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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

Résumé

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des principales niches neurogène dans le cerveau postnatal. Ici, cellules progénitrices neurales prolifèrent et donnent lieu à des neuroblastes capables de se déplacer le long de la courant de migration rostrale (RMS) vers le bulbe olfactif (OB). Cette migration de longue distance est nécessaire pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones dans l'OB, mais les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus sont encore peu claires. Enquêter sur les voies de signalisation contrôlant neuroblastes motilité peut non seulement aider à comprendre une étape fondamentale dans la neurogenèse, mais aussi avoir un potentiel de régénération thérapeutique, compte tenu de la capacité de ces neuroblastes de cibler des sites cérébrales affectées par une blessure, accident vasculaire cérébral, ou dégénérescence.

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé pour in vivo électroporation postnatal et après imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le RMS de la souris. Électroporation postnatale peut efficacement transfecter SVZ ancêtrecellules, qui à leur tour, les neuroblastes qui migrent le long des RMS. Confocale disque en rotation time-lapse microscopie sur des cultures de tranches de cerveau de courte durée, la migration des neuroblastes peut être contrôlée dans un environnement ressemblant étroitement à la condition in vivo. En outre, neuroblaste motilité peut être suivi et analysé quantitativement. A titre d'exemple, nous décrivons comment utiliser in vivo postnatale électroporation d'un plasmide exprimant la GFP d'étiqueter et de visualiser les neuroblastes qui migrent le long des RMS. L'électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant chez la souris knock-out conditionnel qui emploient le système de LoxP peut également être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt. Manipulation pharmacologique des cultures de tranches de cerveau aiguë peut être effectuée pour étudier le rôle des différentes molécules de signalisation dans la migration des neuroblastes. En couplant électroporation in vivo avec imagerie time-lapse, nous espérons comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité neuroblastes et contribuer au développementment de nouvelles approches pour favoriser la réparation du cerveau.

Introduction

Dans le cerveau des mammifères, la génération de nouveaux neurones (neurogenèse) commence après la naissance principalement dans deux régions, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire dans le gyrus denté de l'hippocampe 1. Des preuves considérables recueillies au cours des dernières années prend en charge un rôle essentiel pour la neurogenèse postnatale dans les fonctions de mémoire de l'ampoule de l'hippocampe et olfactives 1-3. Surtout, la neurogenèse postnatale est également titulaire d'un potentiel thérapeutique en raison de sa relation avec les troubles neurologiques dégénératives, et la capacité des neuroblastes à migrer vers les sites blessés dans le cerveau 4-6.

La zone sous-ventriculaire (SVZ) a récemment émergé comme une niche neurogène crucial. Neuroblastes SVZ dérivés migrent vers le bulbe olfactif (OB) via le courant de migration rostrale (RMS), ce qui en fait le plus long processus de migration dans le cerveau 1,7,8 postnatale. Le / RMS / système de OB mammifère SVZ est devenu unmodèle utile pour étudier les différentes étapes de la neurogenèse, tels que la prolifération, la migration et la différenciation 1,8. Beaucoup de facteurs de croissance et signaux extracellulaires régulent la neurogenèse SVZ et migration le long des RMS, mais les mécanismes moléculaires intracellulaires sont loin d'être pleinement compris 1,9. Migration correcte le long des RMS est essentiel pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones 10. En outre, certaines études ont montré que les neuroblastes SVZ dérivés peuvent migrer hors des RMS aux sites de lésions cérébrales 4-6,11-13. Ainsi, l'enquête de la migration des neuroblastes mécanismes de signalisation de régulation est fondamental non seulement pour comprendre la neurogenèse, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour marquer progéniteurs neuronaux SVZ par électroporation postnatale in vivo et de suivre leur migration le long des RMS dans les cultures de tranches de cerveau de courte durée en utilisant time-lapse disque rotatif confocale microscopy. L'électroporation est largement utilisé dans les études de développement de l'embryon à stade adulte 14-18. Il est un outil puissant pour cibler et manipuler progéniteurs neuronaux SVZ et représente une alternative moins coûteuse et beaucoup plus rapide à l'injection stéréotaxique de vecteurs viraux ou génération de modèles transgéniques 1,15,19,20. Il s'agit d'un procédé relativement simple qui ne nécessite pas une intervention chirurgicale et a des taux de survie élevés. Électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant dans les modèles génétiques de souris qui emploient le système loxP peut être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt ou de réaliser l'étiquetage permanent des progéniteurs SVZ, ce qui représente un outil utile pour les études de la neurogenèse adulte 21,22.

