通过共生荧光标记菌株监测细菌细胞群中的物种内部竞争

摘要

细菌在有生之年可能会积累有害或有益的突变。在积累有益突变的细胞群中，个体可能迅速比其研究员竞争。在这里，我们介绍了一个简单的程序，以可视化物种内部竞争的细菌细胞种群随着时间的推移使用荧光标记的个人。

摘要

许多微生物，如细菌的增殖速度极快，种群可能达到高细胞密度。种群中很小一部分细胞总是积累的突变，这些突变对细胞有害或有益。如果突变的健身效应为亚人口提供了强大的选择性生长优势，这种亚种群的个体可能会迅速竞争，甚至完全消除其直接研究员。因此，小的基因变化和获得有益突变的细胞的选择驱动积累可能导致细胞种群的基因型完全改变。在这里，我们提出了一个程序，监测快速克隆扩张和消除有益和有害的突变，分别在细菌细胞群随着时间的推移，通过共生荧光标记个体的Gram阳性模型杆菌 亚蒂利斯。该方法易于执行，非常能说明细菌细胞群中个体之间的物种间竞争。

引言

土壤细菌通常具有灵活的调控网络和广泛的代谢能力。这两个特征使细胞能够调整其催化物和合成代谢途径，以与研究员和其他微生物竞争营养物质，这些营养物质在给定的生态利基¹中可用。然而，如果细菌不能适应其环境，其他机制可能决定一个物种的生存。事实上，由于许多细菌迅速增殖，种群可以达到高细胞密度亚种群，可能自发地积累了有益的突变，为细胞提供了选择性的生长优势，从而增加了细胞的适应能力。此外，突变热点和压力引起的适应性突变可以促进一种不适应细菌^2，3的进化。因此，在连续选择下突变的积累和生长是巨大的微生物多样性的起源，即使在同一属^4，5。与自然界一样，由于在选择下不断培养，细菌基因组的形成也会在实验室中发生。Gram阳性细菌B.亚提利的驯化就是例证，该细菌在全世界用于基础研究和工业。在20世纪40年代，B.亚提利斯接受了DNA损伤X射线治疗，随后在特定的生长条件下进行了培养^。细菌在驯化过程中积累的突变导致许多生长特征的丧失，即B.亚提利实验室菌株168丧失了形成复杂菌落^{的能力7，8。}

如今，对于研究最好的大肠杆菌和B.亚提利菌模型，各种强大的工具可用于基因操纵其基因组，以解决特定的科学问题。有时，兴趣基因的失活会导致严重的生长缺陷，然后在标准生长介质⁹上清晰可见。相比之下，导致生长缺陷微弱，从而只轻微影响菌株适应的突变往往被忽视。然而，在这两种情况下，长期潜伏和传递的突变菌株几代人通常会导致抑制突变体的积累，已经恢复了表型的父菌^株2，9。抑制突变体的特征和突变的识别，已经恢复了母突变株的生长缺陷是一个非常有用的方法，允许阐明重要和往往新颖的细胞过程^10，11。

我们有兴趣控制谷氨酸平衡在B.亚提利斯^12。与大肠杆菌类似，B. 亚提利通过抑制突变体的积累对谷氨酸平衡（即谷氨酸降解²中的块）的扰动做出反应。这些自发突变获得的抑制突变体的基因组变化被证明可以迅速恢复谷氨酸平衡^9，13。因此，在细菌驯化过程中，B.亚提利适应特定生长状况，反映在酶合成和进化的酶活性中，这不足为奇，这些活动涉及谷氨酸代谢^12。有人提出，在驯化过程中生长介质中缺乏外源性谷氨酸，是实验室菌株168^2，14中神秘谷氨酸脱氢酶（GDH）gudB ^CR基因出现和固定的驱动力。这一假设得到我们观察的支持，即实验室菌株中GDH活性的减少为细菌提供了选择性生长优势，而外源性谷氨酸是稀缺^的2。此外，在没有外源性谷氨酸的情况下，培育B.亚提利菌株，合成GDH GudB，导致抑制突变体的积累，这些突变体已经灭活了gadB基因^2。显然，阴性活性GDH的存在对细胞不利，因为内源性产生的谷氨酸，否则可用于合成，会降解为铵和2-牛油酸盐（图1）。相比之下，当谷氨酸由介质提供时，配备高级 GDH 活性的B. 亚提利菌株比只合成一种功能性 GDH 的菌株具有选择性生长优势。有理由假设，高GDH活性允许细菌利用谷氨酸作为第二碳源，除了介质²提供的其他碳源（见图1）。因此，GDH 活性强烈地影响细菌的健身，具体取决于外源性谷氨酸的供应情况。

