Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Resumen

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Resumen

Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.

Introducción

Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado¹. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que proporcionan a las células una ventaja de crecimiento selectivo y, por lo tanto, aumentan su aptitud. Además, los puntos críticos mutacionales y la mutagénesis adaptativa inducida por el estrés pueden facilitar la evolución de una bacteria inadaptada^2,3. Así, la acumulación de mutaciones y el crecimiento bajo selección continua es el origen de la enorme diversidad microbiana, incluso dentro del mismo género^4,5. Al igual que en la naturaleza, la conformación de genomas bacterianos también ocurre en el laboratorio debido al cultivo continuo bajo selección. Esto se ejemplifica en la domesticación de la bacteria Gram-positiva B. subtilis, que se utiliza en todo el mundo en la investigación básica y en la industria. En la década de 1940, B. subtilis fue tratado con rayos X perjudiciales para el ADN, seguidos de un cultivo bajo una condición de crecimiento específica^6. Las mutaciones que se han acumulado en las bacterias durante su domesticación explican la pérdida de muchas características de crecimiento, es decir, la cepa de laboratorio B. subtilis 168 perdió la capacidad de formar colonias complejas^7,8.

Hoy en día, para las bacterias modelo mejor estudiadas Escherichia coli y B. subtilis,una variedad de herramientas poderosas está disponible para manipular genéticamente sus genomas con el fin de abordar cuestiones científicas específicas. A veces la inactivación de un gen de interés causa un defecto de crecimiento severo, que luego es claramente visible en el medio de crecimiento estándar⁹. Por el contrario, las mutaciones que causan un defecto de crecimiento débil y, por lo tanto, solo afectan ligeramente la aptitud de la cepa a menudo se ignoran. Sin embargo, en ambos casos la incubación prolongada y el paso de las cepas mutantes durante varias generaciones suelen dar lugar a la acumulación de mutantes supresores que han restaurado el fenotipo de la cepa madre^2,9. La caracterización de mutantes supresores y la identificación de las mutaciones que han restaurado el defecto de crecimiento de la cepa mutante madre es un enfoque muy útil que permite la elucidación de procesos celulares importantes y a menudo^{novedosos 10,11.}

Estamos interesados en el control de la homeostasis del glutamato en B. subtilis^12. Similar a E. coli, B. subtilis responde a la perturbación de la homeostasis del glutamato(es decir,bloqueo en la degradación del glutamato²⁾por la acumulación de mutantes supresores. Se demostró que las alteraciones genómicas en estos mutantes supresores que fueron adquiridos por mutación espontánea restauran rápidamente la homeostasis del glutamato^9,13. Por lo tanto, no es sorprendente que la adaptación de B. subtilis a una condición de crecimiento específica durante la domesticación de la bacteria se refleje en la síntesis enzimática y en las actividades enzimáticas evolucionadas, que están involucradas en el metabolismo del glutamato^12. Se ha sugerido que la falta de glutamato exógeno en el medio de crecimiento durante el proceso de domesticación fue la fuerza impulsora para la aparición y fijación de la críptica glutamato deshidrogenasa (GDH) del gen GUDB^CR en la cepa de laboratorio 168^2,14. Esta hipótesis es apoyada por nuestra observación de que la cantidad reducida de actividad de GDH en la cepa de laboratorio proporciona a las bacterias una ventaja de crecimiento selectivo cuando el glutamato exógeno es escaso^2. Por otra parte, el cultivo de una cepa de B. subtilis, sintetizando el GDH GudB, en ausencia de glutamato exógeno da lugar a la acumulación de mutantes supresores que han inactivado el gen gudB ^2. Obviamente, la presencia de un GDH catabólicamente activo es desventajosa para la célula porque el glutamato producido endógenamente que de otra manera podría ser utilizado para el anabolismo se degrada a amonio y 2-oxoglutarato(Figura 1). Por el contrario, cuando el glutamato es proporcionado por el medio, una cepa de B. subtilis equipada con actividad GDH de alto nivel tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre una cepa que sintetiza solo un GDH funcional. Es razonable suponer que la actividad de GDH de alto nivel permite a las bacterias utilizar el glutamato como segunda fuente de carbono además de otras fuentes de carbono proporcionadas por el medio² (ver Figura 1). Por lo tanto, la actividad de GDH afecta fuertemente la aptitud de las bacterias, dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno.

Aquí presentamos un método muy ilustrativo para monitorear y visualizar la competencia intraespecípecíta entre dos cepas de B. subtilis que difieren en un solo lugar geométrico en el cromosoma(Figura 2). Las dos cepas fueron etiquetadas con los genes yfp y cfp que codifican los fluoróforos YFP y CFP, y cocultivadas bajo diferentes condiciones nutricionales. Mediante el muestreo a lo largo del tiempo y el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, los sobrevivientes en cada uno de los cultivos podrían ser fácilmente monitoreados utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo común. El procedimiento descrito en este papel es fácil de realizar y conveniente visualizar la extensión y la eliminación clónicas rápidas de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población de la célula en un cierto plazo.

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Protocolo

1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos

1. Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos).
2. Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) y BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)² que se utilizarán en el experimento de competencia en placas de agar medio SP para obtener colonias individuales. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
3. Tome colonias individuales e inoculte tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de medio líquido LB. Crecen las bacterias durante la noche a 28 °C y 220 rpm.
4. Crecer cultivos nocturnos a 28 °C para evitar que las células lise o esporular.
5. Mida la densidad óptica de los cultivos a una longitud de onda de 600 nm (OD₆₀₀₎utilizando un espectrofotómetro estándar.
6. Si los cultivos han alcanzado un OD₆₀₀ de 2,0, mezcle 0,75 ml de los cultivos con 0,75 ml de una solución estéril de glicerol al 50% en tubos de reacción de 1,5 ml. El OD_{final 600} debe ser 1.0 para obtener criostocks que contengan aproximadamente 10⁸ células/ml.
7. Guarde los tubos a -80 °C.
8. Hacer tres precultivos de cada cepa etiquetados con los genes de fluoróforo de codificación cfp e yfp. Inocular los precultivos (tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de lb de medio líquido) con células de 1 μl de criostocks de -80 °C. Incubar los cultivos durante la noche a 28 °C y 220 rpm.

2. Cocultivación de bacterias, recolección de muestras y almacenamiento de muestras

1. Preparar recién 100 ml de medio mínimo C-Glc y CE-Glc (ver tabla de reactivos y materiales), y transferir 20 ml de cada medio en matraces estériles de 100 ml.
2. Tomar 0,1 ml de los precultivos que se cultivaron durante la noche, diluirlos con 0,9 ml lb medio en una cubeta de 1,5 ml, y determinar el OD_600.
3. Para el experimento de competición, tome aquellas preculturas de las diferentes cepas que tienen un OD₆₀₀ similar entre 1.0-1.5.
4. Para obtener poblaciones de células mixtas, diluir las células de los precultivos que tenían el OD₆₀₀ adecuado a un OD₆₀₀ de 0,05 en 20 ml C-Glc y CE-Glc medio mínimo complementado en matraces de agitación de 100 ml. Para el experimento de competición, las dos cepas deben mezclarse en una proporción de 1:1.
5. Tome muestras de 10 ml de los frascos, transfiéralos a tubos de plástico de 15 ml, coseche las células por centrifugación durante 10 min a 4.000 x g en una centrífuga de mesa estándar y deseche el sobrenadante.
6. Resuspend las células en 0.5 ml de medio lb fresco, y transferir las células a una taza de reacción estéril de 1.5 ml. Añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 50%, mezclar la suspensión mediante un riguroso vórtice y almacenar las muestras en un congelador de -80 °C hasta su posterior tratamiento.
7. Incubar las células que quedan en los frascos de agitación durante un máximo de 24 horas a 37 °C y 220 rpm. Mantenga los frascos de agitación en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico de los fluoróforos.
8. Tomar muestras adicionales de 0,1 ml después de 7 horas y 24 horas de crecimiento. Mida y observe el OD₆₀₀ de diluciones 1:10 (en medio mínimo C-Glc o CE-Glc) de las muestras.
9. Tome la cantidad apropiada de células de cada cultivo para hacer criostocks que tengan un OD₆₀₀ de 1.0. Guarde las muestras a -80 °C hasta su posterior tratamiento.