Imagerie RMS migration des neuroblastes dans le cerveau intact est encore difficile en raison de limitations techniques actuelles. Toutefois, ce processus peut être contrôlé à l'aide confocale à disque rotatif time-lapse microscopie de tranches de cerveau de courte durée, qui fournissent un syst appropriélui ressemblant étroitement à la condition in vivo aussi prêtent à la manipulation pharmacologique 23,24. Couplage dans électroporation postnatale vivo avec imagerie time-lapse facilitera la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant neuroblastes motilité et contribuer au développement de nouvelles approches pour promouvoir la réparation du cerveau.

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Protocole

Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales.

Une. Postnatale électroporation

1.1. Préparation de verre capillaires, de l'ADN de solutions et Electroporator

  1. Préparer des capillaires de verre tiré (DO: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) pour l'injection d'ADN. (Paramètres indicatifs pour un capillaire extracteur Sutter P-97 sont: chaleur 283; Tirer 50; Velocity 90; heure 50). Faire une marque sur le capillaire correspondant à un volume d'environ 2 pl.
  2. Régler la tension de la électroporateur à 5 impulsions carrées, 50 ms / impulsion à 100 V, avec 850 intervalles ms (100 V, impulsion ON 50 ms, impulsion OFF 850 ​​ms, impulsion 5).
  3. Diluer à haute pureté (DO 260/280> 1,80) de l'ADN plasmidique à l'endotoxine libre à une concentration finale de 1 à 2 ug / ulavec une endotoxine libérer un tampon Tris-EDTA ou du PBS. Il est recommandé d'ajouter 0,1% de vert de production rapide de la solution d'ADN (le colorant doit se propager dans le ventricule lorsqu'il est injecté avec succès).
  4. Préparer les électrodes 5-7 mm, le gel de l'électrode et réchauffer le coussin chauffant.

1.2. Électroporation

  1. Suppression d'un jour 2 chiot postnatal de la souris de cage et anesthésier par inhalation d'isoflurane (à un débit de ~ 0,6 L / min).
  2. Après environ 1 minute, de déterminer l'état de l'anesthésie à l'aide de la réponse du pied presseur. Si aucun mouvement n'est détecté, procéder à l'injection intraventriculaire.
  3. Charger aiguille capillaire avec 1-2 pl de l'ADN en utilisant un tube d'aspiration relié au tube capillaire.
  4. Sous une source de lumière froide, tenir la tête du chiot entre le pouce et l'index de votre main moins dominante. Tirez légèrement la peau du dos de la tête pour aider à l'identification du point d'injection à droite.
  5. Considérons une ligne virtuelle entre l'œil et til craniométriques repère lambda (figure 1A). Insérer l'aiguille capillaire à environ un tiers de la longueur de cette ligne à partir de la lambda (environ 1 mm à partir du point médian de la ligne 15). Insérer le capillaire sur 2 mm de profondeur, en veillant à éviter une pénétration profonde dans le cerveau.
  6. Injecter lentement plasmide par soufflage à travers la bouche (une seringue connectée au capillaire peut également être utilisé). Au cours de cette procédure, assurez-vous que vos doigts ne sont pas appliquer trop de pression sur le cerveau, car cela peut empêcher l'injection de plasmide succès.
  7. Arrêter l'injection lorsque la quantité minimale de solution d'ADN est laissé dans le capillaire. Il est recommandé d'injecter à moins de 1 ul d'éviter l'augmentation de la pression intracrânienne délétère.
  8. Manteau deux électrodes avec du gel et placez-les avec le côté positif sur la face latérale de l'hémisphère où l'ADN a été injecté (figure 1A). Pour l'incorporation d'ADN dans la SVZ rostrale, place des électrodes peu rostrale à lapoint d'injection. Faire varier la position de l'électrode peut obtenir une spécificité régionale de l'électroporation dans différents domaines de la SVZ 22,25.
  9. Initier le transfert en cours en appuyant sur la pédale impulsion de pédale. Lorsque l'électroporation est terminée, vérifier la tension sur l'écran de électroporateur (valeurs de tension ne doit pas être inférieure à 90 V, car les valeurs de tension plus faible corrélation avec une faible efficacité d'électroporation).
  10. Réanimer le chiot sous oxygène sur coussin chauffant pendant quelques minutes et le retourner à la cage, le plaçant loin de la mère. Assurez-vous que la mère récupère le chiot et réunit avec le reste de la litière. Après électroporation, laissez les petits avec leur mère pendant 4-7 jours avant l'étape suivante.