在这里，我们提出了一个非常说明性的方法来监测和可视化两个 B.亚蒂利斯 菌株之间的物种间竞争，在染色体上的单个轨迹不同（图2）。这两种菌株被标记为编码氟磷YFP和CFP的 yfp 和cfp的yfp和 cfp 基因，并在不同的营养条件下共同培养。通过随着时间的推移采样，并通过在阿加板块上电镀适当的稀释，每个培养物中的幸存者可以使用常见的立体荧光显微镜轻松监测。本文描述的程序是容易执行和适合可视化快速克隆扩张和消除有益和有害的突变，分别在细胞群随着时间的推移。

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研究方案

1. 准备阿加板块、文化媒体、冷冻库和前文化

1. 准备生长介质和所需的试剂（参见材料和试剂表）。
2. 条纹B.亚提利菌株（例如BP40 （罗克格⁺ 古德布^CR amyE：:P_古德布- yfp）和 BP52 （罗克格⁺ 古德布⁺ 艾米： :P_古德布- cfp）分别表示一个和两个活跃的 Gdhs）^2，将用于 SP 中等 agar 板的竞争实验， 以获得单一菌落。在 37 °C 处连夜孵化板。
3. 以单个菌落和接种无菌培养管，含有4毫升LB液体介质。在 28 °C 和 220 rpm 的夜间生长细菌。
4. 在 28 °C 的夜间培养中生长，以避免细胞裂解或孢子。
5. 使用标准光谱仪测量波长为 600 nm （OD_600）的培养物的光学密度。
6. 如果培养物已达到 OD₆₀₀ 的 2.0，将 0.75 毫升培养物与 1.5 毫升反应管中的无菌 50% 甘油溶液混合 0.75 毫升。最终的OD₆₀₀ 应该是1.0，以获得含有约10⁸ 个细胞/毫升的低温素。
7. 将管子存放在-80°C。
8. 对标有 cfp 和 yfp 编码氟化基因的每个菌株进行三种预培养。接种预培养（含有4毫升LB液体介质的无菌培养管）与1个μl细胞从-80°C低温库存。在 28 °C 和 220 rpm 的夜间孵化文化。

2. 细菌共生、样品收集和样品储存

1. 新鲜准备 100 毫升 C-Glc 和 CE-Glc 最小介质（参见试剂和材料表），并将每个介质的 20 毫升转移到无菌 100 毫升摇动烧瓶中。
2. 以一夜之间生长的 0.1 毫升预栽培为例，用 1.5 毫升的 1.5 毫升小面包中 0.9 毫升 LB 介质稀释它们，并确定 OD₆₀₀。
3. 对于竞争实验，采取_1.0-1.5 之间具有类似OD 600的不同菌株的预培养。
4. 为了获得混合细胞群，稀释具有适当OD₆₀₀ 的预培养细胞到20毫升C-Glc和CE-Glc中以100毫升摇瓶补充的0.05的OD_600。 对于比赛实验，两个菌株应以1：1的比例混合。
5. 从烧瓶中取出 10 毫升样品，将其转移到 15 毫升塑料管中，在标准桌面离心机中通过离心机在 4，000 x g 中通过离心机采集细胞 10 分钟，然后丢弃超自然物。
6. 将细胞以0.5毫升新鲜的LB介质中补充，并将细胞转移到无菌的1.5毫升反应杯中。加入 0.5 毫升 50% 无菌甘油，通过严格的涡流混合悬浮，并将样品存放在 -80 °C 冰柜中，直到进一步治疗。
7. 在 37 °C 和 220 rpm 时，将留在摇动烧瓶中的细胞孵化长达 24 小时。将摇瓶放在黑暗中，以防止荧光片的照片漂白。
8. 在 7 小时和 24 小时的生长后，进一步采集 0.1 毫升的样本。测量并注意样品的1：10 稀释的 OD 600（C-Glc 或 CE-Glc 最小介质）。
9. 从每个培养物中取出适量的细胞，使低温素具有 OD₆₀₀ 的 1.0。将样品储存在-80°C，直到进一步治疗。

3. 定量分析的样品处理、电镀和孵化

1. 收集完所有样品后，解冻冷冻库，并在0.9%的盐溶液（见试剂和材料表）中稀释细胞，至多^10-3。
2. SP中等胶板上^10-3 稀释的板0.1毫升，使用无菌玻璃移液器分配细胞。
3. 在黑暗中以 37 °C 的夜间孵化板，直到出现单个菌落。

