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摘要

成神经细胞迁移是在出生后的神经发生一个根本性的事件。我们描述了一个协议，用于使用急性脑片时间推移成像在产后体内电穿孔和随后的迁移可视化的神经母细胞的有效标记。我们包括用于通过视频跟踪神经细胞动力学的定量分析的描述。

摘要

脑室下区（SVZ）是在出生后大脑中的主神经利基之一。在这里，神经祖细胞增殖和神经母细胞能够沿着喙迁移流（RMS）对嗅球（OB）的移动引起。这种长距离的迁移需要在OB的新生神经元的后续成熟，但调控这一过程的分子机制仍不清楚。调查信号通路控制神经细胞活动力可能不仅有助于了解神经发生的基本步骤，同时也有治疗再生潜能，给了这些神经母细胞的目标受到损伤，中风或脑退化站点的能力。

在这个手稿，我们描述了在体内产后电穿孔，并在小鼠RMS的成神经细胞迁移的随后的时间推移成像的详细协议。产后电穿孔能有效转染SVZ祖细胞，从而产生神经母细胞沿RMS迁移。利用共聚焦旋转盘时间推移显微镜对急性脑切片培养，成神经细胞迁移可以在非常类似于在体内条件下的环境进行监测。此外，成神经细胞活力可以跟踪和定量分析。作为一个例子，我们描述了如何使用表达GFP的质粒在体内电穿孔产后标记和可视化的神经母细胞沿RMS迁移。在条件性敲除小鼠用人的loxP系统或shRNA的Cre重组酶表达质粒电穿孔也可用于靶向感兴趣的基因。药理操纵急性脑片培养可以进行调查不同的信号分子在神经细胞迁移中的作用。通过耦合在体内电穿孔随着时间推移成像，我们希望了解控制神经细胞活力的分子机制，并有助于开发小说换货方法来促进大脑修复。

引言

在哺乳动物的大脑，新的神经元（神经）的一代出生后主要发生在两个区域，海马1的齿状回侧脑室和颗粒下层区的脑室下区（SVZ）。聚集在近年来相当多的证据支持对出生后神经发生在海马和嗅球记忆功能1-3的关键作用。重要的是，出生后的神经也持治疗的潜力，因为它与神经退行性疾病的关系，以及神经母细胞迁移到损伤部位在大脑4-6的能力。

脑室下区（SVZ）最近成为一个重要的神经利基。 SVZ来源的神经母细胞对嗅球（OB）通过喙迁移流（RMS）的迁移，使这个在产后大脑1,7,8最长的迁移过程。哺乳动物SVZ / RMS / OB系统已成为一个研究在神经发生不同的步骤，如增殖，迁移和分化1,8有用的模型。许多生长因子和细胞外调节线索SVZ神经发生和迁移沿RMS，但细胞内的分子机制还远远没有得到充分的理解1,9。沿着正确的RMS迁移是新生神经元10的后续成熟至关重要。此外，一些研究表明，SVZ来源的神经母细胞能出的RMS迁移到脑损伤部位4-6,11-13。因此，调查的信令机制，调节神经细胞迁移的根本不仅要了解神经同时也为潜在的治疗应用。

在这里，我们描述了一个详细的协议通过体内电穿孔产后标记SVZ神经祖细胞和使用时间推移旋转盘共聚焦microsco监控他们沿着急性脑切片培养的RMS迁移PY。电穿孔技术被广泛应用于从胚胎到成人阶段14-18发育研究。它是一个强大的工具，目标和操作SVZ神经祖细胞，代表了更便宜和相当快的替代立体定向注射病毒载体转基因模型1,15,19,20或生成。这是一个相对简单的过程，这并不需要手术，并具有高的存活率。电穿孔或shRNA的小鼠遗传模型采用的LoxP系统可用于靶向感兴趣的基因或实现SVZ祖细胞的永久标记，从而表示对成年神经发生的研究21,22的有用工具Cre重组酶表达质粒的构建。

在完整的脑成像RMS的神经细胞迁移仍是由于目前的技术限制的挑战。然而，这个过程可以使用急性脑切片，这提供了合适的共聚焦系统·旋转盘时间推移显微镜进行监测EM相像的体内条件也适合进行药物处理23,24。耦合在产后体内电穿孔随着时间推移成像将有助于控制神经细胞活力的分子机制的理解，并有助于为新的方法来促进大脑修复的发展。