3. Tratamiento de muestras, revestimiento e incubación para análisis cuantitativos

1. Después de recoger todas las muestras, descongelar los criostocks, y diluir las células en una solución salina al 0,9% (ver tabla de reactivos y materiales) hasta 10^-3.
2. Placa 0.1 ml de las 10^-3 diluciones en placas de agar medio SP y distribuir las células utilizando pipetas de vidrio estériles.
3. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.

4. Contar a los sobrevivientes por microscopía de fluorescencia estéreo para análisis cuantitativo

1. Divida la parte inferior de la placa de agar con un bolígrafo negro en cuatro partes para una mejor orientación mientras se cuentan los sobrevivientes bajo el microscopio de fluorescencia estéreo.
2. Coloque la placa boca abajo bajo el microscopio y enfoque las colonias usando la fuente de luz fría.
3. Una vez que las colonias están en foco, cambie al conjunto de filtros apropiado para CFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada como CFP. Cuente a los sobrevivientes de esta cepa etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.
4. Retire las etiquetas con etanol y cambie al conjunto de filtros YFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada con yfp. Cuente a los sobrevivientes nuevamente etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.

5. Tratamiento de muestras y microscopía para análisis semicuantitativos

1. Para obtener cifras ilustrativas, spot 10 μl de la dilución^10-4 (aproximadamente 100 células) del paso 3.1 en una placa de agar SP (ver Figura 3).
2. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.
3. Coloque la placa de Petri sin tapa debajo del microscopio y enfoque el punto usando la fuente de luz fría.
4. Tome fotos de las manchas para las figuras ilustrativas. Elija un tiempo de exposición apropiado para tomar las fotos de las colonias con la fuente de luz fría.
5. Sin mover la placa, cambie al conjunto de filtros CFP, ajuste el tiempo de exposición y tome una foto. Haga lo mismo con el conjunto de filtros YFP y guarde las imágenes para análisis adicionales.

6. Análisis de datos

1. Utilice software como Excel para los análisis de datos cuantitativos. Sobre la base de las colonias contadas, calcular el porcentaje de colonias amarillas y azules con respecto al número total de colonias, que se establecen en 100%.
2. Utilice los números calculados para crear un diagrama de barras apiladas (consulte la figura 4 y la figura 5). Utilice un programa de procesamiento de imágenes como Adobe Photoshop para construir imágenes combinadas de las imágenes tomadas desde los diferentes puntos. Alternativamente, el software de libre acceso ImageJ, descargable desde http://rsbweb.nih.gov/ij/ se puede utilizar para el procesamiento de imágenes.
3. Abra las imágenes desde un punto que se tomaron con el conjunto de filtros CFP y el conjunto de filtros YFP. Optimice el contraste y el brillo para reducir cualquier fluorescencia de fondo del medio.
4. Vaya a una de las imágenes y seleccione todas. Copie la imagen y péguela en la otra imagen.
5. Utilice la función "esquivar el color" para combinar las imágenes o superponer las imágenes fluorescentes utilizando la pestaña de canales. Los cuadros combinados de las colonias de diversos medios y de diversos puntos del tiempo representan el crecimiento de las diversas tensiones dentro de la cultura líquida.

7. Consejos específicos: Experimento de interruptor de tinte y cocultivo de cepas isógenas etiquetadas con cfp y yfp

La expresión de cualquiera de los dos genes que codifican fluoróforos en B. subtilis podría influir en la aptitud y, por lo tanto, en la tasa de crecimiento de las bacterias. Por lo tanto, se recomienda realizar los siguientes experimentos para excluir que la eliminación de una cepa competidora de la población celular durante el cultivo se deba simplemente a un efecto negativo del fluoróforo:

1. Repita todo el experimento y cocultiva las cepas etiquetadas inversamente(por ejemplo, la cepa etiquetada anteriormente con cfpahora está etiquetada con el gen yfp y viceversa). Aunque inversamente, los resultados obtenidos deben ser comparables a la observación anterior de que una cepa tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre la otra cepa.
2. Repita todo el experimento y coculte las cepas isógenas etiquetadas con yfp y cfp (por ejemplo, BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-yfp) y BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-cfp)). Estimar el efecto negativo de cualquiera de los dos fluoróforos sobre la aptitud de las bacterias siguiendo la composición de la población celular a lo largo del tiempo.

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Resultados

El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la població...

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Discusión

Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias¹⁶. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos¹⁷. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)