4. 通过立体荧光显微镜计算幸存者进行定量分析

1. 用黑色笔将阿加板底部分成四部分，以便更好地定位，同时在立体荧光显微镜下计算幸存者。
2. 将板倒置在显微镜下，并使用冷光源将菌落聚焦。
3. 一旦菌落聚焦，切换到相应的过滤器集 CFP，以可视化 cfp标记菌株的幸存细胞。用笔给殖民地贴上标签并注明数字，来计算这种菌株的幸存者。
4. 用乙醇去除标签，切换到YFP过滤器集，以可视化 yfp标记菌株的幸存细胞。再次计算幸存者，用笔给殖民地贴上标签并注明数字。

5. 半量子分析的样品处理和显微镜

1. 对于说明性数字，在 SP agar 板上从步骤 3.1 中发现 10^-4稀释（约 100 个细胞）中的 10 μl（见图 3）。
2. 在黑暗中以 37 °C 的夜间孵化板，直到出现单个菌落。
3. 将无盖的培养皿放在显微镜下，并使用冷光源将点聚焦。
4. 拍摄斑点的照片，以图示数字。选择适当的曝光时间，用冷光源拍摄殖民地的照片。
5. 无需移动板，请更改为 CFP 滤镜集，调整曝光时间并拍照。使用 YFP 过滤器设置进行相同的处理，并将图片保存以供进一步分析。

6. 数据分析

1. 使用 Excel 等软件进行定量数据分析。根据计算的殖民地，计算黄殖民地和蓝殖民地占整个殖民地数的百分比，该殖民地的百分比设定为100%。
2. 使用计算的数字创建堆叠条图（参见 图 4 和图 5）。使用 Adobe 照片商店等图像处理程序构建从不同地点拍摄的照片的合并图片。或者，可从 http://rsbweb.nih.gov/ij/ 下载的免费软件 ImageJ 可用于图像处理。
3. 打开使用 CFP 过滤器集和 YFP 过滤器集拍摄的单个位置的图片。优化对比度和亮度，以减少来自媒体的任何背景荧光。
4. 转到其中一张图片并选择所有图片。复制图片并粘贴到另一张图片上。
5. 要么使用功能"颜色闪避"合并图片，要么使用通道选项卡覆盖荧光图片。来自不同媒体和不同时间点的殖民地合并图片代表了液体文化中不同菌株的生长。

7. 具体提示：染料开关实验和同源菌株的培养，标有 cfp 和 yfp

B.亚提利中两个氟编码基因中任何一个的表达可能会影响细菌的生长速度。因此，建议进行以下实验，以排除在培养过程中从细胞群中消除一个竞争对手菌株只是由于氟磷的负面影响：

1. 重复整个实验并共生反标记的菌株（例如，较早 的 cfp标记菌株现在标记为 yfp 基因， 反之亦然）。虽然相反，但获得的结果应与先前的观察结果相媲美，即一种菌株比另一株具有选择性生长优势。
2. 重复整个实验，并共同培育标有yfp和cfp的同源菌株 （例如BP40（rocG⁺ gudB^CR amyE：:P_古德布- yfp）和 BP41 （罗克格⁺ 古德布^CR 艾米： :P_古德布- cfp））。通过跟踪细胞种群的组成，估计两种氟磷中的任何一种对细菌的适应力的负面影响。

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结果

此处描述的方法成功地应用于可视化由 B. 亚蒂利斯 菌株组成的细胞群中的物种内部竞争，这些菌株分别标有编码荧光CFP和YFP的 cfp 和 yfp 基因。如 图3所示，该方法可用于以非常说明性的方式可视化物种内部竞争。通过在小区域发现样本，细胞群的克隆组成一目了然。虽然不适合定量分析，但这种方法有助于粗略估计不同生长参数（即氮源）对细胞群发育的...

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讨论

已经开发了几种方法来分析细菌¹⁶的竞争性健康。在许多情况下，细菌被标记为不同的抗生素耐药性盒^17。与我们的方法类似，用抗生素耐药盒标记细胞可以评估在规定的生长条件下共生过程中细菌的竞争性健康。此外，这种方法可用于确定¹⁷号染色体上特定轨迹中彼此不同的细胞的竞争性适应性。然而，使用抗生素耐药盒来监测竞技体能存在一些缺点。由于耐药基因的表?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)