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研究方案

这个程序是按照英国内政部规定（动物科学程序法，1986）。科学家应该遵循建立并获当地机构和国家动物监管机构的指引。

1。产后电穿孔

1.1。玻璃毛细管，DNA解决方案和电穿孔仪的研制

  1. 用于DNA注射准备拉玻璃毛细管（0.86 mm外径：1.5毫米，ID）。 （对于萨特的P-97毛细管拉马指示设置是：热火283;拉50，速度90，时间50）。使在对应于约2微升体积的毛细管的标记。
  2. 设定电穿孔仪的电压至5平方脉冲，50毫秒/脉冲，在100伏，用850毫秒的时间间隔（100伏，脉冲接通50毫秒，脉冲关850毫秒，脉冲5）。
  3. 稀释高纯度（OD 260/280> 1.80），无内毒素质粒DNA为1-2微克/微升终浓度用无内毒素的Tris-EDTA缓冲液中或PBS。它建议添加0.1％的快速绿色的DNA溶液（染料应在心室蔓延时成功注入）。
  4. 准备5-7毫米的电极，电极凝胶和热身的加热垫。

1.2。电穿孔

  1. 从笼子里取出生后2鼠标小狗和异氟醚吸入麻醉它（在〜0.6 L / min的流量）。
  2. 后约1分钟，用足捏响应确定麻醉的状态。如果没有发生移动，进行脑室注射。
  3. 使用吸气管连接到所述毛细管装入毛细管针用1-2微升的DNA。
  4. 在冷光源，握住你的拇指和食指少你的惯用手之间的小狗的头。皮肤稍向后拉的头部，以帮助识别正确的注射点。
  5. 考虑眼睛和t之间的虚拟线他颅骨标志性的lambda（ 图1A）。插入毛细管针在约三分之一这条线的从拉姆达（约1从线中点毫米）15的长度。将约2毫米深的毛细血管，并确保避免在大脑深层渗透。
  6. 通过吹嘴慢慢注入质粒（连接到所述毛细管的注射器也可以使用）。在此过程中，请确保您的手指没有施加太多的压力对大脑，因为这可以防止成功的质粒注射。
  7. 停止喷射时，DNA溶液的少量留在毛细管中。最好是注入小于1微升，以避免在颅内压有害的增加。
  8. 涂层既具有凝胶电极，并将它们与所述正侧上，其中所述DNA被注入（ 图1A）的半球的侧面。对于DNA纳入喙SVZ，地方电极头端稍微向注入点。改变电极的位置可以实现电穿孔的区域特异性的SVZ 22,25的不同区域。
  9. 按脉冲脚踏开关踏板启动电流传输。当电完成后，检查了电穿孔仪显示屏上的电压（电压值应不低于90 V，因为较低的电压值相关性较差的电效率）。
  10. 复活的小狗下对氧气加热垫了几分钟，并返回到笼子里，把它放在远离母亲。确保母亲检索小狗，并与垃圾的休息团聚了。电穿孔后，让幼仔与母亲的下一步骤前4-7天。

2。急性脑切片培养的准备

2.1。解决方案和工具的制备

  1. 下面的解决方案是必需的（但也可以使用高葡萄糖DMEM中进行解剖和成像17）：
    夹层介质（500毫升）
    盖伊的平衡介质 - 500毫升
    45％葡萄糖 - 5毫升
    电影中（10毫升）
    45％葡萄糖 - 0.110毫升
    HEPES 1米 - 0.100毫升
    笔/链球菌 - 0.100毫升
    FCS - 0.500毫升
    B27 - 0.100毫升
    谷氨酰胺 - 0.200毫升
    的Dulbecco改良的Eagle培养基（无酚红） - 8.89毫升
  2. 在37℃下预热电影媒介
  3. 放置Millicell小插入到含有1ml的电影中，代替在湿润的培养箱中在37℃/ 5％CO 2的35毫米的玻璃底培养皿中。
  4. 准备vibratome配件（螺丝起子，室，刀片，胶水等）。
  5. 准备清扫工具：剪刀，小铲，直钳。
  6. 准备工具，用于处理片：小画笔或软接种环（尺寸：10微升），塑料巴斯德吸管，冰盒和几个6厘米塑料菜肴。
  7. 预冷夹层介质在2-4°C。

2.2。脑片的制备

  1. 填写一个6cm菜预冷的夹层介质，将其放在冰（保持新鲜切薄片）。
  2. 下面的颈椎脱位，用剪刀斩首鼠标小狗。用解剖刀除去头皮，切割沿从OB中间矢状缝颅骨小脑，轻轻地使用镊子取下颅盖舌。确保整个大脑暴露，仔细用抹刀，请特别注意不要损坏组织解剖出来。解剖，必须小心进行，但在同一时间很快（不到一分钟，如果可能的话）。颈椎脱位是我们的首选方法，因为终端麻醉药品/气体麻醉剂可以影响神经母细胞和大脑切片文化，这就需要进行成像相对较快下列动物牺牲健康状态的迁移特性。
  3. Hemisect大脑与拉兹或叶片（ 图2）。丢弃未注射的半球或将用于其它实验。
  4. 放置一小片的胶带上的vibratome保持器，并使用胶水的最小必需量的附加 ​​在它上面的大脑半球（ 图2）。这可以防止有害的支架表面的因反复胶水的应用程序。
  5. 待胶水半干几秒钟。
  6. 占位在vibratome托盘装满预冷解剖的解决方案。指向叶片嗅球（ 图2）。
  7. 开始使用适当的设置切断大脑半球。以下参数建议：切片厚度300微米;速度〜3-5;频率〜9。高频率和低转速被推荐，以防止损坏的片。
  8. 使用小画笔或软接种环收集切片。只保留切片可见OB（通常2-3片/脑）。通常，含有大部分的RMS的切片的CAn在约300微米的底表面被发现。
  9. 切片检查标准荧光显微镜的GFP信号（并确保它们翻转过来检查荧光两侧）下，并选择那些呈现沿大部分的RMS明亮的荧光。

2.3。培养脑片

  1. 在细胞培养罩，切掉大脑切片的最尾端第三，取出用细直镊子或显微切割手术刀任何胶水的痕迹。
  2. 使用塑料巴斯德吸管吸微妙片（切吸管尖以创建一个更大的开放，这将避免损坏切片），并把它放在预热的Millicell小的中心刀片。
  3. 确保具有最亮的荧光信号的一侧被放置在与Millicell小插入（用于成像用倒置显微镜）相接触。
  4. 卸下刀片的顶端多余的解剖液用移液管。
  5. 离开切片文化，以定居在37℃/ 5％CO 2培养箱成像前至少1小时。

3。成神经细胞迁移的时间推移成像

  1. 前至少2小时成像，打开珀金埃尔默UltraViewVoX共聚焦旋转盘系统，倒尼康的Ti-E显微镜，滨松C10600-10B（ORCA-R2），冷却数字CCD相机，以及加热系统（索伦特科学）设定在固定导37℃的温度
  2. 打开Volocity软件采集模块，然后单击“即”按钮，选择激光（s）的成像。
  3. 在2小时内脑片的准备​​，将包含在显微镜舞台上成像室大脑切片的玻璃底菜。
  4. 使用尼康CFI超计划氟ELWD 20X/0.45目标在适当的荧光来选择和聚焦的切片的面积将被成像（ 如刚注射部位后在RMS的第一下降部分，或者ELBO瓦特的RMS的区域，或神经母细胞进入OB前刚过肘）。
  5. 设置延时成像与以下操作：
    1. 在显微镜上，单击L100按钮，以允许样品的激光扫描。
    2. 在Volocity，通过选择合适的激光（绿色荧光蛋白如 488纳米激光）打开的Ultraview激光转换。
    3. 设置曝光时间（通常为100-500毫秒）和激光强度（通常为20-30％），这取决于荧光信号的强度。
    4. 调整图像的数字增益提高细胞可视化。
    5. 选择z栈间隔图像的脑片内 （通常在100-120微米的间隔）。选择重叠尽可能（这将有利于后续的跟踪分析）的间隔与分离的细胞的一个合适的数，以避免可能的。
    6. 选择每个Z堆叠图像（通常为2-4微米）之间的间距。
    7. 选择时间INT每一Z堆叠捕获（ 例如 3分钟）和总成像时间（ 例如 3小时）之间erval。
    8. 点击“保存”图标，以将更改保存到成像参数。
    9. 按下录音按钮开始拍摄。
  6. 对照组和实验样品备用成像（例如车辆/药物治疗或不同的电穿孔质粒）全同一天。

4。分析神经细胞迁移

  1. 在Volocity定量模块，打开完成的时间推移实验之后创建期望库。从左上角的对话框（ 图4A，步骤1）选择“扩展对焦”。
  2. 点击“测量”选项卡上显示测量窗口（ 图4A，步骤2）。
  3. 任务列表是在屏幕的左下方可见。拖动“追踪”（下简称“杂项”目前在标题的底部上面的空间中的列表）。这将促使一个新的窗口被称为“轨道”在屏幕的左上部分的开口（ 图4A，步骤3）。
  4. 请从往绩窗口中的“输入”选项卡（ 图4A，第4步）“点”。
  5. 点击点工具（ 图4A，步骤5）。
  6. 首先用鼠标点击到​​池体的中心区域跟踪迁移的神经细胞，并保持跟踪细胞运动，直到延时的最后时间点到达（例如点号61的3小时长的电影） 。
  7. 要获取的数据选择从测量菜单（ 图4B，步骤6-7）“进行测量项目”。一个窗口会出现在屏幕的中央。
  8. 在这个窗口中，选择“称为一种新的测量项目：”并键入一个名称（ 图4C，步骤8）。记住要选择公关之前，“所有时间点”选项咝声行（ 图4C，步骤9）。一个测量项目文件会出现延时的文件中，并将包含参数进行定量分析（ 如迁移距离，速度，位移，位移速率）。
  9. 对测量项目文件，双击打开它作为一个窗口（ 图4D，步骤10）。
  10. 可视化的单曲分析细胞，从“显示”选项（ 图4D，第11步）选择“跟踪点”。
  11. 右键单击该测量项目文件，并将其导出为文本文件，然后可以在Excel等程式来分析迁移参数导入。
  12. 为了测量连续帧和停顿在拍摄期间作出的每一个细胞中，测量项目文件从“显示”选项“点”或“人口”，选择并点击ID（每个轨道都有一个唯一的ID）之间的变动。通过导出着手生成的文件ing作为在步骤4.10解释。

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结果

的SVZ来源的成神经细胞迁移性标签可以沿着RMS可以观察到，一个成功的电穿孔（ 图1B）之后，通常4-8天。更长的时间点，也可以选择，但较少的细胞会在RMS中找到，因为他们大多会已经进入了转播。成神经细胞开始采集成熟粒细胞中的OB的典型形态学特征和电穿孔后约2-3周（未示出）。 〜1小时培养后，从电穿孔的乳鼠脑切片能够可靠地拍摄长达3-4小时。据此前报道23,26，神经...

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讨论

神经祖细胞沿RMS有效的迁移，确保他们的后续成熟为功能性的神经元10。神经祖细胞的朝向突出的OB流是可见的人类婴儿期，并有可能在出生后早期人类大脑发育27起到重要的作用。此外，这些细胞能够靶向脑受损伤和神经退行性变4,28的位点。能够实时监控基因操作对成神经细胞动力学的影响就显得至关重要，充分了解神经细胞的运动引导和规范。

在?...

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披露声明

作者什么都没有透露。

致谢

MS和YZ是由KCL和KCL-中国博士学位奖学金支持。 MO是由一个生物技术和生物科学研究理事会博士助学金。我们感谢冈部胜和淳一宫崎的PCX-EGFP质粒和Alain Chedotal和雅典娜伊普西兰蒂上电宝贵意见。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
MillicellMilliporePICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dishMatTekP35G-0-14-C
Gey's Balanced mediaSigmaG9779-500ML
Glucose, 45%SigmaG8769-100ML
HEPESSigmaH3375-25G
Pen/StrepGIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
B27 supplementInvitrogen Life Technologies17504044
L-GlutamineInvitrogen Life Technologies25030-081
DMEM (phenol red-free)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
Glass capillaries for injectionHarvard Apparatus30-0057
Aspirator tubeSigmaA5177
Sutter P-97 capillary pullerSutter InstrumentP-97
ECM830 Square Wave ElectroporatorHarvard Apparatus45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mmHarvard Apparatus45-0488
Footswitch Model 1250FHarvard Apparatus45-0211
Gel for electrodesCefar Compex6602048
IsofluraneMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomeLeicaVT1000S
GlueRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk systemPerkin ElmerCustomized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity softwarePerkin ElmerAcquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopySolent ScientificCustom-made
Ti-E inverted microscopeNikonCFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

参考文献

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