烟草中瞬时表达的蛋白作为一个案例研究：复杂系统采用的实验方法设计的表征

摘要

我们描述的实验方法设计，可以被用来确定与模型的转基因的调控元件，植物生长和发育参数和培养条件对植物中的单克隆抗体和报告蛋白的瞬时表达的影响。

摘要

工厂提供用于生产生物制药，包括成本低，可扩展性和安全性的多重效益。瞬时表达提供短期开发和生产时间的额外优势，但表达水平可以分批从而在良好生产规范的背景下监管问题引起的显著差异。我们使用的试验设计（DOE）的方式设计确定的主要因素，如表达过程中的表达构建体的调节元件，植物生长和发育的参数，并在培养条件下，在表达的批次之间的变异性的影响。我们测试了植物表达模型的抗HIV单克隆抗体（2G12）和荧光标记蛋白（红色荧光蛋白）。我们讨论的理由来选择模型的某些性质，并确定其潜在的局限性。一般的处理方法可以很容易地转移到其他问题，因为该模型的原理再广泛适用：基于知识的参数选择，降低复杂性通过把最初的问题分成更小的模块，优化实验组合软件引导安装程序和阶梯式设计增强。因此，该方法不仅用于表征植物蛋白的表达也为其他复杂系统缺乏一种机械描述的调查有用的。预测方程描述参数之间的互连性可用于建立机理模型用于其它复杂的系统。

引言

生物的蛋白质在植物中的产量是有益的，因为植物是便宜的增长，该平台可以扩大刚刚通过生长得更植物和人类病原体无法复制^1,2。例如基于与叶根癌农杆菌浸润瞬时表达策略提供了额外的好处，因为DNA传递和净化产品的交付点之间的时间减少从几年到不到2个月^3。瞬时表达也可用于功能分析， 例如来测试基因的互补功能丧失的突变体或以调查蛋白质相互作用^4-6能力。然而，瞬时表达水平往往表现出更大的批与批之间的变化比在转基因植物中^7-9的表达水平。这减少了基于瞬时表达的Wi生物制药生产过程的可能性会批准在良好生产规范（GMP）的情况下，因为再现性是一个关键质量属性，并受风险评估^10。这种变化也可以掩盖，研究人员打算调查的任何相互作用。因此，我们开始着手找出影响植物中瞬时表达水平，打造一支高素质的定量预测模型的主要因素。

一个因子在每次一个（OFAT）方法经常用于表征某些参数（ 系数 ）的对结果的实验¹¹的影响（ 效应 ）（ 响应 ）。但是，这是不理想的，因为单独的测试（ 运行 ）的调查（ 实验 ）期间将通过被测试（ 设计空间 ）的因素跨越的潜力区对齐像一串珍珠。设计空间和信息，因此从实验中得出的程度的覆盖范围是低， 如图1A ^12。此外，不同的因素（ 因子相互作用 ）之间的相互依赖关系可以保持隐蔽导致差的模型和/或假最优的预测， 如图1B ^13。

上述缺点，可避免使用试验设计（DOE）的方法，其中一个实验的运行被整个设计空间散布更加均匀地设计，这意味着多于一个因素是两个运行¹⁴之间变化。有专门设计的混合物，筛选因子（ 因子设计 ）和对反应的影响因素的定量（ 响应面方法，RSM次^）15。此外，的RSM可被实现为中央复合设计，但也可以通过使用能够对运行中的选择应用不同的标准专门的软件有效地实现。例如，所谓的D-optimalitŸ标准将选择运行，以便在生成的模型的系数，以尽量减少误差，而IV-最优标准选择运行的实现整个设计空间^15,16最低的预测方差。我们在这里描述的RSM允许在植物中瞬时表达的精确定量，但是它可以很容易地转移到涉及多个（〜5-8）的任何系统的数值的因素（ 如温度，时间，浓度）和几个（〜2 - 4） 明确的因素（ 如启动子，颜色），其中一种机械的描述不可用或过于复杂的模型。

能源部的方法起源于农业科学，但已经扩散到其它区域，因为它是可转移到任何情况下它减少必要获得可靠的数据运行的次数，并生成描述性模型为复杂的过程是有用的。这反过来又导致了“指引纳入能源部的业，Q8（R2）医药发展“通过对技术要求国际协调会议公布了注册人用药品^{（ICH）17。}能源部目前广泛应用于科研和工业^18。然而，护理过程中必须采取规划和执行实验，因为选择不当的多项式程度的多重线性回归模型（ 基本型号 ）可以引入一个需要额外的运行，以正确模拟所有因素的影响。此外，损坏或丢失的数据产生不正确的型号和有缺陷预测，甚至可能防止在协议和讨论第¹⁸条所述的任何模型建立的尝试。在协议中，我们将首先列出最重要的规划步骤为RSM为基础的实验，然后解释根据能源部的设计软件DesignExpert V8.1，但类似的设计可以与其他软件includi建吴JMP，Modde和STATISTICA。实验步骤之后是对数据进行分析和评价的指示。

