형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

요약

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

초록

박테리아와 같은 많은 미생물은 매우 빠르게 증식하고 인구는 높은 세포 밀도에 도달 할 수 있습니다. 인구에 있는 세포의 작은 분수는 항상 세포에 해를 끼치거나 유익한 돌연변이를 축적했습니다. 돌연변이의 체력 효과가 강한 선택적 성장 이점을 가진 하위 인구를 제공하는 경우에, 이 하위 인구의 개별은 급속하게 경쟁하고 그들의 즉각적인 동료를 완전히 제거할 수 있습니다. 따라서, 유익한 돌연변이를 획득한 세포의 작은 유전적 변화 및 선택 중심축적은 세포 집단의 유전자형의 완전한 변화로 이어질 수 있다. 여기서 우리는 그람 양성 모델 박테리아 부틸리스의형광 표시 개인의 공동 재배에 의해 시간이 지남에 따라 세균 세포 인구에서 각각 유익하고 해로운 돌연변이의 급속한 클로날 팽창 및 제거를 모니터링하는 절차를 제시한다. 이 방법은 세균 세포 집단의 개인 들 간의 종 내 경쟁을 표시하는 것이 쉽고 매우 예시적입니다.

서문

토양 박테리아는 일반적으로 유연한 규제 네트워크와 광범위한 신진 대사 용량을 부여합니다. 두 가지 기능을 모두 사용하면 세포가 쌍백과 단백 동화 경로를 조정하여 주어진 생태 틈새 시장^1에서사용할 수있는 영양소를 위해 동료 및 기타 미생물과 경쟁 할 수 있습니다. 그러나, 박테리아가 그들의 환경에 적응할 수 없는 경우에 그밖 기계장치는 종의 생존을 설명할 수 있습니다. 실제로, 많은 박테리아가 빠르게 증식하고 인구가 높은 세포 밀도에 도달할 수 있기 때문에 인구 하위 인구는 선택적 성장 이점을 가진 세포를 제공하고 그러므로 그들의 적정성을 증가시키는 유익한 돌연변이를 자발적으로 축적할 수 있습니다. 더욱이, 돌연변이 핫스팟 및 스트레스 유발 적응 돌연변이 발생은 부적응된 박테리아^2,3의진화를 용이하게 할 수 있다. 따라서, 연속선택 하에서 돌연변이와 성장의 축적은 동일한^4,5세내에서도 엄청난 미생물 다양성의 기원이다. 자연에서와 마찬가지로, 세균 게놈의 형성은 또한 선택하에 지속적인 재배 때문에 실험실에서 발생합니다. 이것은 기본 연구 및 산업에서 전 세계적으로 사용되는 그람 양성 박테리아 B. subtilis의 길들여지는 것으로 예시됩니다. 1940년대에 B. 서브틸리스는 DNA 손상 엑스레이로 처리되었고, 그 다음에는 특정 성장 조건 하에서 재배하였다^6. 이들의 가축화 과정에서 축적된 돌연변이는 많은 성장 특성의 상실을 차지하고, 즉 B. 서브틸리스 실험실 균주(168)는 복잡한 식민지를 형성하는 능력을^{상실하였다 7,8.}

요즘, 가장 잘 연구 된 모델 박테리아 Escherichia 대장균과 B. subtilis에대 한, 다양 한 강력한 도구는 유전 특정 과학적 질문을 해결 하기 위해 그들의 게놈을 조작하는 사용할 수 있습니다. 때때로 관심 유전자의 불활성화는 심각한 성장 결함을 일으키는 원인이 되고, 그 때 표준 성장 매체^9에서명확하게 보입니다. 대조적으로, 약한 성장 결함을 일으키는 원인이 되고 이렇게 약간 만 긴장의 적각에 약간 영향을 미치는 돌연변이는 수시로 무시됩니다. 그러나, 두 경우 모두 여러 세대에 대한 돌연변이 균주의 장기간 인큐베이션 및 패시징은 일반적으로 부모 균주^2,9의표현형을 복원한 억제제 돌연변이체의 축적을 초래한다. 억제제 돌연변이의 특성화 및 부모 돌연변이 균주의 성장 결함을 복원한 돌연변이의 식별은 중요하고 종종 새로운 세포 과정의 명분보정을 허용하는 매우 유용한^{접근법이다 10,11.}

