相关的mRNA分离与酵母线粒体研究本地化翻译的机制

摘要

编码线粒体蛋白质多的mRNA与线粒体外膜有关。我们描述了亚细胞分离过程，旨在酵母线粒体与它相关的基因和核糖体的隔离。这个协议可以被应用到不同的条件下生长的细胞，以揭示mRNA定位的机制，并靠近线粒体本地化的翻译。

摘要

大多数线粒体蛋白质编码的细胞核和需要被导入到细胞器。而蛋白质在接近线粒体合成的，可能会出现导入。支持这种可能性是从最近的研究，在其中有许多mRNA的编码线粒体蛋白质被证明是定位于线粒体附近而得。连同早前与外膜核糖体协会的示威活动，这些结果表明本地化的翻译过程。这种本地化的翻译可能会提高进口效率，提供了独特的调控位点，并尽量减少异位表达的情况下。多种方法已被用于表征介导的本地化翻译的因素和因素。在这些标准是亚细胞分级差速离心。这个协议在单个程序的mRNA，核糖​​体和蛋白质的分离的优点。然后这些可以表征通过各种分子和双辉化工方法。此外，转录组学和蛋白质组学的方法可以应用到所得到的材料，从而使基因组范围的见解。酵母的利用率作为模式生物对这些研究具有速度快，成本和简单性的优点。此外，先进的基因工具和可用的缺失株便于核实候选人的因素。

引言

真核细胞被组织在具有特定功能的不同的隔间。为了实现它的功能，每个隔间中包含了一套独特的蛋白质，是其活性所必需的。通过这些蛋白质接近他们的隔间一种可能的机制是通过本地化翻译^1,2。在这个过程中，蛋白质是由核糖体和mRNA的是位于那里合成了其目的地。其中本地化翻译的可能优点是增加蛋白质定位的效率，减少需要的蛋白质分子伴侣，并使特定地点的调节机制。另外，局部的mRNA和核糖体可以是机器翻译的一个僻静的水库在细胞应激，当一般翻译被抑制的案件。

线粒体在最近几年成为研究的本地化翻译中心模型。大多数线粒体蛋白质编码在细胞核中，翻译在胞质溶胶中，并导入到细胞器。各行的证据表明，许多这些蛋白质是通过一个本地翻译过程中产生的。最初，电子显微镜和生物化学分馏研究发现线粒体^3-5相关核糖体。这些研究的地方，然后通过特定的mRNA，被发现要导入只在共翻译方式^6,7的工作证实在体内 。与线粒体的mRNA关联的全基因组的研究显示，mRNAs的一个显著馏分被定位于线粒体附近^8-10。一些这些mRNA的进一步特征在于在体内荧光的方法，如鱼或MTAG ^9,11。该协会的一个直接的解释是，这些mRNA作为本地化翻译的模板。

由这些mRNA接近线粒体的机制是未知的。非编码区域（最significantly 3的'非编码区）被证明是参与mRNA联想到线粒体^12。这些领域有可能成为一个结合位点的RNA结合蛋白介导的运输。研究表明酵母，蛋白质的PUM系列（Puf3）的成员支持与线粒体^8,13 mRNA的关联。对于Puf3，这是基于对其他家庭成员函数的一个似是而非的作用，是抑制翻译而表达的是途中 ^14。因此，可能的mRNA在非翻译状态被输送，由与非编码区相互作用的RNA结合蛋白。此外，庞大的身躯的工作表明，当蛋白质被合成的交通工具发生。特别是，翻译抑制剂被证明影响mRNA的结社^8,13。此外，翻译等功能的AUG，线粒体定位序列（MTS），或ORF地区被证明，以协助定位^8,11,15。热休克蛋白70家族的蛋白质通道aperone和蛋白质受体在线粒体外膜也显示，支持mRNA的关联，进一步暗示编码蛋 ​​白的功能是mRNA定位¹⁶重要。这是一个模型，其中核糖体蛋白新兴用作靶向的mRNA-核糖体-蛋白质复合物的线粒体¹⁷识别元件是一致的。