图1。 OFAT和能源部，一个比较 。的一个因素在一个实验（黑，红和蓝色圆圈）连续变化的时间（OFAT）实现了设计空间（斜线区域）的低覆盖率。与此相反，一个以上的因素在一个时间使用的试验设计（DOE）的策略（绿色圆圈）的设计的变化提高了覆盖率，将所得模型。 乙因而精度。偏置设计空间覆盖意味着OFAT实验（黑圈）也可能失败，找出最佳的操作区域（红色）和预测次优的解决方案（大黑圆），而能源部将军会ES（黑星）更容易找出最好的条件（大黑星）。

研究方案

1。规划能源部战略

1. 确定纳入设计相关的因素和对策。
   1. 定义用于测量一个或若干个应答。这里，2G12和DsRed的表达水平使用（微克/毫升），包括被视为相关的（10和20微克/毫升，分别）最小可检测差异和对系统的估计的标准偏差的近似值（4和8微克/毫升）基于先前的实验。
   2. 使用现有的文献，从以前的实验或专门筛选设计数据（ 如因设计，看介绍）选择显著的因素，其影响在响应将被量化（ 表^{1）7,8,19,20。}
   3. 分配因子类型（数字或明确的），并选择的范围内的数值因素将能源部调查（ 表1）中进行改变。
   4. 识别numeriÇ因子的量连续变化是难以实施。
      1. 避免使用连续变化的因素不能被精确调整到一定的水平。 如孵化温度通常可以只在±2°C的控制，使用的值，如27.2℃，25.9℃，29.3℃下，因此必须连续变化加以避免。
      2. 相反，选择若干个离散电平的这些因素（ 表1）。级别的数量应与预期的基础模型（步骤1.2）。 这是最佳的设计唯一重要的，因为中心复合设计总是有离散因子水平。
   5. 指定一个明确的因素是否是虚的， 即没有隐含的顺序（ 例如，不同厂家），或有序，从而离散数值参数（ 例如，不同的叶子的植物）。
   6. 选择水平对两种类型的明确的因素。
2. 选择一个有用的基础模型。
   1. 根据初步实验和文献，预测各要素和响应以及因子交互和响应之间的关系。例如，线性（越多越好），二次（单个最优或非线性增加/减少）或立方（歪斜最佳）。
   2. 确保为离散的数字因素的级别数为n +1，其中n是因子和响应之间的关系的多项式阶数。例如，如果温度有望对响应的二次效果，n = 2时，因此至少三个温度等级应进行调查，以实现一个合适的二次效应。
3. 限定的设计空间中的分数（FDS）的量，预测方差应该是低于一定的阈值（α-层）。该FDS应> 0.95（覆盖95％以上的设计空间），以实现在整个产率鲁棒预测模型整个设计空间^21-23。
   注：0.05的阈值相当于5％的显着性水平（I型误差），是一个典型的价值。增加该值将减少所需的能源部战略实验的次数，但同时会增加的可能性显著的效果就被忽略了，而它们对反应的影响估计是不正确的。

表1中。影响烟草中包括变化的瞬态蛋白表达的因素在能源部。因素粗体只包含在设计中为“使用不同的启动子/ 5'UTRs过程中瞬时表达红色荧光蛋白积聚的描述性模型”下描述的实验范围内 ，而因素斜体只包括在设计中为“优化incubatioÑ​​条件和单克隆抗体的使用中瞬时表达“植物生产收获计划。

图2。能源部的规划过程。与被调查的响应显著影响的因素是根据现有的数据中选择。然后因数属性（ 如数字），范围和级别分配。以前的知识和实验是用来定义一个合适的基础模型。的预测能力要求的基础上，最终模型的应用/用途定义。编译后的数据可以被转移到合适的DoE软件。