우리는 B. subtilis^12에서글루타민성 항상성의 제어에 관심이 있습니다. 대장균과유사하게, B. 서브틸리스는 억제제 돌연변이의 축적에 의해 글루타민트 항상성(즉, 글루타민제 분해^2의블록)의 변투에 반응한다. 자발적인 돌연변이에 의해 획득한 이들 억제돌연변이의 게놈 변화는 글루타민트 항상성을 급속히 회복시키는 것으로 나타났다^9,13. 따라서, 박테리아의 국산 후 특정 성장 상태에 B. 아틸리스의 적응이 효소 합성및 조미료 대사에 관여하는 진화된 효소 활동에서 미러링된다는 것은 놀라운 일이^{아니다.12.} 국내화 과정에서 성장 배지에서 외인성 글루타민의 부재가 실험실 균주 168^2,14에서비밀글루타민제 탈수소효소(GDH) gudB^CR 유전자의 출현 및 고정을 위한 원동력이 되었다는 것이 시사되고 있다. 이러한 가설은 실험실 균주에서 의한 GDH 활성의 감소된 양이 외인성 글루타민산염이 부족할 때 선택적 성장 이점을 박테리아에 제공한다는 우리의 관측에 의해 지원된다^2. 더욱이, B. subtilis 균주의 재배, GDH GudB를 합성, 외인성 글루타민의 부재시 gudB 유전자^2를불활성화한 억제제 돌연변이의 축적을 초래한다. 명백하게, 이화 활성 GDH의 존재는 비물질에 사용될 수 있는 내인성 생산 글루타민산염이 암모늄및 2-oxoglutaraterate(도1)로저하되기 때문에 세포에 불리하다. 대조적으로, 글루타민이 매체에 의해 제공될 때, 높은 수준의 GDH 활성을 갖춘 B. 서브틸리스 균주는 하나의 기능성 GDH만 합성하는 균주에 비해 선택적 성장 우위를 가지게 한다. 높은 수준의 GDH 활성이 박테리아가 중간^2에서 제공하는 다른 탄소 공급원 이외에 글루타민을 제2 탄소 원으로 활용할 수 있다고 가정하는 것이 합리적이다(도 1참조). 따라서, GDH 활동은 외인성 글루타민산염의 가용성에 따라 박테리아의 적합성에 강하게 영향을 미친다.

여기서 우리는 염색체에 단일 궤적(도 2)에서다른 두 B. 아틸리스 균주 사이의 종 내 경쟁을 모니터링하고 시각화하는 매우 예시적인 방법을 제시한다. 두 균주는 형광YFP와 CFP를 인코딩yfp 및 cfp 유전자로 표시하고, 다른 영양 조건하에서 cocultivate. 시간이 지남에 따라 샘플링하고 각 배양소의 생존자는 일반적인 스테레오 형광 현미경을 사용하여 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 본 논문에 기재된 절차는 시간이 지남에 따라 세포 집단에서 각각 유익하고 해로운 돌연변이의 급속한 클로날 팽창 및 제거를 시각화하기 쉽고 적합합니다.

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프로토콜

1. 한천 접시, 문화 매체, 극저온, 프리컬쳐 준비

1. 성장 매체와 필요한 시약을 준비합니다(재료 및 시약 표 참조).
2. B. 서브틸리스 균주(예:. BP40(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)및 BP52(rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp)각각 1개와 2개의 활성 GDHs를 발현)^2는 SP 중간 식도 플레이트에 대한 경쟁 실험에서 단일 콜로니를 얻을 수 있다. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 단일 콜로니를 가지고 4 ml LB 액체 매체를 포함하는 무균 배양 튜브를 접종하십시오. 28°C와 220 rpm에서 하룻밤 사이에 박테리아를 성장시다.
4. 세포가 lyse 또는 산발적으로 피하기 위해 28 °C에서 하룻밤 배양을 성장시다.
5. 표준 분광계를 사용하여 600nm(OD_600)의파장에서 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.
6. 배양이 2.0의 OD_600에 도달하면 배양의 0.75 ml를 멸균 50% 글리세롤 용액과 혼합하여 1.5ml 반응 튜브에 섞는다. 최종 OD_600은 약 10⁸ 세포 /ml를 포함하는 냉동 주를 얻기 위해 1.0이어야한다.
7. 튜브를 -80°C에 저장합니다.
8. 형광소 유전자를 인코딩하는 cfp 및 yfp로 표지된 각 균주의 3가지 사전 배양을 만듭니다. -80°C 극저온스톡으로부터 1μl 세포로 프리컬쳐(4ml LB 액상 배지를 함유한 멸균 배양 튜브)를 접종한다. 28°C와 220 rpm에서 하룻밤 동안 배양배합니다.