附近线粒体本地化翻译，研究了各种方法，包括电子显微镜（可视化核糖体^）3，鱼^9，绿色的RNA（检测特定mRNA的^）11，和生化分馏（检测RNA和核糖体^）10,18。而前者的方法检测定位在体内 ，并且可以允许传输动力学的可视化，后者允许检测在单次实验中多个不同的mRNA。此外，用于生化分离的编码或非编码的域不需要是人tered，因此其具体的作用进行评估。生化分馏已成功使用多年，对许多不同的细胞区室的隔离。它的校长和局限性已经非常成熟，并且可以很容易地修改为不同目的的现有协议。必要的仪器在许多实验室的标准，因此它通常是选择的第一个方法用于研究细胞内的定位。我们描述，这对于mRNA的分离优化，而核糖体与线粒体相关的协议。因此，该协议是最佳的学习参与线粒体附近本地化翻译的因素。

研究方案

1。线粒体提纯

权衡细胞沉淀。大约0.6克是用100ml的细胞获得。

1. 增长100-150毫升酵母细胞的OD ₆₀₀ = 1-1.5 30 °C于一个非发酵生长介质中，例如半乳糖基生长培养基中，以富集线粒体。
2. 离心细胞在3000×g离心5分钟，在室温下，弃上清。
3. 用双蒸水，离心再次洗涤沉淀。弃上清。
4. 每0.5 G细胞的悬浮颗粒1毫升缓冲液的DTT。它治疗的细胞与一种还原剂，以细胞壁内打破二硫键，从而提高水解是重要的。
5. 于室温孵育10分钟，在30 °下缓慢摇动。与此同时，重达6毫克酶解酶每克细胞，并暂停其在的Zymolyase缓冲区。
6. 离心细胞在3000×g离心5分钟一吨室温，并弃去上清液。
7. 每0.15克细胞重悬沉淀于1毫升的Zymolyase缓冲。不要旋涡。
8. 测量的细胞在990微升的水将10μl外径_600。
9. 加的Zymolyase（步骤1.5），以使细胞水解的葡萄糖聚合物的β-1，3 - 葡聚糖的联系，并产生原生质球。从该步骤中，球状体应保持在等渗溶液中，以避免溶解。
10. 轻轻摇动孵育细胞15分钟，在30℃（对于酶解酶的最佳活性）。为了验证细胞壁和原生质发生水解，混合10微升的细胞与990微升的水。球状体，预计以裂解由于渗透压差，并且OD ₆₀₀应至少10倍小于在步骤1.9 ​​中确定的值。如果没有，继续孵育酶解酶的另一个15分钟。
11. 离心细胞在3000×g离心5分钟，在室温下进行。仔细存款保险计划卡上清液，作为沉淀可能是不稳定的。
12. 同的Zymolyase缓冲液洗涤原生质球，弃上清。
13. 重悬原生质球用100毫升恢复介质。转移到球状体的锥瓶中，并孵育1小时，在30 °下振荡。此恢复步骤是必要的，因为在治疗的Zymolyase翻译被逮捕和mRNA的定位被破坏（ 图1B）。
14. 添加0.1毫克/毫升CHX和转移球状体到预冷的50ml锥形管中。 CHX除了重要的是要冻结的mRNA与核糖体协会。因此，核糖体依赖的线粒体基因的关联保持不变。
15. 离心原生质球在3000×g离心5分钟，在4℃，并弃去上清液。
16. 用冷甘露醇缓冲液洗两次。
17. 重悬原生质球用4毫升冷甘露醇缓冲液，并将其转移到15毫升容量一个Dounce匀浆配备紧身杵。轻轻挣脱原生质球15招裂解液转移至13 ml管。
18. 离心裂解物在1,500×g离心6分钟，在4℃下以沉淀细胞核和完整的细胞。
19. 将上清液小心转移到新管中。抛开将1ml样品（25％）为普通肝素样品（“合计”样品）。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。沉淀RNA的“总计”样品的其余部分（见协议3，RNA沉淀）。
20. 离心的上清液在10,000×g离心10分钟，在4 °C至颗粒的线粒体。
21. 上清液（〜3ml）中转移到一个新的管，并保持它在冰上。这是在“胞质”分数。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。沉淀的RNA从“细胞质”样品的其余部分（见普罗特OCOL 3，RNA沉淀）。
22. 用3毫升缓冲液甘露醇和离心再以10000×g在4℃下洗涤沉淀10分钟
23. 重悬沉淀用3毫升甘露醇缓冲。此示例包含线粒体，而被称为“线粒体”部分。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。