2。设立瑞岳华DesignExpert

1. 开始DesignExpert并选择“新设计”。在“响应面”窗口中，选择＆＃34;优化“，进入的第1.1节选择的数字和明确的因素）的数量。
2. 输入因子名称，单位，类型，子类型，水平/水平边界和水平值数在相应字段中的所有因素。
3. 继续到下一个页面，在“搜索”选项中选择“最佳”以及所需的“最优”的标准，这里的“D-最优”。
4. 在“编辑模式...”菜单中，选择包含的因素，并在第1.2节预计相互作用）的模型。如果不确定，选择能涵盖所有因素和相互作用有一定程度的多项式，这里“二次”一个完整的模型。请注意，选择一个完整的模型（包含所有的交互）可以增加所需要的实验设计中的数量。
5. 选择“块”的数目。在这里，一个单一的块被使用，因为所有的植物都来自同一批次，所有的细菌被同时培养和所有注射液，进行了同一天用相同的运营商。使用一个以上的块，如果超过一个批次的植物被用于或几家运营商处理的注射。
6. 平衡设计
   1. 启用以“强制明确的平衡”，以均匀分布实验运行的明确的因子水平之间，经过测试，例如不同的启动子。
      注：这样可以减少设计的最优的程度，DesignExpert将作为一个百分比值依赖于由最优算法选择的点报告。
   2. 通过实施随机种子算法，以尽量减少在最优的减少重新计算设计好几次。
      注意：在最优损失的范围可以从〜使用3-40％相同的输入数据，但改变重复次数可用于维持明确的平衡。
7. 该软件将建议值的基础上，示范基地的“示范点”的数量，这里70运行。调整运行的次数为“重复数”和“估计缺乏合适的”，以确保它是“标准点”每个在这里的每个10奔跑数> 5％。
8. 继续到下一个页面，选择回复的数量，并输入他们的姓名和单位。其他的反应也可以在任何时候在数据评估中不添加对设计产生任何负面影响。
9. 继续启动算法，计算因子水平为能源部的运行。如果所选择的基本模型不匹配的级别数为一定的因子，一个通知将被显示，并且计算将不会启动。在这种情况下，无论是：
   1. 增加这一因素的级别数;或
   2. 取消条款的基础上水平的电流数量无法计算的基础模型。
   3. 例如，如果有两个水平在T的因子“孵育时间”t（即 2天及5天）他当前的设计和二次基模型，包括术语t ²被选择，要么增加了第三级为t（即 8 d）或从模型中取出因子T ^2。
10. 除含显示，一旦计算完成的最佳因子组合的电子表格。
11. 在“设计”节点，选择“评估”子节点，并进入“图形”选项卡。
    1. 在“图表工具”中选择“FDS”，并在“FDS图表”对话框中选择“PRED”为错误类型。然后输入最小检出差异以及近似值在1.1.1节中定义的系统的估计标准差）分别为“D”和“s”的值（这里是20和8微克/毫升的红色荧光蛋白）。也进入阿尔法水平（可接受％缺少一个显著的效果）适合于应用，通常0.05（5％）。
    2. 确保FDS计算在1.3节中定义的匹配百分比）（典型值> 0.95为预测模型）。平坦的曲线在FDS情节最好，说明在整个设计空间均匀的预测精度。
       1. 如果不是这种情况（如这里找到，FDS为1％， 如图3A所示），返回到“设计”节点，并在任务栏选择“设计工具”，然后选择“增长作用的设计......”，然后选择“增加“。
       2. 选择相同的“搜索”和“最优”的标准和以前一样。也选择了同样的“编辑模式”和“强制明确的平衡”设置。如果有任何实验之前进行设计增强（如这里完成），然后将“将运行到块”设置为“块1”。
       3. 在“奔跑”部分输入的额外的“示范点”的数量，保持至少5％“重复数”和“估计缺为配合“的总设计。这里，加入100加班而没有”重复数“和”估计缺乏合适的“都包括在内。
       4. 一旦计算完成，重新审视与上述FDS曲线图。如果FDS仍不理想，则重复上述的设计增强。这里该FDS为100％的增强之后，因而没有进一步的增强是必要的（ 图3B）。

图FDS地块3。比较。答：一个能源部组成的90运行时仅产生1％的不足FDS进行预测的标准误差，使用二次基地模式与最小可探测性（20微克/毫升），估值组合交配系统（8微克/毫升），B的标准偏差。能源部的增强，合共210运行实现了100％的FDS和平面曲线表明该模型的整个设计空间均匀精度。

3。克隆和表达分析磁带

1. 培养大肠杆菌的5ml LB培养基（10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，170 mM氯化钠，50毫克/升氨苄青霉素，对于LB-琼脂平板上包括15克/ L琼脂），在37℃下进行6在定轨摇床上以160转-8小时或过夜。注意：氨苄青霉素是一种有害的物质。接种LB培养基为50微升液体培养或转移细胞从生长在用枪头平板菌落。
2. 对于PSO质粒DNA的纯化和PPAM（GenBank登录号AY027531）的其他衍生工具，从E。大肠杆菌 K12菌株DH5α，请在DNA纯化试剂盒说明书²⁴中的说明。注意：净化Ķ它含有有害的化学物质（见上文手册了解详细信息）。该质粒的序列在图4中和由买方等 ²⁰进行说明。
3. 通过测量2微升样品在一个的NanoDrop装置260 nm处的吸光度确定在纯化的洗脱物中的DNA浓度。
4. 确认纯化的质粒DNA进行消化用限制性内切核酸酶（RES）的身份。
   1. 根据质粒的序列选择的RE从而产生独特的和可区分的片段模式。遵循制造商的建议进行消化条件如反应体积，时间，温度和稳定剂的牛血清白蛋白的浓度。取决于灵敏度的分析装置中，使用50-500纳克每消化质粒DNA。
   2. 通过在Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液（; pH 8.0的90毫摩尔Tris，90 mM的硼酸盐，2 mM EDTA）中煮沸琼脂糖制备0.8-2.0％的凝胶进行DNA片段的分离。 Ŧ他更大的预期片段的琼脂糖少应在凝胶中使用。
   3. 添加5微升的5倍的样品缓冲液（5倍SABU，0.1％（重量/体积）溴酚兰，0.1％（重量/体积）二甲苯蓝，10％（重量/体积）甘油溶解在TBE），以50微升的重处理的DNA样品，并通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，在100V下进行约40分钟或直至该片段的明确分离的实现。在每个凝胶，包括含DNA梯状条带大小标记进行比较车道， 如 2-3微升1 kb的阶梯。
5. 更换欧米茄5'UTR在PSO与其他三个5'UTRs之一。
   1. 有20个单位的EcoRⅠ-HF和在NEBuffer 4 的Nco I-HF的RE释放〜4微克纯化的DNA PSO欧米茄5'UTR序列进行处理，在37℃下〜60分钟。然后，当在第3.4.2和3.4.3中所述分离的片段。
   2. 使用额外的凝胶琼脂糖凝胶分离较大的片段（PS，“骨干”）根据制造商的手册^25，并确定在部分3.3中描述的纯化的DNA的浓度）CTION试剂盒。注意：凝胶提取试剂盒含有有害的化学物质，请参阅手册了解详细信息。
   3. 通过对待〜10微克每个矢量用20单位的EcoRⅠ-HF的和在NEBuffer 4 的NcoⅠ-HF的RE在37℃〜60分钟，分离出CHS，CHS-LPH和TL 5'UTRs从合适的供体载体。然后将分离的片段在第3.4.2和3.4.3描述和净化小含5'UTR片段如第3.5.2所述。
   4. 根据制造商的建议²⁶结扎在单独的等分试样的分离纯化5'UTRs到在25℃下分离的纯化的线性聚苯乙烯载体5分钟。使用〜50纳克载体DNA和20微升的总体积的三倍摩尔过量的5'UTR的DNA。
6. 转化大肠杆菌细胞与日Ë重组质粒^26,27。
   1. 添加〜10毫微克（〜4-5微升）连接混合物（见3.5.4节），以50微升氯化铷感受态大肠杆菌 ，轻轻混匀，然后培养冰上30-60分钟。热休克，1.5分钟，在42℃下和冰浴5-30分钟。
   2. 添加950微升无抗生素的LB培养基中孵育1小时，在37℃和160转每分钟。对转化体的选择，分散在50和100微升的培养物在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上孵育〜16-20小时，在37℃下
   3. 接种5-10相当于3.1节到LB培养基中含有氨苄青霉素5毫升分装各子-5'UTR结扎独立的殖民地。然后纯化质粒DNA，并在部分3.2至3.4中所述确认其身份。
7. 与nos启动在每个使用正序Ⅰ和EcoR的RE NEBuff四个5'UTR质粒更换35SS子呃4在37℃1小时在3.5节和3.6节。
8. 每个8所得的质粒引入到A。通过电²⁸ pMP90RK： 农杆菌菌株GV3101。
   1. 添加〜500纳克纯化的质粒DNA，以50μl的感受态A.农杆菌冰上细胞。轻轻混匀并转入预冷的0.2cm电比色皿。确保该混合物是在试管的底部和不含有气泡。
   2. 脉冲的细胞在2.5千伏为5毫秒和确认脉冲的强度和持续时间。
   3. 避免高温盐浓度的DNA样本或不正确配制主管A的中根癌土壤杆菌细胞，因为这些可能会导致较高的离子电流引起的细胞悬浮液瞬间汽化，大大降低了转化效力。
   4. 添加950微升的YEB培养基中不含抗生素（5克/升牛肉提取物，1克/升酵母提取物，5g / L蛋白胨E，5克/升蔗糖，2 mM的MgSO ₄干燥，pH 7.0）中，轻轻混合，并立即转移到无菌的1.5ml反应管中。孵育2-4小时，在26-28℃和160转。
   5. 传播1-2微升在含有抗生素（50 mg / L的YEB琼脂平板 羧苄青霉素，25 mg / L的卡那霉素，25毫克/升利福平），用于转化体的选择。注意：利福平是一种有毒物质。
   6. 接种YEB培养基的3含有抗生素与代表每个子-5'UTR结扎单独的菌落细胞5ml等份并孵育48-72小时，在26-28℃和160转每分钟。
9. 确认A的成功农杆菌转化。
   1. 转让2微升各等分，从第3.8.6分离的PCR反应体系的48微升等分（2微升每10微米底漆股票（每个引物400 nM的最终浓度），1微升10 mM的dNTP混合物（每种脱氧核苷三磷酸为200微米终浓度），5微升10倍展开高保真缓冲带15毫米MgCl _2，0.75微升展开高保真酶混合物，和39.25微升无菌蒸馏水）。
   2. 扩大使用适当的引物各质粒的表达盒（FWD：5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3'，结合1026个核苷酸的启动子上游;启：5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3'，结合35S启动腺苷酸化位点内）在合适的PCR条件。这里，94℃是用于初始变性接着94℃变性15秒30个循环，51℃退火30秒和72℃延伸120秒，并最终延伸步骤在72℃进行8分钟。
   3. 通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小为在第3.4.3节中描述。
10. A.准备通过农杆菌甘油股混合500μl的50％（V / V）的无菌甘油用500μlA的农杆菌从3.8.6节的文化转型而得到了证实（第3.9.3节）。存储甘油股票在-80°C，直到进一步使用。
11. 计算使用RNAfold网络服务器²⁹的不同的mRNA的折叠能和包括从转录起始位点的核苷酸序列通过所述第一50 bp的编码区。
    1. 在“折叠算法和基本选项”部分中选择“最小自由能（MFE）和分区功能”和“避免孤立的碱基对”选项。
    2. 在“高级折叠选项”，选择“在螺旋两侧晃来晃去的能量在任何情况下”，“RNA参数（特纳模型，2004年）”和修改“重新调整能量参数给定温度（℃）”，以25°C。
    3. 在“输出选项”部分中选择的所有选项。
    4. 从“结果热力学集合预报”输出文件的部分，提取了“热力学系综的自由能”和“的MFE结构频率在合奏”值进行比较。

图4启动子和5'非编码区变体。由5'UTR中的逐步交换中产生的表达盒，产生四种组合与CaMV启动子35SS，随后该启动子的置换与序列号产生额外的四种变体和总共八个不同的启动子/ 5'UTR组合。

4。植物栽培

1. 制备肥料的0.1％溶液Ferty2兆在去离子水中，在pH 5.9。
2. 制备10×10×8厘米岩棉块通过用去离子水充分冲洗，以除去残留的化学品，最后用平衡肥料。
3. 种子烟草植株放置1-2个烟草种子每岩棉块，然后用肥要小心，以避免冲洗的种子了很短的冲洗上。
4. 发芽和培育烟草植物在温室42天在25/22°C昼/夜温度，70％相对湿度和16小时光照（180毫摩尔秒^-1米^-2，λ= 400-700纳米） 。在此光照，灌溉与施肥每隔一小时在水培15分钟。

5。瞬时蛋白表达

1. A.准备根癌土壤杆菌用于注射到树叶。
   1. 接种5-50毫升YEB培养基中含有抗生素1％A。根癌农杆菌低温贮存培养和孵化在27°C至OD <子> 600nm处达到5.0（〜48-72小时，这取决于数量和船型上）。
   2. 淡化A.癌农杆菌培养用水和2倍渗透介质（4.3 g / L的Murashige和Skoog盐（pH值为5.6），5克/升蔗糖，1.8克/升葡萄糖，100mM的乙酰丁香酮），以匹配所需的注射的OD _600nm处 。刚注射前确认OD _600nm处 。注：1.0对应于〜1.43±0.12×10 ⁹个菌落形成每毫升单位的OD _600nm处 。
2. 注入A。农杆菌悬浮液变成树叶。
   1. 选择并就此标注noncotyledon叶和岗位（ 如根据能源部的策略）进行处理。
   2. 不要注入不同的答农杆菌解决方案集成到同一个肋间领域。相反，使用在中间静脉轴线的每一侧相对的部分。如果两个以上的不同的解决方案需要在同一位置处被注入使用additiona升工厂。
   3. 彻底摇匀A。农杆菌溶液重悬自制备稀释和抽吸到1毫升的注射器，可能已经解决任何细胞。
   4. 轻轻刮擦表皮在供注射用移液管尖端或类似以促进A.涌入的位置农杆菌解决方案。避免破裂的叶片，而这样做。
   5. 握住注射器垂直于叶片接触对肋间领域的桶来对待，轻轻推出口（无连接的针）到叶的底部。按叶的顶侧轻轻地在同一时间，以防止叶片从移位或破裂。
   6. 轻轻地向下推注射器活塞。该A.农杆菌解决方案将出现深绿色和潮湿处理后的区域所示的叶片内进入细胞间隙。重复此过程在几个位置，直到整个intercostal现场的渗透与A。农杆菌 。然后继续下一个肋间领域。
   7. 确保注射器保持垂直于叶。倾斜注射器将导致细菌悬浮液以高压喷出。
   8. 如果不同的A。农杆菌解决方案被用于（ 例如测试不同的启动子），去除残留在叶片使用纸巾或申请下一个解决方案之前，类似第一次注射底部任何多余的溶液。
3. 植物和采样后浸润孵化。
   1. 准备一个人工气候室的处理过的植物〜24小时，在注射前，允许的温度和湿度达到平衡时所需要的能源部（DoE）的水平。
   2. 注射后，转移到植物的人工气候室，并把它们放入托盘足够大，灌溉用水，直到由能源部确定潜伏期的结束。
   3. 建立了16小时辐透operiod使用六种欧司朗冷白36瓦日光灯每为0.7 ^平方米管（75毫摩尔秒^-1米^-2;λ= 400-700纳米）。通过限制植物的编号，每60.7米²从遮光彼此防止植物。
   4. 取样之前，请确保正确肋间场，通过比较在5.2.1节和能源部计划添加的标签中选择。
   5. 用打孔器从在由能源部指出的位置和时间的治疗肋间领域取出4-5叶盘。从植物取样过程中请勿取出全叶。用手持式纸巾稳定叶同时移去盘，以防止破裂。
   6. 确定每个样品的质量，并将其置于1.5ml的塑料管反应标记的样品名称和质量。蛋白定量之前存储的样品在-20℃或-80℃。该过程可在此阶段被暂停数月，取决于样品的稳定性和存储温度。

6。蛋白定量

1. 从叶圆盘样品中提取的蛋白质。
   1. 加3的提取缓冲液（50mM磷酸钠，500mM的氯化钠，pH值8.0），每个样品的质量毫克和使用电动杵直到没有大的碎片留在研磨反应管叶片。避免样品过热。
   2. 通过在4℃下离心样品两次以16,000 xg离心20分钟，除去分散的固体将上清液转移到一个干净的1.5 ml反应管，而不会干扰沉淀的每个步骤之后。
   3. 离心分离后，该过程可以通过冷冻的植物提取物在-20℃或-80℃，数个月取决于样品的稳定性和贮存温度被暂停。确认一个冻融循环不影响目标蛋白（S）的浓度。
2. 测量红色荧光蛋白的荧光。
   1. 准备每个样品三个技术复制到黑色96孔半区板（每孔50微升提取物）。避免气泡的移液过程中形成的。
   2. 使用一组的每个96孔板中一DsRed的标准6稀释液（0，25，75，125，175和225微克/毫升），以产生一个衬垫参考曲线。制备的稀释于PBS中，并将其在4℃下使用储存3个月。
   3. 测量荧光两次，依次，在装有二十五分之五百三十nm激发和三十五分之五百九十〇nm发射滤波器96孔读板器。
   4. 对于每个样品，平均荧光在两次读取和三个技术重复和减去记录为含有0微克/毫升DsRed的空白对照的值。也是从标准稀释读取减去此值，并使用这些空白校正值的线性回归，得到一个参考曲线（通过坐标的原点）。
   5. 使用参考曲线的斜率来的F转化luorescence测得的样品为红色荧光蛋白的浓度。如果需要的话，稀释样品，以使读出属于该标准的浓度的时间间隔内和在后续计算中考虑此稀释倍数。
3. 确定2G12的浓度。
   1. 通过偶联蛋白A的一个流动池的活化表面制备表面等离子体共振（SPR）装置，用于抗体浓度的测定。通过灭活表面无蛋白A ^30,31的耦合使用另一种流通池作为参考。
   2. 稀释的植物提取物中的SPR运行缓冲液（10mM HEPES pH为7.4，3毫摩尔EDTA，150 mM氯化钠，0.05％体积/体积Tween-20中）1:20，并测量响应单位（RU）的抗体在3结合到蛋白A每个样品在90微升注射（180秒，30微升/分钟）的端部技术重复。减去RU距RU在佛罗里达州实验测量的参考流程单元（无蛋白A）测定OW细胞（蛋白A面）。
   3. 每次10-15样品后测量585毫微克/毫升2G12标准，在减去上述的参考流程细胞测得的数值。使用这些标准的平均RU通过坐标原点来计算线性参考曲线。
   4. 计算2G12浓度的基础上，1:20稀释和基准曲线的斜率在样品中。
   5. 检查是否有强烈的非特异性结合到引用单元格，这可能会损坏测量。同时检查2G12标准是否在整个分析大致保持恒定的值（<5％的变化），作为更大的变化反映了蛋白质表面的老化。