2. 박테리아의 공동, 샘플 수집 및 샘플 저장

1. 갓 100ml C-Glc 및 CE-Glc 최소 배지(시약 및 재료 표 참조)를 준비하고 각 배지의 20ml를 멸균 100ml 쉐이크 플라스크로 옮기습니다.
2. 하룻밤 사이에 재배된 배양 전 배양물의 0.1 ml를 1.5ml 의 큐벳에 0.9 ml LB 배지로 희석하고 OD_600을결정한다.
3. 경쟁 실험을 위해, 1.0-1.5 사이의 유사한 OD_600을 가진 다른 균주의 그 사전 문화를 취하십시오.
4. 혼합 세포 집단을 얻기 위해, 적절한 OD_{600을 20ml} C-Glc 및 CE-Glc 최소 배지에서 0.05의 OD 600으로 적절한 OD_600을 가진 프리컬쳐의 세포를 100ml 쉐이크 플라스크로 보충하였다. 경쟁 실험을 위해 두 균주는 1:1 비율로 혼합되어야합니다.
5. 플라스크에서 10ml 샘플을 가져 와서 15 ml 플라스틱 튜브로 옮기고 표준 테이블 상단 원심 분리기에서 4,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리로 세포를 수확하고 상퍼를 폐기하십시오.
6. 0.5 ml 신선한 LB 배지에서 세포를 다시 중단하고 세포를 멸균 1.5 ml 반응 컵으로 옮기습니다. 멸균 글리세롤 50% 0.5 ml를 넣고, 엄격한 소용돌이에 의해 현탁액을 혼합하고, 추가 처리될 때까지 -80°C 냉동고에 샘플을 보관한다.
7. 37°C 및 220 rpm에서 최대 24시간 동안 쉐이크 플라스크에 남아 있는 세포를 배양한다. 형광의 사진 표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 쉐이크 플라스크를 유지합니다.
8. 7 시간 및 24 시간 성장 후 0.1 ml의 추가 샘플을 가져 가라. 샘플의 1:10 희석(C-Glc 또는 CE-Glc 최소 배지)의 OD_600을 측정하고 유의하십시오.
9. 각 배양에서 적정량의 세포를 섭취하여 1.0의 OD_600을 갖는 극저온을 만듭니다. 추가 처리될 때까지 샘플을 -80°C에 저장합니다.

3. 정량 분석을 위한 샘플 처리, 도금 및 인큐베이션

1. 모든 샘플을 수집한 후, 냉동주를 해동하고, 세포를 0.9% 식염수 용액(시약 및 재료 표 참조)에서 최대^10-3으로희석한다.
2. SP 중간 식기 판에^10-3 희석의 플레이트 0.1 ml를 멸균 유리 파이펫을 사용하여 세포를 분배한다.
3. 단일 식민지가 나타나기 전까지 어둠 속에서 밤새 플레이트를 37 °C에서 배양하십시오.

4. 정량 분석을 위한 스테레오 형광 현미경 검사법에 의한 생존자 계산

1. 스테레오 형광 현미경의 생존자를 계산하는 동안 더 나은 방향을 위해 네 부분으로 검은 펜으로 한천 판의 바닥을 분할합니다.
2. 접시를 현미경 아래에 거꾸로 놓고 콜드 라이트 소스를 사용하여 식민지를 초점으로 가져옵니다.
3. 콜로니가 초점을 맞추고 나면 CFP에 대한 적절한 필터 세트로 전환하여 cfp-labeled균주의 생존 셀을 시각화합니다. 이 균주의 생존자를 펜으로 표지하여 계산하고 숫자를 기록합니다.
4. 에탄올로 라벨을 제거하고 YFP필터 세트로 전환하여 yfp-labeled 스트레인의 생존 셀을 시각화합니다. 콜론에 펜으로 라벨을 붙여 생존자를 다시 계산하고 숫자를 기록합니다.

5. 반정량 분석을 위한 샘플 처리 및 현미경 검사법

1. 예시적인 수치의 경우, SP 한천 판에서 3.1단계에서^10-4 희석(약 100셀)의 10μl을 반점한다(그림 3참조).
2. 단일 식민지가 나타나기 전까지 어둠 속에서 밤새 플레이트를 37 °C에서 배양하십시오.
3. 페트리 접시를 현미경 아래에 뚜껑없이 놓고 차가운 광원을 사용하여 그 자리를 집중시하십시오.
4. 일러스트레이션 인물을 위해 반점 사진을 찍어보세요. 차가운 광원으로 식민지의 사진을 찍기위한 적절한 노출 시간을 선택하십시오.
5. 플레이트를 이동하지 않고 CFP 필터 세트로 변경하고 노출 시간을 조정하고 사진을 찍습니다. YFP 필터 세트와 동일한 작업을 수행하 고 추가 분석을 위해 사진을 저장 합니다.

6. 데이터 분석

1. 정량적 데이터 분석에 Excel과 같은 소프트웨어를 사용합니다. 계산된 식민지에 따라, 100%로 설정된 식민지의 전체 수에 대하여 노란색과 파란색 식민지의 백분율을 계산합니다.
2. 계산된 숫자를 사용하여 누적된 막대 다이어그램을 만듭니다(그림 4 및 그림 5참조). Adobe Photoshop과 같은 이미지 처리 프로그램을 사용하여 다른 지점에서 찍은 사진의 병합된 사진을 생성합니다. 또는 http://rsbweb.nih.gov/ij/ 다운로드가능한 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 ImageJ를 이미지 프로세싱에 사용할 수 있습니다.
3. CFP 필터 세트와 YFP 필터 세트로 촬영한 한 지점에서 사진을 엽니다. 콘트라스트와 밝기를 최적화하여 미디어의 배경 형광을 줄입니다.
4. 사진 중 하나로 이동하여 모든 것을 선택합니다. 그림을 복사하여 다른 그림에 붙여 넣습니다.
5. 함수 "색상 회피"를 사용하여 사진을 병합하거나 채널 탭을 사용하여 형광 사진을 오버레이합니다. 다른 매체와 다른 시간 지점에서 식민지의 병합 된 사진은 액체 문화 내에서 다른 균주의 성장을 나타냅니다.

7. 특정 팁: 염료 스위치 실험 및 cfp 및 yfp로 표시 된 동종 균주의 공동

B. 서브틸리스에 있는 2개의 불소-인코딩 유전자의 표정은 적합그리고 따라서 박테리아의 성장 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 재배 중 세포 집단으로부터 하나의 경쟁자 균주를 제거하는 것은 단순히 플루오로포어의 부정적인 효과로 인한 것을 배제하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하는 것이 좋습니다.

1. 전체 실험을 반복하고 반비례표시균(예를들어, 이전 cfp-표지된균주는 이제 yfp 유전자로 표지되고 그 반대의 경우도마찬가지입니다). 비록 반전, 얻은 결과 한 변형 다른 변형에 비해 선택적 성장 이점을 가지고 이전 관측에 필적 해야.
2. yfp 및 cfp(예를 들어 BP40)와 cfp(예를 들어, BP40+gudB CR amyE::P_gudB-yfp)및 BP41(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)로표시된 전체 실험 및 공동 재배 이소생균균을 반복한다. 시간이 지남에 따라 세포 집단의 조성에 따라 박테리아의 적합성에 대한 두 형광중 하나의 부정적인 효과를 추정한다.

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결과

여기서 설명된 방법은 각각 형광경 CFP와 YFP를 인코딩하는 cfp 및 yfp 유전자로 표지된 B. 서브틸리스 균주로 구성된 세포 집단에서 종 내 경쟁을 시각화하기 위해 성공적으로 적용되었다. 도 3에도시된 바와 같이, 이 방법은 매우 예시적인 방식으로 종내 경쟁을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 작은 부위에 샘플을 발견함으로써 세포 집단의 복제 구성을 한눈에 볼 수 ...

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토론

박테리아^16의경쟁력있는 적합성을 분석하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 많은 경우에 박테리아는 다른 항생 저항 카세트^17로표지되었습니다. 우리의 접근 방식과 유사하게, 항생제 저항 카세트를 가진 세포의 라벨링은 정의된 성장 조건하에서 박테리아의 경쟁적 적합성의 평가를 허용합니다. 더욱이, 이 방법은^{염색체(17)에}특정 궤적에서 서로 다른 세포의 경쟁?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)