2。 RNA提取

1. 加至8M的盐酸胍盐酸每个样品1卷和2体积的100％乙醇中。振荡后，至少2小时，在-20 °C。
2. 离心样品以10,000 xg离心20分钟，在4 °C。弃上清液。要小心，因为小球可能是不稳定的。
3. 用70％乙醇洗涤沉淀。
4. 重悬沉淀用400毫升的不含RNA酶的水和样品转移到新的Eppendorf管中。
5. 通过加入0.1体积的3M钠ACETAT再次沉淀RNAËpH值5.2和两册100％乙醇。振荡后，至少2小时，在-20 °C。
6. 离心样品以20,000 xg离心20分钟，在4℃下弃上清，洗用70％乙醇。
7. 空气干燥沉淀，重悬用无RNA酶的水。商店的RNA样品在-80 °C。样品可用于Northern分析¹⁹或微阵列分析^18（参见方案3）。

3。准备RNA的微阵列分析

1. 从步骤2.2 650毫升无RNase水重悬mRNA的表达。
2. 以除去任何残留的DNA或蛋白质，添加酸性酚等体积（650毫升）：氯仿（5:1，pH值4.7）和涡流大力。以最大速度离心2分钟。
3. 转移500毫升上层相（水相）的至新管。避免服用相间，因为它包含的DNA。另外要注意的服用酚，它可以抑制逆转录反应。
4. RNA样品中含有显著量肝素，这是逆转录酶的强效抑制剂。因此，对于RT-PCR或微阵列标记需要被删除。通过氯化锂沉淀去除肝素：添加氯化锂，以2M的最终浓度，并培育样品过夜，在-20 °C。
5. 解冻的样品在4 ℃，离心机以20,000×g离心20分钟，在4℃下
6. 小心弃去上清液，并用80％乙醇洗涤沉淀。离心机再次按照步骤3.5中所述。
7. 弃去上清液，空气干燥，重悬沉淀在150毫升的不含RNA酶的水。
8. 以除去任何残余的LiCl，再沉淀用0.1体积的3M醋酸钠pH值为5.3和3倍体积的100％乙醇。孵育-20 °C至少2小时。
9. 离心机的最高速度为20分钟，在4 °C。用80％的乙醇和空气干燥仔细清洗透明颗粒。
10. 重悬沉淀用25ml不含RNA酶的水，并保持样品在-80 °C。
11. 按照步骤^18,20中描述的RNA标记和杂交。

结果

该协议允许从胞浆成分含有线粒体组分的分离。以测试其成功的最好方法是从不同的隔离措施进行分析，北部和西部的分析（ 图1）的样品。三个参数的隔离质量均来自这些分析。首先，无论在样品中的RNA或蛋白是完整的 - 这些将被检测为不同的频带中进行分析。降级事件将导致额外的，更短的波段或污点的外观。其次，从每一步从输入（ 即总）的信号进行比较的信号提供了?...

讨论

在成像技术的进步已经产生了高解析度的工具来研究mRNA的定位。今天，人们可以在毫秒时间尺度^23-26测量甚至单个mRNA分子的移动。然而，传统的生化方法，如上面所描述的，也都是有用的资讯和是优选的情况。生化隔离允许的mRNA和蛋白质的大型剧目的净化，因此是最好的全基因组的研究。在单个隔离，可以得到足够的mRNA水平，以允许数以千计的基因的表征，无论是由DNA微阵列或RNA-SEQ

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle