin, jeter les premières sections de tissus et de n'utiliser que des tranches qui sont proches ou au plan équatorial.
  5. Si un tissu lentille oculaire est imagé, utiliser 1,5 ul d'acide formique (98% de pureté, LC-MS grade) à pré-imbibé la surface d'un oxyde d'indium-étain (ITO) revêtu lame de verre.
  6. Transférer délicatement les coupes de tissus à la surface de l'ITO-coverre ATED lame de microscope à l'intérieur du cryostat. La coupe de tissu se décongeler rapidement et deviendra hermétiquement fixé à la surface de glissement. Habituellement, des coupes de tissus multiples peuvent être montés sur une même lame d'ITO revêtue de cette façon.
  7. Lyophiliser la lame pendant 15 min avant l'application de la matrice MALDI.
  8. Pour le test de la matrice, dissoudre les matrices individuelles dans des solvants appropriés. Repérer manuellement 1 ul de chaque solution de matrice sur la coupe de tissu. De plus, repérer un standard d'étalonnage de petite molécule sur le tissu pour la vérification de la sensibilité MALDI.
  9. Ajouter trois points d'enseignement de la lame de verre revêtue d'ITO par écrit sur la surface non conductrice de la lame de verre revêtue d'ITO avec un stylo correction fluide. Prendre une image optique de la lame de tissu à l'aide d'un scanner à plat et l'enregistrer dans un format approprié comme tiff ou jpg.

2. Revêtement Matrix

2.1. Matrice revêtement automatisé

  1. Apsolutions de matrice de nappe, qui contiennent de l'acétonitrile ou un mélange acétonitrile / eau comme solvant mixte, automatiquement à la surface des coupes de tissu en utilisant un Bruker ImagePrep ou une matrice électronique pulvérisateur similaire.
  2. Couvrir les bords de la surface avant de la lame de verre revêtu d'ITO avec un ruban de telle sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d'enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l'alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d'ITO.
  3. Manteau de la lame de verre à l'aide d'une vingtaine de cycles de matrice revêtement (2-sec pulvérisation, 30 sec d'incubation, et 60 secondes de temps de séchage pour chaque cycle).

2.2. Manuel Matrice revêtement

  1. Si des solvants organiques (par exemple le chloroforme et l'acétate d'éthyle) qui sont incompatibles avec les matériaux de fabrication de la matrice pulvérisateur électronique sont exirouge, utiliser un aérographe pulvérisateur pneumatique assisté à appliquer la matrice. Ajouter la solution de matrice préparée dans le réservoir de solvant de l'aérographe et appliquer un léger flux d'azote gazeux sous pression pour amorcer la pulvérisation.
  2. Couvrir les bords de la surface avant des lames de verre ITO revêtus avec de la bande de sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d'enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l'alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d'ITO.
  3. Après sprays stables et fines ont été observées, pulvériser manuellement la matrice de sorte qu'il enrobe complètement la section de tissu. Appliquer le montant minimum de la solution de matrice nécessaire pour à peine mouiller la surface lors de chaque cycle pour éviter tout risque de délocalisation de l'analyte. En général, utiliser environ 10 cycles de matrice pulvérisation pour enduire une section de tissu, le nombre de cycles esten fonction du type de tissu et la composition de la matrice.

