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Resumen

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

Resumen

La zona subventricular (SVZ) es uno de los principales nichos neurogénicos en el cerebro postnatal. Aquí, progenitores neurales proliferan y dan lugar a neuroblastos capaces de moverse a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB). Se requiere esta migración de larga distancia para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas en el OB, pero los mecanismos moleculares que regulan este proceso aún no están claros. La investigación de las vías de señalización que controlan la motilidad neuroblastos no sólo puede ayudar a entender un paso fundamental en la neurogénesis, pero también tienen el potencial de regeneración terapéutica, dada la capacidad de estos neuroblastos en los sitios diana del cerebro afectadas por una lesión, accidente cerebrovascular, o degeneración.

En este manuscrito se describe un protocolo detallado para la electroporación in vivo postnatal y la posterior time-lapse de la migración de los neuroblastos en el RMS ratón. Electroporación postnatal puede transfectar eficazmente SVZ progenitorcélulas, que a su vez generan neuroblastos migran a lo largo de la RMS. El uso de disco giratorio confocal time-lapse microscopía en cultivos de cortes cerebrales agudos, la migración de los neuroblastos se puede controlar en un ambiente muy parecido al estado in vivo. Por otra parte, la movilidad de los neuroblastos pueden ser rastreados y analizados cuantitativamente. A modo de ejemplo, se describe cómo utilizar la electroporación in vivo después del parto de un plásmido GFP-expresando etiquetar y visualizar los neuroblastos migran a lo largo de la RMS. La electroporación de plásmidos que expresan recombinasa CRE shRNA o en ratones knock-out condicionales que emplean el sistema LoxP también se puede utilizar para apuntar a los genes de interés. La manipulación farmacológica de cultivos de cortes cerebrales agudos se puede realizar para investigar el papel de las diferentes moléculas de señalización en la migración de los neuroblastos. Mediante el acoplamiento de la electroporación in vivo con time-lapse, esperamos comprender los mecanismos moleculares que controlan la motilidad de los neuroblastos y contribuir al desarrollo deción de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

Introducción

En el cerebro de los mamíferos, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce después del nacimiento principalmente en dos regiones, la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular en el giro dentado del hipocampo 1. Considerable evidencia reunida en los últimos años destaca el papel primordial para la neurogénesis postnatal en funciones de la memoria del hipocampo y el bulbo olfatorio 1-3. Es importante destacar que la neurogénesis postnatal también tiene potencial terapéutico debido a su relación con los trastornos neurológicos degenerativos, y la capacidad de los neuroblastos a migrar a sitios de heridas en el cerebro 4-6.

La zona subventricular (SVZ) ha surgido recientemente como un nicho neurogénico crucial. Neuroblastos derivados de SVZ migran hacia el bulbo olfatorio (OB) a través de la corriente migratoria rostral (RMS), haciendo de este el proceso de migración más largo del 1,7,8 cerebro postnatal. El / RMS / sistema OB de mamíferos SVZ se ha convertido en unmodelo útil para estudiar los diferentes pasos en la neurogénesis, como la proliferación, migración y diferenciación de 1,8. Muchos factores de crecimiento y señales extracelulares regulan la neurogénesis ZVS y la migración a lo largo de la RMS, pero los mecanismos moleculares intracelulares están lejos de ser plenamente entendidos 1,9. Migración correcta a lo largo de la RMS es crucial para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas 10. Además, algunos estudios han demostrado que los neuroblastos derivados de SVZ pueden migrar fuera de los RMS a los sitios de lesión cerebral 4-6,11-13. Por lo tanto, la investigación de la migración de los neuroblastos mecanismos de señalización de regulación es fundamental no sólo para entender la neurogénesis, sino también para aplicaciones terapéuticas potenciales.

Aquí se describe un protocolo detallado para etiquetar progenitores neurales SVZ por electroporación in vivo después del parto y vigilar su migración a lo largo de los RMS en cultivos de cortes cerebrales agudos utilizando time-lapse confocal de disco giratorio microscópicapy. La electroporación es ampliamente utilizado en los estudios de desarrollo de embriones a los estadios adultos de 14-18. Es una poderosa herramienta para orientar y manipular progenitores neurales SVZ y representa una alternativa más barata y mucho más rápida que la inyección estereotáxica de vectores virales o generación de modelos transgénicos 1,15,19,20. Se trata de un procedimiento relativamente simple que no necesita cirugía y tiene altas tasas de supervivencia. Electroporación de shRNA o plásmidos que expresan recombinasa CRE en los modelos genéticos de ratones que emplean el sistema LoxP se puede utilizar para apuntar a genes de interés o para conseguir el etiquetado permanente de progenitores ZVS, lo que representa una herramienta útil para estudios de la neurogénesis adulta 21,22.