2. Préparation des cultures aiguë tranche cerveau

2.1. Préparation des solutions et outils

  1. Les solutions suivantes sont nécessaires (il est également possible d'utiliser-DMEM riche en glucose pour disséquer et d'imagerie17):
    Dissection Medium (500 ml)
    Médias équilibrée de Gey - 500ml
    45% Glucose - 5ml
    Film moyen (10 ml)
    45% de glucose - 0.110 ml
    HEPES 1 M - 0,100 ml
    Pen / Strep - 0.100 ml
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0.100 ml
    Glutamine - 0,200 ml
    Dulbecco Modified Eagle Medium (rouge de phénol libre) - 8,89 ml
  2. Réchauffez milieu de film à 37 ° C.
  3. Placez Millicell insère dans un fond plat de la culture 35 mm de verre contenant 1 ml de milieu de film et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2.
  4. Préparer vibratome accessoires (tournevis, chambre, lames de rasoir, de la colle).
  5. Préparer les outils de dissection: ciseaux, petite spatule, pinces droites.
  6. Préparer les outils pour la manipulation de tranches: petit pinceau doux ou anse (taille: 10 pi), pipettes Pasteur en plastique, une boîte de glace et plusieurs plats en plastique 6 cm.
  7. Prérefroidir le milieu de dissectionà 2-4 ° C.

2.2. Préparation des tranches de cerveau

  1. Remplir un plat de 6 cm avec un milieu de dissection pré-refroidi et placez-le sur la glace (pour garder des tranches fraîchement coupées).
  2. Après la dislocation cervicale, utiliser des ciseaux pour décapiter le chiot de la souris. Retirez le cuir chevelu avec un scalpel, couper le crâne long de la suture mi-sagittal de l'OB pour le cervelet et retirez délicatement les volets crâniens aide d'une pince. Assurez-vous que l'ensemble du cerveau est exposé et soigneusement disséquer à l'aide d'une spatule, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. La dissection doit être fait avec soin, mais en même temps très rapidement (moins d'une minute si possible). Dislocation cervicale est notre méthode préférée, car l'anesthésie terminaux avec des anesthésiques médicaments / de gaz peuvent influencer les propriétés de migration des neuroblastes et l'état de santé des cultures tranche de cerveau, qui doivent être imagé relativement rapidement après le sacrifice animal.
  3. Hemisect le cerveau avec un razou lame (Figure 2). Jeter hémisphère non injectée ou à d'autres expériences.
  4. Placer un petit morceau de ruban adhésif sur le support de vibratome et utiliser la quantité minimale nécessaire de la colle pour fixer l'hémisphère du cerveau au-dessus de celui-ci (figure 2). Ceci permet d'éviter d'endommager la surface de support à des applications répétées en raison de la colle.
  5. Laissez la colle sécher pendant quelques secondes.
  6. Placez support dans le bac vibratome rempli de solution de dissection pré-refroidi. Pointer le bulbe olfactif vers la lame (Figure 2).
  7. Commencez à couper l'hémisphère du cerveau en utilisant les paramètres appropriés. Les paramètres suivants sont recommandés: épaisseur de la tranche 300 um; vitesse ~ 3-5, la fréquence ~ 9. Haute fréquence et basse vitesse sont recommandés pour éviter d'endommager la tranche.
  8. Recueillir tranches à l'aide d'un petit pinceau ou une anse doux. Ne garder que les tranches avec OB visible (habituellement 2-3 tranches / cerveau). Typiquement, la tranche contenant la plupart des RMS can se trouve à ~ 300 um de la surface inférieure.
  9. Vérifiez tranches sous un microscope fluorescent standard pour le signal de la GFP (en prenant soin de les retourner pour vérifier fluorescence des deux côtés), et choisir celles montrant la fluorescence lumineuse le long de la plupart des RMS.

2.3. La culture de tranches de cerveau

  1. Dans une hotte de culture cellulaire, couper la troisième plus caudale de la tranche de cerveau et enlever toute trace de colle en utilisant une pince à épiler droites fines ou un scalpel de microdissection.
  2. Délicatement aspirer la tranche à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de la pipette pour créer une plus grande ouverture, ce sera de ne pas endommager la tranche) et le placer sur le centre d'un Millicell préchauffé insert.
  3. Assurez-vous que le côté avec le signal fluorescent lumineux est placé en contact avec le Millicell insérer (pour l'imagerie avec un microscope inversé).
  4. Retirer la solution de dissection excès au-dessus de l'insert avec une pipette.
  5. Laissez cultures tranche des'installer dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 1 h avant l'imagerie.

3. Imagerie time-lapse de la migration neuroblaste

  1. Au moins 2 heures avant l'imagerie, allumez le système Perkin Elmer UltraViewVoX confocale à disque rotatif, inversé Nikon Ti-E microscope, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) caméra CCD refroidie numérique, et le système de chauffage (Solent scientifique) fixé à la constante température de 37 ° C.
  2. Ouvrez le module d'acquisition de logiciels de Volocity et cliquez sur le bouton "Viz" et sélectionnez le laser (s) pour l'imagerie.
  3. Dans 2 heures de cerveau préparation de tranches, placez le plat de fond de verre contenant la tranche de cerveau dans la chambre d'imagerie sur la platine du microscope.
  4. Utilisez un objectif Nikon FCI super plan Fluor ELWD 20X/0.45 sous la lumière fluorescente approprié de choisir et de se concentrer le domaine de la tranche qui sera imagée (par exemple, la première partie descendante du RMS juste après le site d'injection, ou la elbow région des RMS, ou juste après le coude avant neuroblastes entrer l'OB).
  5. Mettre en place l'imagerie time-lapse avec les actions suivantes:
    1. Sur le microscope, cliquez sur le bouton L100 pour permettre à balayage laser de l'échantillon.
    2. En Volocity, ouvrez le changeur laser ultraView en sélectionnant le laser approprié (par exemple 488 nm laser pour la GFP).
    3. Régler le temps d'exposition (en général entre 100 à 500 ms) et de l'intensité du laser (en général 20 à 30%) en fonction de l'intensité du signal fluorescent.
    4. Réglez le gain d'image numérique pour améliorer la visualisation de la cellule.
    5. Sélectionnez l'intervalle z-pile à l'image à l'intérieur de la tranche de cerveau (généralement sur ​​une intervalle de 100-120 um). Choisir un intervalle d'un nombre approprié de cellules isolées pour éviter des chevauchements possible, autant que possible (ce qui facilitera l'analyse de suivi ultérieur).
    6. Sélectionner l'espacement entre chaque image z-pile (habituellement 2-4 um).
    7. Choisissez le moment intErval entre chaque capture z-pile (par exemple 3 min) et la durée totale de formation d'image (par exemple de 3 heures).
    8. Cliquez sur l'icône "Sauvegarder" pour enregistrer les modifications apportées aux paramètres d'imagerie.
    9. Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour commencer l'imagerie.
  6. Alternate imagerie d'échantillons témoins et expérimentaux (par exemple véhicule / traitement médicamenteux ou différents plasmides par électroporation) dans l'ensemble le même jour.