3. MALDI MS

  1. Préparer une solution d'étalonnage de masse par dilution de la "Tuning ES Mix" solution standard d'un facteur 1:200 dans 60:40 isopropanol: eau (contenant de l'acide formique à 0,1% dans le mélange final).
  2. Introduire 2 ul / min de la solution diluée "Tuning ES Mix" dans le bi-mode ionisation électrospray (ESI) de source / MALDI d'ions sur le spectromètre de masse FTICR, à partir du côté ESI.
  3. Utilisez l'instrument FTICR en mode ESI positif-ion, avec détection à large bande et une taille d'acquisition de données de 1024 kb / s. Paramètres ESI typiques sont tension électrospray capillaire, 3900 V; pulvériser tension de bouclier, 3600 V, le gaz de nébulisation (N 2) flux, 2 L / min; gaz sec (N 2) débit et de température, 4 L / min et 200 ° C; skimmer 1 tension, 15 V, le temps de vol (TOF), 0.009 sec; gaz de collision (Ar) flux, 0,4 L / s; la source d'ions temps d'accumulation, 0,1 sec;et cellule de collision ion temps d'accumulation, 0,2 sec. Régler les paramètres de fonctionnement FTICR afin de maximiser la sensibilité analytique sur la gamme de masse de m / z 200 à 1400, tout en maintenant le bon moment domaine d'induction libre décroissance des signaux (FID). En règle générale, les paramètres de fonctionnement de l'IC sont tension acolyte, 8 V; Sidekick tension de décalage, 8 V; excitation amplification de 10; excitation temps d'impulsion, de 0,01 à 0,015 sec; avant tension de plaque de piège, de 1,5 V; dos piège tension de plaque, 1,6 V et analyseur tension d'entrée, -4 V. Après un ensemble de paramètres de fonctionnement FTICR a été déterminé, d'acquérir les spectres de masse ESI et calibrer l'appareil en utilisant les masses des composés standards de référence dans la solution "ES Tuning Mix".
  4. Pour accorder l'instrument pour un fonctionnement MALDI, dissoudre plusieurs fractions de 1 ul d'une terfénadine mixte et la solution étalon de réserpine dans la solution de matrice à une concentration de 1 uM chacun, et repérer ces solutions directement sur l'un des tissudes sections de e (c'est à dire une section de tissu d'essai) qui a été monté sur un coulisseau revêtu d'ITO. Placer la lame revêtu d'ITO dans un adaptateur de lame de tissu (c'est à dire une cible MALDI spéciale) et de charger l'adaptateur du côté MALDI dans la source d'ions double ESI / MALDI. Optimiser les paramètres de fonctionnement MALDI appropriées pour la puissance du laser et le nombre de tirs laser pour MALDI accumulation de signal pour chaque balayage de masse, etc paramètres de fonctionnement MALDI typiques sont: des tirs laser, 50, et une tension de plaque MALDI de 300 V.
  5. Après réglage, l'étalonnage et l'optimisation de l'instrument pour des expériences MALDI-MSI, aligner l'emplacement physique d'une section de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d'imagerie. Utiliser les trois marques "de correction"-fluide, qui avaient été précédemment mis sur le côté opposé de la surface de glissement revêtue d'ITO (étape 1.9), pour cet alignement en utilisant une méthode de triangulation à trois points.
  6. Effectuez une ESI et MAL simultanéeOpération DI sorte que chaque spectre de masse contient les pics de masse de référence de la solution "ES Tuning Mix" post-acquisition étalonnage de masse interne. Cela se traduira par la mesure de la masse la plus précise au cours de MALDI MS. Pour ce faire, la première atténuer le signal ESI en diminuant la tension capillaire jusqu'à ce que les signaux dominent les spectres MALDI tandis que les signaux de calibrant ESI sont encore suffisamment élevée pour l'étalonnage de masse interne.
  7. Ensuite, mettre en place une méthode de tramage automatisé pour l'irradiation laser. Définir les zones de tissu à imager et définir la taille de l'étape de trame laser approprié. Notez que les tailles de pas plus petit raster fournissent des images de tissus de la résolution, mais nécessitent un temps significativement plus long du spectre de masse d'acquisition et plus d'espace de stockage de données. Le nombre de pixels de l'image dépend de la taille de pas de trame de laser à mettre en place et de la taille des tissus. Pour une lentille bovine typique qui a une taille de 1 cm 2 de tissu, une image de tissu est typiquement composée de ca. 5000 pixels si une taille de pas de trame de laser de 200 um est utilisé sur un instrument FTICR. Utiliser une analyse «point aléatoire", car cela empêche la polarisation basé sur la localisation progressive en raison de l'atténuation du signal pendant l'expérience.

4. Analyse des données

  1. Calibrer les spectres de masse MALDI utilisant le calibrage interne pour la comparaison initiale et pour sélectionner pics pour MS / MS. De-isotope et sélectionnez les sommets monoisotopiques comme décrit précédemment, en utilisant un script VBA personnalisée 38.
  2. Export de la liste résultant de pointe monoisotopiques et saisir les valeurs m / z mesurées dans le METLIN 39 et / ou les BDMH 40 bases de données métabolome pour la masse correspondant avec les entrées de la bibliothèque. Prenons l'(M + H) +, (M + Na) +, et (M + K) + ions pendant les recherches de base de données, avec une erreur de masse admissible de ± 1 ppm.
  3. Générer des images MALDI pour l'ensemble des entités de lipides détectés à travers l'ensemble de coupe de tissu en utilisant imagun logiciel de courrier analyse, avec une largeur de filtre de masse de 1 ppm au sommet du pic.
  4. Une fois les images ont été générées pour toutes les valeurs m / z qui correspondent à des entrées de base de données, générer des images pour tous les autres sommets ainsi à rechercher des modèles de distribution uniques qui peuvent être étudiés plus tard.

5. Confirmation de l'identité des lipides imagés

  1. Confirmer l'identité des lipides d'abondance élevée, qui ont des ions fragments caractéristiques qui peuvent être détectées en utilisant l'instrument FTICR (par exemple 184,073 pour les phospholipides), par MALDI-MS/MS. Effectuer MALDI-MS/MS utilisant dissociation induite par collision (CID) directement sur le tissu.
  2. Pour les espèces lipidiques qui ne peuvent être directement confirmée par MALDI-MS/MS, utiliser un système UPLC couplé à un spectromètre de masse Q-TOF 34.
    1. Disséquer manuellement aliquotes contenant ~ 10 mg de tissu dans la zone où l'espèce d'intérêt ont été localisés. Placez ces aliquotes de tissu en 2des tubes de centrifugation ml.
    2. Homogénéiser chaque aliquote de tissu dans 250 ul d'eau, en utilisant un broyeur mélangeur avec deux billes métalliques en acier inoxydable de 5 mm.
    3. Ajouter 1 ml d'une solution chloroforme-méthanol (1:3, v / v), et les tubes vortex. Ensuite, centrifuger les tubes à l'aide d'une microcentrifugeuse à 12 000 xg pendant 10 min.
    4. Recueillir les surnageants et les sécher dans un concentrateur de vitesse rotatif sous vide.
    5. Dissoudre les résidus dans 100 pi de 30:70 isopropanol: eau. Injecter une portion aliquote de 10 ul sur la colonne UPLC pour la séparation en utilisant un gradient d'élution.
    6. Utiliser les conditions chromatographiques en ligne pour LC-MS/MS lipidiques, qui ont été publiées antérieurement 34.
    7. Générer un courant ionique extrait (XIC) chromatogrammes en utilisant les valeurs théoriques m / z, avec une fenêtre de ± 50 ppm environ les masses théoriques.
    8. Si les composés authentiques de ces lipides sont disponibles, faites correspondre les temps de rétention des composés authentiques avec ceux du corpondant pics de XIC à partir des échantillons de tissus. Si les composés sont les mêmes, les durées de rétention et les spectres MS / MS doivent correspondre.
  3. Si un composé authentique n'est pas disponible, utiliser le schéma de fragmentation du lipide détecté pour correspondre à un spectre standard MS / MS à partir d'une base de données métabolome comme METLIN ou BDMH. Utilisez de novo interprétation des spectres de masse pour déterminer une structure possible pour le lipide.

Résultats

Des échantillons de tissus qui sont sectionnés et dégel monté sur les lames de verre recouvertes d'ITO doivent être intacts, sans déchirure visible. Pour de nombreux tissus, dégel des tissus montage direct sur une lame de verre recouverte d'ITO est acceptable. Pour certains tissus spécifiques comme objectif de bovin, vaste déchirure des tissus est souvent observé lorsque dégel montage direct est utilisé (figure 1a). Pré-revêtement de la lame de verre ITO avec de l'éthano...

Discussion

Les considérations les plus importants pour la réussite MALDI MSI sont: 1) la préparation des tissus, 2) le choix de la matrice; 3) l'application de la matrice, et 4) l'interprétation et l'analyse des données. Lorsque l'échantillon et la matrice sont préparées de manière appropriée, l'acquisition des données est automatisée MS. L'analyse des données de ce type d'expérience est assez de main-d'œuvre.

Préparation de tissu approprié est crucial p...

Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Génome Canada et Génome Colombie-Britannique pour le financement de la plate-forme, et de soutien. Nous remercions également le Dr Carol E. Parker pour un examen critique du manuscrit et l'édition assistance. CHL remercie également le Britannique protéomique réseau britannique de soutien.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Rat LiverPel-Freez Biologicals56023-2
Bovine Calf LensPel-Freez Biologicals57114-2Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)Sigma-Aldrich10608MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)Sigma-Aldrich85707MALDI Matrix
ReserpineSigma-Aldrich83580
TerfenadineSigma-AldrichT9652
Formic AcidSigma-Aldrich14265
Ammonium FormateSigma-Aldrich14266
Ammonium HydroxideSigma-Aldrich320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)Sigma-Aldrich302031
WaterSigma-Aldrich39253
MethanolSigma-Aldrich34860
AcetonitrileSigma-Aldrich34967
Ethyl AcetateSigma-Aldrich34972
IsopropanolSigma-Aldrich34965
ChloroformSigma-Aldrich366927
AcetoneSigma-Aldrich34850
EthanolCommercial Alcohols95%
ES Tuning MixAgilent TechnologiesG2431A
ITO Coated Glass SlidesHudson Surface TechnologyPSI1207000Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction PenBicWOSQP11
Airbrush SprayerIwataEclipse HP-CS
ImagePrepBruker249500-LS
MALDI adapterBruker235380

Références

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