7。数据分析与评价

1. 手动分析中的表达实验就（i）极端值（高或低），表示测量误差所观察到的反应;（二）不寻常的结果， 如因子组合的基因评价意料之外的反应，表示数据交换，以及（iii）缺失值。
   注：请使用以下措施防止基于错误的数据建立模型。
2. 传送所分析的响应数据（此处为蛋白质浓度）成DesignExpert的“设计”节点。确保响应数据被正确地分配给相应的因子设置。有一个可用的，涵盖了以下方面的处理软件DesignExpert广泛的帮助部分。
3. 在“分析”节点，选择要分析的响应，并初步选择在转换选项卡上“无”。
   注意：一个转换被推荐用于大于10的响应的最小值/最大值的比率。最有用的转换可以从包装盒 - 考克斯情节中的“诊断工具”下面描述（第7.8节）的“诊断”一节中的“诊断”选项卡来获得。 A登入₁₀改造往往是适当的。
继续以“飞度 ​​摘要”选项卡，其中提供了有关对被调查的系统（ 例如两因子交互效应，二次效应）的重要因素，一般信息。该软件会建议根据其意义的初始模型。
4. 在“模型”选项卡中，初始模型是基于“飞度摘要”结果预选。使用自动模式来编辑这个模型：
   1. 选择“处理订单”，即一个订单上面提出的模型， 例如 ，如果建议的模式是“2FI”（两个因素的相互作用），然后选择“二次”。
   2. 选择“后退”，在“选择”字段中，从模型出发，以基于“阿尔法出”值，它应该首先是0.100的“方差分析”选项卡后，将重复删除无意义的条款。
   3. 如果要求由软件实现，总是自动修正模型的层次结构，因为这是necessary以生成可靠的模型^32,33。
5. 在“方差分析”选项卡中，调查建议的模型和附带因素。如果有必要，手动删除任何因素与p值超过预定义的阈值（这里0.05，对应5％的显着性水平），或那些不太可能基于机械审议通过切换回“标准”选项卡中，将“选择”为“手动”，并消除从模型中相应的因素。
6. 早在“方差分析”选项卡中，评估刷新模式，在“模式”（一个较低的值是可取的，因为这表示的意义）和“失拟的”（高值的p值而言是可取的因为这表明缺乏显着性的），以及为“R-平方”的值，“经调整的R平方”和“预测的R平方”（值>0.80顷期望所有三个值）。
   1. 比较这些值FOř不同型号包含/排除的因素在几个显着性水平。
      注意：它可能有助于复制在“设计”节点响应列，分别执行每一个分析，或整个“单因素方差分析”表导出到另一个程序，如电子表格。
7. 继续进行“诊断”选项卡以确认模型的质量和检测潜在的离群值在具有通过检查“诊断工具”中的所有选项卡（“诊断”和“影响”一节）模型上的强大影响力的数据集。
   1. 在“诊断工具”的“诊断”部分中，执行以下操作：
      1. 确保点随机分布在范围内“残差与预测”的图表。在这里，一个人字形分布表明需要进行数据转换。
      2. 确保该点被随机地散布在该范围内“残差与预测”的图表。在这里，一个人字形分布表明需要进行数据转换。
      3. 调查是否在“残差与运行”图表散射点内随机的限制。一个模式（ 例如 “楼梯”）表示在数据和块建设的趋势可以用来抵消其对模型的影响。
      4. 找一条直线斜线，表示在“预测与实际”情节的理想模式。数据在对角线周围的散射越大，不准确的模型。
      5. 检查蓝色（最佳）和绿色包装盒 - 考克斯情节（实际）的垂直线表示的数据转换重叠。如果绿线不匹配蓝色的（由红色垂直线表示的区间之外），回到第7.3节，并选择由箱考克斯情节提出的数据转换提高了模型建立一轮。再次重新的重复响应列可以是有用的比较不同的模型。
      6. 确保在“残差与因子”的图表（有一个图表，每个模型因子）的点随机散布的范围内。曲率中的数据分布可以表明在该模型中丢失的一个因素。
   2. 在“诊断工具”中的“影响”部分，确保有随机散射中的“外部学生化残差”范围内的数据，“杠杆”，“DFFITS”和“DFBETAS”情节，没有均匀分布低在“库克的距离”剧情极端值。