4. Analyser neuroblaste migrations

  1. Dans le module Volocity quantification, ouvrez la bibliothèque souhaitée créé après avoir terminé une expérience time-lapse. Sélectionnez "Mise au point étendue" de la boîte en haut à gauche (figure 4A, étape 1).
  2. Cliquez sur l'onglet "Mesures" pour afficher la fenêtre de mesure (figure 4A, étape 2).
  3. Une liste de tâches est visible dans le coin inférieur gauche de l'écran. Drag "Track" (présent sous le titre «Divers» au bas dela liste) sur l'espace ci-dessus. Cela incitera l'ouverture d'une nouvelle fenêtre appelée "Track" à la partie supérieure gauche de l'écran (figure 4A, étape 3).
  4. Sélectionnez "Points" de l'onglet "Input" dans la fenêtre Track (figure 4A, étape 4).
  5. Cliquez sur l'outil Point (figure 4A, étape 5).
  6. Commencer le suivi de la neuroblastes migration en cliquant avec la souris sur la zone centrale du corps cellulaire et de garder le suivi des mouvements de la cellule jusqu'à ce que le dernier point de la time-lapse de temps est atteinte (par exemple le point numéro 61 pour un film de 3 heures de long) .
  7. Pour obtenir des données choisir "Faire Point de mesure" dans le menu Mesures (figure 4B, les étapes 6-7). Une fenêtre apparaît au centre de l'écran.
  8. Dans cette fenêtre, sélectionnez "Un nouvel élément de mesure appelée:" et tapez un nom (figure 4C, étape 8). N'oubliez pas de sélectionner l'option "Tous les points de temps" avant presser OK (figure 4C, étape 9). Un fichier d'élément de mesure apparaîtra sous le fichier time-lapse et contenir des paramètres pour l'analyse quantitative (par exemple, la distance de migration, de vitesse, de déplacement, et taux de déplacement).
  9. Double-cliquez sur le fichier d'élément de mesure de l'ouvrir comme une fenêtre (figure 4D, l'étape 10).
  10. Pour visualiser les pistes individuelles de cellules analysées, choisissez «Point chenilles" dans les options d'affichage "" (figure 4D, étape 11).
  11. Faites un clic droit sur le fichier d'objet de mesure et de l'exporter en tant que fichier texte, qui peut ensuite être importé dans des programmes comme Excel pour analyser les paramètres de migration.
  12. Pour mesurer les mouvements entre les images consécutives et les pauses faites par chaque cellule au cours de la période de tournage, dans le fichier d'objet mesure, sélectionner des options "Affichage" "point" ou "populations" et cliquez sur ID (chaque piste a un numéro d'identification unique). Exportez le fichier résultant par procéderment comme expliqué à l'étape 4.10.

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Résultats

Étiquetage des neuroblastes migrateurs SVZ dérivés peut être observé le long des RMS, habituellement 4-8 jours après une électroporation réussie (figure 1B). Points de plus longues peuvent également être choisis, mais moins de cellules se trouvent dans les RMS, car la plupart d'entre eux sont entrés dans l'OB. Neuroblastes commencent acquisition morphologie typique et les caractéristiques de cellules granulaires matures dans l'OB environ 2-3 semaines après l'électroporation...

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Discussion

Migration efficace de cellules progénitrices neurales le long des RMS assure leur maturation ultérieure en neurones fonctionnels 10. Flux importants de progéniteurs neuronaux dirigés vers l'OB sont visibles dans l'enfance humaine et sont susceptibles de jouer un rôle important au début postnatal le développement du cerveau humain 27. De plus, ces cellules sont capables de cibler des sites du cerveau affectées par une lésion et la neurodégénérescence 4,28. Être capabl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

MS et YZ sont pris en charge par KCL KCL et la Chine bourses de doctorat. MO a été financée par une bourse d'études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Masaru Okabe et Jun-ichi Miyazaki pour le plasmide pCX-EGFP et Alain Chedotal et Athena Ypsilanti pour de précieux conseils sur l'électroporation.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
MillicellMilliporePICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dishMatTekP35G-0-14-C
Gey's Balanced mediaSigmaG9779-500ML
Glucose, 45%SigmaG8769-100ML
HEPESSigmaH3375-25G
Pen/StrepGIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
B27 supplementInvitrogen Life Technologies17504044
L-GlutamineInvitrogen Life Technologies25030-081
DMEM (phenol red-free)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
Glass capillaries for injectionHarvard Apparatus30-0057
Aspirator tubeSigmaA5177
Sutter P-97 capillary pullerSutter InstrumentP-97
ECM830 Square Wave ElectroporatorHarvard Apparatus45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mmHarvard Apparatus45-0488
Footswitch Model 1250FHarvard Apparatus45-0211
Gel for electrodesCefar Compex6602048
IsofluraneMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomeLeicaVT1000S
GlueRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk systemPerkin ElmerCustomized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity softwarePerkin ElmerAcquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopySolent ScientificCustom-made
Ti-E inverted microscopeNikonCFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

Références

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