Imaging RMS neuroblast migración en el cerebro intacto sigue siendo un reto debido a las limitaciones técnicas actuales. Sin embargo, este proceso se puede controlar utilizando el disco confocal hilado time-lapse microscopía de rodajas de cerebro de agudos, que proporcionan una adecuada sistem muy parecidas a las condiciones in vivo también susceptibles a la manipulación farmacológica 23,24. Acoplamiento de electroporación postnatal vivo con time-lapse facilitará la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la motilidad neuroblastos y contribuir al desarrollo de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

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Protocolo

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales.

1. Postnatal electroporación

1.1. Preparación de vidrio capilares, solución de ADN y Electroporador

  1. Preparar capilares de vidrio tirados (OD: 1.5 mm, ID: 0,86 mm) para la inyección de ADN. (Ajustes indicativos de un capilar extractor Sutter P-97 son: Heat 283; Tire 50; Velocity 90, Hora 50). Haga una marca en el capilar que corresponde a un volumen de aproximadamente 2 l.
  2. Ajuste la tensión del electroporador a 5 pulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 V, con 850 intervalos ms (100 V, impulso ON 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5).
  3. Diluir de alta pureza (OD 260/280> 1,80) plásmido de ADN libre de endotoxina a una concentración final de 1-2 mg / lcon endotoxina liberar tampón Tris-EDTA o PBS. Se recomienda añadir 0,1% Verde rápido a la solución de ADN (el colorante debe extenderse en el ventrículo cuando se inyecta con éxito).
  4. Prepare los electrodos de 5-7 mm, el gel de electrodos y calentar la almohadilla térmica.

1.2. La electroporación

  1. Quitar un postnatal día 2 crías de ratones de la jaula y anestesiar por inhalación de isoflurano (con un flujo de ~ 0,6 L / min).
  2. Después de aproximadamente 1 min, determinar el estado de anestesia usando la respuesta de presión del pie. Si no se produce ningún movimiento, proceder a la inyección intraventricular.
  3. Carga de la aguja capilar con 1-2 l de ADN usando un tubo aspirador conectado al capilar.
  4. En virtud de una fuente de luz fría, mantenga la cabeza de la cría entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante. Tire ligeramente de la piel de la espalda en la cabeza para ayudar a identificar el punto de inyección derecha.
  5. Considere la posibilidad de una línea virtual entre el ojo y tél craneométricos lambda hito (Figura 1A). Insertar la aguja capilar en alrededor de un tercio de la longitud de esta línea de la lambda (alrededor de 1 mm desde el punto medio de línea) 15. Introduzca el capilar de unos 2 mm de profundidad, asegurándose de evitar la penetración profunda en el cerebro.
  6. Inyectar plásmido soplando lentamente a través de la boca (una jeringa conectada al capilar también se puede utilizar). Durante este procedimiento, asegúrese de que sus dedos no están aplicando demasiada presión en el cerebro, ya que esto puede evitar la inyección de plásmido éxito.
  7. Deje de inyección cuando se deja una cantidad mínima de solución de ADN en el capilar. Es aconsejable inyectar menos de 1 l para evitar un aumento perjudicial de la presión intracraneal.
  8. Cubra ambos electrodos con gel y los colocan con el lado positivo en el lado lateral del hemisferio donde se inyectó el ADN (Figura 1A). Para la incorporación de ADN en el rostral SVZ, colocar electrodos ligeramente rostral a lapunto de inyección. Variando la posición del electrodo puede lograr especificidad regional de la electroporación en diferentes áreas de la SVZ 22,25.
  9. Inicie la transferencia actual presionando el pedal del interruptor de pie del pulso. Cuando la electroporación es completa, verifique el voltaje en la pantalla electroporador (valores de tensión no deben estar por debajo de 90 V, ya que los valores de tensión más baja se correlaciona con la baja eficiencia de la electroporación).
  10. Reanimar el cachorro bajo de oxígeno en la almohadilla caliente durante unos minutos y devolverlo a la jaula, colocándola lejos de la madre. Asegúrese de que la madre recupera el cachorro y se reúne con el resto de la camada. Después de la electroporación, deje cachorros con su madre durante 4-7 días antes de la siguiente etapa.

2. Preparación de las Culturas aguda de cortes de cerebro

2.1. Preparación de las soluciones y herramientas

  1. Las siguientes soluciones se requieren (también es posible utilizar DMEM de alta glucosa para la disección y de formación de imágenes17):
    Disección Medio (500 ml)
    Balanced medios de Gey - 500ml
    45% de glucosa - 5ml
    Película Medio (10 ml)
    45% de glucosa - 0.110 ml
    HEPES 1 M - 0.100 ml
    Pen / Strep - 0.100 ml
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0.100 ml
    Glutamina - 0.200 ml
    Dulbecco Modificado Medio Eagle (libre de rojo fenol) - 8,89 ml
  2. Mediano película Calentar a 37 ° C.
  3. Coloque Millicell inserta en un plato de cultivo de fondo 35 mm de vidrio que contiene 1 ml de medio de películas y colóquelo en un incubador humidificado a 37 ° C / 5% CO 2.
  4. Preparar vibratome accesorios (destornillador, cámara, hojas de afeitar, pegamento).
  5. Preparar herramientas de disección: tijeras, pequeña espátula, pinzas rectas.
  6. Preparar las herramientas para el manejo de rebanadas: pincel pequeño o un asa de inoculación suave (tamaño: 10 l), pipetas Pasteur de plástico, una caja de hielo y varios platos de plástico de 6 cm.
  7. PreCool el medio de diseccióna 2-4 ° C.

2.2. Preparación del cerebro Slices

  1. Llene un recipiente de 6 cm con medio disección previamente enfriada y colocarlo en hielo (para mantener rodajas recién cortadas).
  2. Después de la dislocación cervical, use tijeras para decapitar al cachorro ratón. Retire el cuero cabelludo con un bisturí, cortar el cráneo largo de la sutura sagital medial del OB en el cerebelo y retire suavemente las aletas craneales utilizando fórceps. Asegúrese de que todo el cerebro está expuesto y cuidadosamente diseccionar a cabo utilizando una espátula, teniendo especial cuidado de no dañar el tejido. La disección se tiene que hacer con cuidado, pero al mismo tiempo muy rápidamente (menos de un minuto si es posible). La dislocación cervical es nuestro método preferido porque la anestesia terminal con anestésicos drogas / gas pueden influir sobre las propiedades migratorias de los neuroblastos y la prosperidad de los cultivos de cortes de cerebro, que necesitan para ser fotografiado con relativa rapidez después del sacrificio de los animales.
  3. Hemisect el cerebro con una razo cuchilla (Figura 2). Deseche hemisferio no inyectada o el uso para otros experimentos.
  4. Coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva en el titular vibratome y utilizar la cantidad mínima necesaria de pegamento para unir el hemisferio cerebral en la parte superior del mismo (Figura 2). Esto evita dañar la superficie de soporte debido a las aplicaciones repetidas de pegamento.
  5. Deje que el pegamento se seque durante unos segundos.
  6. Coloque en la bandeja del sostenedor vibratome lleno de solución disección previamente enfriada. Apuntar el bulbo olfatorio hacia la cuchilla (Figura 2).
  7. Empiece a cortar el hemisferio cerebral usando los ajustes apropiados. Se recomiendan los siguientes parámetros: grosor de corte de 300 m; velocidad de ~ 3-5; frecuencia ~ 9. De alta frecuencia y baja velocidad se recomiendan para evitar daños en la división.
  8. Recoger rebanadas utilizando un pincel pequeño o un asa de inoculación suave. Sólo mantener las rebanadas con OB visible (generalmente 2-3 rebanadas / cerebro). Típicamente, la porción que contiene la mayor parte de los RMS can se encuentra en ~ 300 micras desde la superficie inferior.
  9. Compruebe las rebanadas con un microscopio fluorescente estándar para la señal de las buenas prácticas agrarias (asegurándose de darle la vuelta para comprobar la fluorescencia en ambos lados), y elegir los que muestran fluorescencia brillante a lo largo de la mayor parte de los RMS.

2.3. El cultivo de cerebro Slices

  1. En una campana de cultivo de células, cortar el tercio más caudal de la rebanada de cerebro y eliminar los restos de pegamento utilizando pinzas rectas finas o un bisturí microdisección.
  2. Delicadamente aspirar el sector mediante una pipeta Pasteur de plástico (corte la punta de la pipeta para crear una abertura más grande, esto evitará dañar la rebanada) y colocarlo en el centro de un Millicell precalentado inserción.
  3. Asegúrese de que el lado con la señal fluorescente brillante se coloca en contacto con el Millicell insertar (para formación de imágenes con un microscopio invertido).
  4. Eliminar el exceso de solución de disección en la parte superior de la pieza de inserción con una pipeta.
  5. Deja cultivos de corte aestablecerse en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 ° por lo menos durante 1 hora antes de exponer.

3. Time-lapse de imágenes de Neuroblast Migración

  1. Por lo menos 2 horas antes de la imagen, encienda el sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal spinning, invertida microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) enfriado cámara CCD digital, y el sistema de calefacción (Solent Scientific) fijado en la constante temperatura de 37 ° C.
  2. Abra el módulo de adquisición de software Volocity y haga clic en el botón "Viz" y seleccione el láser (s) para la obtención de imágenes.
  3. Dentro de 2 horas de preparación de cortes de cerebro, coloque el plato de fondo de vidrio que contiene el corte de cerebro en la cámara de imágenes en la platina del microscopio.
  4. Utilice un objetivo Nikon CFI Súper Plan de Fluor ELWD 20X/0.45 bajo la luz fluorescente adecuado seleccionar y centrar el área de la rebanada que será fotografiada (por ejemplo, la primera parte descendente del RMS justo después de la zona de la inyección o la elbow región del RMS, o justo después del codo antes de neuroblastos entran en el OB).
  5. Configure el time-lapse con las siguientes acciones:
    1. En el microscopio, haga clic en el botón L100 para permitir el escaneado láser de la muestra.
    2. En Volocity, abra el láser cambiador ULTRAVIEW seleccionando el láser adecuado (por ejemplo, 488 nm láser para GFP).
    3. Ajuste el tiempo de exposición (por lo general entre 100-500 mseg) y la intensidad del láser (generalmente 20-30%) en función de la intensidad de la señal fluorescente.
    4. Ajuste la ganancia digital de imagen para mejorar la visualización de la célula.
    5. Seleccione el intervalo z-stack de imagen dentro de la sección de cerebro (por lo general más de un intervalo de 100 a 120 m). Elija un intervalo con un número adecuado de células aisladas para evitar posibles solapamientos tanto como sea posible (esto facilitará el análisis de seguimiento posterior).
    6. Seleccionar el espacio entre cada imagen Z-pila (normalmente 2-4 m).
    7. Elija el momento intErval entre cada captura z-stack (por ejemplo, 3 min) y la duración total de imágenes (por ejemplo, 3 h).
    8. Haga clic en el icono "Guardar" para guardar los cambios en los parámetros de la imagen.
    9. Pulse el botón de grabación para comenzar a imágenes.
  6. Imágenes Alterno de muestras de control y experimentales (para / tratamiento farmacológico ejemplo vehículo o diferentes plásmidos por electroporación) en todo el mismo día.

4. Analizando las Migraciones Neuroblast

  1. En el módulo Volocity cuantificación, abra la biblioteca deseada creado después de completar un experimento de time-lapse. Seleccione "Enfoque ampliado" en el cuadro de la parte superior izquierda (Figura 4 A, paso 1).
  2. Haga clic en la pestaña "Medidas" para mostrar la ventana de medición (Figura 4, paso 2).
  3. Una lista de tareas es visible en la parte inferior izquierda de la pantalla. Drag "Track" (presente en la sección "Miscelánea" la partida en la parte inferior dela lista) en el espacio de arriba. Esto hará que la apertura de una nueva ventana llamada "Track" en la parte superior izquierda de la pantalla (Figura 4 A, paso 3).
  4. Seleccione "Puntos" de la pestaña "Input" en la ventana Track (Figura 4A, paso 4).
  5. Haga clic en la herramienta Punto (Figura 4A, el paso 5).
  6. Iniciar el seguimiento de la migración de los neuroblastos haciendo clic con el ratón sobre la zona central del cuerpo celular y mantener el seguimiento del movimiento de la célula hasta el último punto del tiempo-lapso de tiempo que se alcance (por ejemplo, el punto número 61 para una película-hr larga 3) .
  7. Para obtener datos eligen "Make Pieza Medida" en el Menú Medidas (Figura 4B, pasos 6-7). Aparecerá una ventana en el centro de la pantalla.
  8. En esta ventana, seleccione "Un nuevo elemento de medida llamada:" y escriba un nombre (Figura 4C, el paso 8). Recuerde que debe seleccionar la opción "Todos los puntos de tiempo" antes de presser OK (Figura 4C, el paso 9). Un archivo de elemento de medición aparecerá en el archivo de lapso de tiempo y contendrá los parámetros para el análisis cuantitativo (por ejemplo, la distancia de migración, velocidad, desplazamiento y velocidad de desplazamiento).
  9. Haga doble clic en el archivo de elemento de medición para abrir como una ventana (Figura 4D, el paso 10).
  10. Para visualizar las pistas individuales de células analizadas, elegir la opción "Punto de cadenas" de las "de pantalla" Opciones (Figura 4D, paso 11).
  11. Haga clic derecho sobre el archivo de artículos Medición y exportarlo como un archivo de texto, que luego pueden ser importados en programas como Excel para analizar los parámetros de migración.
  12. Para medir los movimientos entre tramas consecutivas y pausas realizadas por cada célula durante el período de rodaje, en el archivo de artículos de Medidas Seleccione entre las opciones "Display" "Point" o "poblaciones" y haga clic en el identificador (cada pista tiene un ID único). Exportar el archivo resultante de procederción, como se explica en el paso 4.10.

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Resultados

Etiquetado de neuroblastos migratorias derivadas de SVZ se puede observar a lo largo de los RMS, generalmente 4-8 días después de una electroporación con éxito (Figura 1B). Puntos de tiempo más largos también pueden ser elegidos, pero menos de células se encuentran en el RMS ya que la mayoría de ellos se han entrado en el OB. Los neuroblastos comienzan a adquirir una morfología típica y las características de las células granulares maduras en el OB de alrededor de 2-3 semanas después de la ...

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Discusión

Eficiente de la migración de células progenitoras neurales a lo largo de los RMS asegura su posterior maduración en neuronas funcionales 10. Corrientes prominentes de progenitores neurales dirigidos hacia el OB son visibles en la infancia humana y es probable que desempeñen un papel importante en el desarrollo del cerebro humano temprano postnatal 27. Por otra parte, estas células son capaces de sitios diana del cerebro afectadas por la lesión y 4,28 neurodegeneración. Ser capaz d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

MS y YZ son apoyados por KCL y KCL-China becas de doctorado. MO fue financiado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Damos las gracias a Masaru Okabe y Jun-ichi Miyazaki para el plásmido PCX-EGFP y Alain Chedotal y Atenea Ypsilanti para consejos valiosos sobre la electroporación.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
MillicellMilliporePICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dishMatTekP35G-0-14-C
Gey's Balanced mediaSigmaG9779-500ML
Glucose, 45%SigmaG8769-100ML
HEPESSigmaH3375-25G
Pen/StrepGIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
B27 supplementInvitrogen Life Technologies17504044
L-GlutamineInvitrogen Life Technologies25030-081
DMEM (phenol red-free)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
Glass capillaries for injectionHarvard Apparatus30-0057
Aspirator tubeSigmaA5177
Sutter P-97 capillary pullerSutter InstrumentP-97
ECM830 Square Wave ElectroporatorHarvard Apparatus45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mmHarvard Apparatus45-0488
Footswitch Model 1250FHarvard Apparatus45-0211
Gel for electrodesCefar Compex6602048
IsofluraneMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomeLeicaVT1000S
GlueRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk systemPerkin ElmerCustomized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity softwarePerkin ElmerAcquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopySolent ScientificCustom-made
Ti-E inverted microscopeNikonCFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

Referencias

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