8. 在“模型图形”选项卡，可视化评估模型。对于数值的因素数量有限（ 例 ​​如 3）响应面（“3D面”）的代表性是非常有用的手动评估OPTIMA /特性。
   注：响应面只说明两个因子的影响器对受调查的回应。对响应的任何其他因素的影响，通过改变在“因素的工具”窗口的值（数值因子）或水平（明确的因素）显露。另外，因素可以通过右键单击它们中的“工具因素”窗口并选择所需的自变量轴被分配到剧情轴。
   1. 操纵因子水平，并将它们分配到使用“因素的工具”的图形坐标。
   2. 使用“导出图形到文件...”，在“文件”选项卡上的命令导出的图形。
9. 用“数字”中的“优化”节点的子节点，通过数值优化响应（最小化，最大化，在范围内）根据型号不同因素的影响，这反过来又一定的约束可以应用（ 如限制和重量） “标准”选项卡。
   1. 计算并检验数值解中的“解决方案”选项​​卡的基础上，在“标准”选项卡中提供的输入。
   2. 导出这些解决方案到其他软件（ 如电子表格），以便进一步分析（ 例如直方图）揭示高或低的响应值相关联的因子设置。
      注：这是有益的，如果超过三个数字的因素进行了研究和三维表示是困难的。
10. 使用“点预测”子节点来预测特定因子设置的响应。
    1. 使用该预测的所有设置，以进行评估（这里，所有的启动子和5'UTR的组合以及所有的叶子和孵育时间或叶片位置和孵育温度）。
    2. 导出的预测值并将其编译到一个数据阵列，它可以被用来描述在烟草植物中的瞬时表达， 例如 ，通过计算用于在某一特定时间启动子5'UTR组合的表达平均超过所有叶位置或阿克罗植物的SS所有的叶子。
    3. 规范化的基础上，不同的叶片，以产生特定的表达水平（微克g ^-1）以上或特定的表达率（微克克^-1小时^-1）的质量的表达数据。
    4. 或者，从“方差分析”选项卡的底部导出“最终方程”的系数到电子表格中，并用因子设置的阵列，以产生​​相同的数据阵列将它们相乘。
       注意：这个阵列可以只从最初的设计空间内包含因子值，因为拟合模型方程是不适合的推断。
11. 进行确认实验示范点是主要的利益。
    1. 选择为“点预测”（第7.11）条件下进行短暂的蛋白表达。 例如使用相同的温度和树叶等。
    2. 确定蛋白质浓度为这短暂的表达式experiment如上面描述的（第6条），并将其与模型预测值比较。
    3. 检查在确认实验的平均蛋白浓度是否落在期间点预测得到的响应面模型的预测区间之内。一场比赛肯定了模型的预测能力。不匹配表示低质量模型和额外的运行可能被要求。
    4. 注：工厂批与批之间的变化拓宽了预测区间，并可能贬值与不同批次的植物进行确认实验。然而，这并没有用于生成模型，但认为起源于同一种植物批次的样品中所含的模型样品可以作为有效的控制。

结果

使用不同的启动子和5'UTRs过程中瞬时表达红色荧光蛋白积聚的描述性模型

在叶中提取红色荧光蛋白的荧光被用来表明该重组蛋白的表达水平，并因此被用作在能源部策略的响应。我们认为相关的最小可检测差异为20微克/毫升和系统的估计的标准偏差为8微克/毫升的基础上初步实验。包含在瞬时表达模型的因素的基础上文献资料^7,8和我们以前的结果^9...

讨论

每个实验需要仔细的规划，因为资源通常是稀缺和昂贵。这是能源部战略尤其如此，因为在规划阶段（ 如选择基本模型，它并不包括所有显著因素相互作用）的错误可以大大减少所产生的模型的预测能力，从而贬低了整个实验。然而，可以很容易地通过以下方式避免基本程序这些错误。

在能源部的规划注意事项

首先，要选择一个响应，适合于评估结...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life Technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody