Мониторинг внутривидовой конкуренции в бактериальной популяции клеток путем кокултивации флуоресцентно маркированных штаммов

Резюме

Бактерии могут накапливаться либо вредные или полезные мутации в течение своей жизни. В популяции клеток особи, накопившие полезные мутации, могут быстро переутомиться со своими собратьями. Здесь мы представляем простую процедуру визуализации внутривидовой конкуренции в популяции бактериальных клеток с течением времени с использованием флуоресцентно помечены лиц.

Аннотация

Многие микроорганизмы, такие как бактерии размножаются очень быстро, и популяции могут достигать высокой плотности клеток. Небольшие фракции клеток в популяции всегда имеют накопленные мутации, которые являются либо вредными или полезными для клетки. Если фитнес-эффект мутации обеспечивает субпопуляцию с сильным селективным преимуществом роста, люди этой субпопуляции могут быстро переутомляться и даже полностью устранить своих непосредственных собратьев. Таким образом, небольшие генетические изменения и отборное накопление клеток, которые приобрели полезные мутации, могут привести к полному сдвигу генотипа клеточной популяции. Здесь мы представляем процедуру мониторинга быстрого клонального расширения и устранения полезных и вредных мутаций, соответственно, в популяции бактериальных клеток с течением времени путем кокултивации флуоресцентно помеченных особей грамположительных моделей бактерий Bacillus subtilis. Метод прост в работе и очень иллюстративно для отображения внутривидовой конкуренции между лицами в популяции бактериальных клеток.

Введение

Почвенные бактерии, как правило, наделены гибкими регулирующими сетями и широкими метаболическими возможностями. Обе функции позволяют клеткам регулировать свои катаболические и анаболические пути, чтобы конкурировать со своими собратьями и другими микроорганизмами для питательных веществ, которые доступны в данной экологической^{нише 1}. Однако, если бактерии не в состоянии адаптироваться к окружающей среде другие механизмы могут объяснить выживание вида. Действительно, так как многие бактерии размножаются быстро и популяции могут достигать высокой плотности клеток субпопуляции, возможно, спонтанно накопленных полезных мутаций, которые обеспечивают клетки с селективным преимуществом роста и, следовательно, увеличить их пригодность. Кроме того, мутационные горячие точки и вызванный стрессом адаптивный мутагенез могут способствовать эволюции неадаптированных^{бактерий 2,3.} Таким образом, накопление мутаций и рост при непрерывном отборе является источником огромного микробного разнообразия, даже в пределах одного^{и того же рода 4,5.} Как и в природе, формирование бактериальных геномов также происходит в лаборатории из-за непрерывного культивирования под отбором. Об этом свидетельствует одомашнивания грамположительных бактерий B. subtilis, которая используется во всем мире в фундаментальных исследованиях и промышленности. В 1940-х годах B. subtilis был обработан ДНК-повреждающих рентгеновских лучей с последующим культивированием при определенном^{состоянии роста 6}. Мутации, которые накопились в бактериях во время их одомашнивания, обустраивания составляют потерю многих характеристик роста, т.е. лабораторный штамм B. subtilis 168 потерял способность формировать сложные^{колонии 7,8.}

В настоящее время для наиболее изученных моделей бактерий Escherichia coli и B. subtilis,различные мощные инструменты доступны для генетического манипулирования их геномами для решения конкретных научных вопросов. Иногда инактивация гена интереса вызывает серьезный дефект роста, который затем хорошо виден на стандартной среде роста^9. В отличие от этого, мутации, которые вызывают слабый дефект роста и, таким образом, лишь незначительно влияют на пригодность штамма часто игнорируются. Однако в обоих случаях длительная инкубация и пролет мутантных штаммов в течение нескольких поколений обычно приводят к накоплению мутантов-супрессоров, которые восстановили фенотип родительского^{штамма 2,9.} Характеристика мутантов-супрессоров и выявление мутаций, которые восстановили дефект роста родительского мутантного штамма, является очень полезным подходом, который позволяет прояснить важные и часто новые клеточные^{процессы 10,11}.

Мы заинтересованы в контроле глютамата гомеостаза в B. subtilis¹². Как и к кишечной палочке, B. subtilis реагирует на возмущение глютамата гомеостаза(т.е.блок^{в деградации глутамата 2}) путем накопления мутантов-супрессоров. Геномные изменения в этих мутантов супрессора, которые были приобретены спонтанной мутации было показано, быстро восстановить глютамат гомеостаз^9,13. Поэтому неудивительно, что адаптация B. subtilis к определенному состоянию роста во время одомашнивания бактерии отражается в синтезе ферментов и в развитых ферментных действиях, которые участвуют в метаболизме глутамата¹². Было высказано предположение, что отсутствие экзогенного глутамата в среде роста в процессе одомашнивания было движущей силой для появления и фиксации загадочного дегидрогеназы глутамата (GDH) gudB^{CR гена} в лабораторном штамме 168^2,14. Эта гипотеза подтверждается нашим наблюдением, что снижение количества активности GDH в лабораторном штамме обеспечивает бактериям селективное преимущество роста, когда экзогенный глутамат^{дефицитен 2}. Кроме того, культивирование штамма B. subtilis, синтезируя GDH GudB, при отсутствии экзогенного глутамата приводит к накоплению мутантов-супрессоров, которые инактивировали ген gudB ^2. Очевидно, что наличие катаболически активного GDH невыгодно для клетки, потому что эндогенно производства глутамата, которые могли бы быть использованы для анаболизма деградирует до аммония и 2-оксоглутарат (Рисунок 1). В отличие от этого, когда глутамат обеспечивается средой, штамм B. subtilis, оснащенный высокоуровневой активностью GDH, имеет избирательное преимущество роста по сравнению с штаммом, который синтезирует только один функциональный GDH. Разумно предположить, что активность ГДГ высокого уровня позволяет бактериям использовать глутамат в качестве второго источника углерода в дополнение к другим источникам углерода, предоставляемым^{средой 2 (см.} рисунок 1). Таким образом, активность ГДГ сильно влияет на пригодность бактерий, в зависимости от наличия экзогенного глутамата.

Здесь мы представляем очень иллюстративный метод мониторинга и визуализации внутривидовой конкуренции между двумя штаммами B. subtilis, которые отличаются одним локусом нахромосоме (рисунок 2). Эти два штамма были помечены генами yfp и cfp, кодирующих фторфоры YFP и CFP, и сокультивированы в различных условиях питания. Путем выборки с течением времени и путем покрытия соответствующих разбавлений на агарных пластинах выживших в каждой из культур можно было бы легко контролировать с помощью общего стерео флуоресценции микроскопа. Процедура, описанная в настоящем документе, проста в работе и подходит для визуализации быстрого расширения клонов и устранения полезных и вредных мутаций, соответственно, в популяции клеток с течением времени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Агар плиты, культуры СМИ, Cryostocks, и прекультуры

1. Подготовка средств роста и необходимых реагентов (см. таблицу материалов и реагентов).
2. Полоса штаммов B. subtilis (например. BP40 (rocG^- gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) и BP52(rocG - gudB - amyE::P_gudB-cfp), выражающий один и два активных GDH, соответственно)^{2, которые будут} использоваться в конкурсе эксперимента на средних агарных пластинах SP, чтобы получить одиночные колонии. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
3. Возьмите одиночные колонии и привить стерильные трубки культуры, содержащие 4 мл жидкой среды LB. Выращиваем бактерии на ночь при 28 градусах Цельсия и 220 об/мин.
4. Выращивайте ночные культуры при 28 градусах Цельсия, чтобы избежать, чтобы клетки лизали или спорулируют.
5. Измерьте оптическую плотность культур на длине волны 600 нм (OD₆₀₀) с помощью стандартного спектрофотометра.
6. Если культуры достигли OD₆₀₀ из 2.0, смешайте 0,75 мл культур с 0,75 мл стерильного 50% глицеролового раствора в 1,5 мл реакционной трубки. Окончательный OD_{600 должен} быть 1.0 для получения криостоков, содержащих около 10⁸ клеток/мл.
7. Храните трубки при -80 градусов по Цельсию.
8. Сделайте три прекультуры каждого штамма помечены cfp и yfp кодирования флюорофор генов. Прививать прекультуры (стерильные трубки культуры, содержащие 4 мл ЛБ жидкой среды) с 1 клеток мкл от -80 градусов по Цельсию криостоков. Инкубировать культуры на ночь при 28 градусов по Цельсию и 220 об / мин.

2. Кокултивация бактерий, сбор образцов и хранение образцов

1. Свежеприготовь 100 мл C-Glc и CE-Glc минимальной среды (см. таблицу реагентов и материалов), и передать 20 мл каждой среды в стерильные 100 мл встряхнуть колбы.
2. Возьмите 0,1 мл прекультур, которые были выращены на ночь, разбавить их 0,9 мл ЛБ среды в 1,5 мл кюветт, и определить OD₆₀₀.
3. Для конкурсного эксперимента возьмем те предкультуры различных штаммов, которые имеют аналогичный OD₆₀₀ между 1.0-1.5.
4. Чтобы получить смешанные популяции клеток, разбавить клетки прескультур, которые имели соответствующие OD₆₀₀ к OD₆₀₀ из 0,05 в 20 мл C-Glc и CE-Glc минимальной среде дополняется в 100 мл встряхнуть колбы. Для конкурсных экспериментов два штамма должны быть смешаны в соотношении 1:1.
5. Возьмите 10 мл образцов из колб, перенесите их на 15 мл пластиковых трубок, соуродайте клетки центрифугой в течение 10 минут при 4000 х г в стандартной центрифуге столешного верха и отбросьте супернатант.
6. Переусердуй клетки в 0,5 мл свежей среды LB, и передать клетки стерильной 1,5 мл реакции чашки. Добавьте 0,5 мл 50% стерильного глицерола, смешайте суспензию с помощью строгого вихря и храните образцы в морозильной камере -80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.
7. Инкубировать клетки, которые остаются в колбы встряхивания до 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 220 об / мин. Держите колбы встряхивания в темноте, чтобы предотвратить отбеливание фото фторфоров.
8. Возьмите дополнительные образцы 0,1 мл после 7 часов и 24 часов роста. Измерьте и обратите внимание на OD₆₀₀ из 1:10 разбавления (в C-Glc или CE-Glc минимальной среде) образцов.
9. Возьмите соответствующее количество клеток из каждой культуры, чтобы сделать криостоки, которые имеют OD₆₀₀ из 1,0. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего лечения.

3. Примеры лечения, платирования и инкубации для количественного анализа

1. После сбора всех образцов, оттаивать криостоки, и разбавить клетки в 0,9% солевой раствор (см. таблицу реагентов и материалов) до 10^-3.
2. Плита 0,1 мл из 10^{-3 разбавления} на SP средних пластин агара и распространять клетки с помощью стерильных стеклянных пипеток.
3. Инкубировать пластины ночь на 37 градусов по Цельсию в темноте, пока не появились одиночные колонии.

4. Подсчет выживших с помощью стерео флуоресцентной микроскопии для количественного анализа

1. Разделите дно агарной пластины черной ручкой на четыре части для лучшей ориентации, считая выживших под стерео флуоресцентным микроскопом.
2. Поместите пластину вверх дном под микроскопом и привести колонии в фокусе с помощью холодного источника света.
3. После того, как колонии находятся в фокусе, переключитесь на соответствующий набор фильтров для CFP, чтобы визуализировать уцелевшие клетки штамма,помеченного cFP. Подсчитайте выживших в этом штамме, помемив колонии ручкой и обратите внимание на число.
4. Удалите этикетки с этанолом и переключитесь на набор фильтров YFP, чтобы визуализировать уцелевшие клетки штамма с маркировкой yfp. Подсчитайте выживших снова, помекая колонии ручкой и обратите внимание на номер.

5. Пример лечения и микроскопии для семиколичного анализа

1. Для иллюстративных рисунков, пятно 10 мкл из 10^-4 разбавления (примерно 100 клеток) от шага 3.1 на пластине SP агара (см. Рисунок 3).
2. Инкубировать пластины ночь на 37 градусов по Цельсию в темноте, пока не появились одиночные колонии.
3. Поместите чашку Петри без крышки под микроскопом и привести пятно в фокусе с помощью холодного источника света.
4. Сфот фотографируете пятна для иллюстративных фигур. Выберите подходящее время экспозиции для съемки колоний с холодным источником света.
5. Не перемещая пластину, измените набор фильтров CFP, отрегулируйте время экспозиции и смойте. Сделай то же самое с набором фильтров YFP и сохраните фотографии для дальнейшего анализа.

6. Анализ данных

1. Используйте программное обеспечение, такое как Excel, для количественного анализа данных. Исходя из подсчитанных колоний, вычислите процент желто-синих колоний по отношению к целому количеству колоний, которые установлены на 100%.
2. Используйте рассчитанные числа для создания сложенной диаграммы бара (см. рисунок 4 и рисунок 5). Используйте программу обработки изображений, такую как Adobe Photoshop, чтобы создавать объединенные фотографии фотографий, сделанных из разных мест. Кроме того, для обработки изображений можно использовать свободно доступное программное обеспечение ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ загружаемое из системы.
3. Откройте фотографии из одного места, которые были сделаны с набором фильтров CFP и набором фильтров YFP. Оптимизируйте контрастность и яркость, чтобы уменьшить фоновое флуоресценцию от мультимедиа.
4. Перейти к одной из фотографий и выбрать все. Скопируйте картинку и вставьте ее на другую картинку.
5. Либо использовать функцию "цвет Dodge", чтобы объединить фотографии или наложения флуоресцентных изображений с помощью вкладки каналов. Слитые изображения колоний из разных средств массовой информации и различных точек времени представляют собой рост различных штаммов в жидкой культуре.

7. Конкретные советы: краситель переключатель эксперимент и cocultivation изогенных штаммов помечены cfp и yfp

Выражение любого из двух генов, кодирующих фторфор в B. subtilis, может повлиять на пригодность и, следовательно, темпы роста бактерий. Поэтому рекомендуется провести следующие эксперименты, чтобы исключить, что устранение одного штамма конкурента из популяции клеток во время культивирования просто обусловлено негативным эффектом флюорофора:

1. Повторите весь эксперимент и cocultivate обратно помечены штаммов(например, ранее cFP-помеченыштамм в настоящее время помечены геном yfp и наоборот). Хотя и на обратной стороне, полученные результаты должны быть сопоставимы с предыдущим наблюдением, что один штамм имеет избирательное преимущество роста по сравнению с другим штаммом.
2. Повторите весь эксперимент и cocultivate изогенных штаммов помечены yfp и cfp (например, BP40 (rocG и gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) и BP41 ( rocG и gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Оцените негативное влияние любого из двух флюорофоров на пригодность бактерий, следуя составу популяции клеток с течением времени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описанный здесь метод был успешно применен для визуализации внутривидовой конкуренции в популяции клеток, состоящей из штаммов B. subtilis, которые были помечены генами cfp и yfp, кодирующих фторфоры CFP и YFP, соответственно. Как показано на рисунке 3, метод может быть испо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несколько методов были разработаны для анализа конкурентоспособной пригодности^{бактерий 16}. Во многих случаях бактерии были помечены различными кассетами устойчивости к антибиотикам¹⁷. Как и наш подход, маркировка клеток с помощью кассет с устойчивостью к антибиотикам позв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)