Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Zusammenfassung

Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.

Zusammenfassung

Die meisten mitochondrialen Proteine ​​sind im Zellkern codiert und müssen in der Organelle eingeführt werden. Import auftreten können, während das Protein in der Nähe der Mitochondrien synthetisiert. Unterstützung für diese Möglichkeit wird von neueren Untersuchungen, in denen viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, wurden gezeigt, um in die Nähe Mitochondrien lokalisiert werden abgeleitet. Zusammen mit früheren Demonstrationen der Verein Ribosomen 'mit der äußeren Membran, legen diese Ergebnisse eine lokalisierte Übersetzungsprozess. Solche lokalisierten Übersetzung können Einfuhr Effizienz zu verbessern, bieten einzigartige Regelung Websites und Fälle von Eileiter Ausdruck zu minimieren. Wurden verschiedene Methoden verwendet, um die Faktoren und Elemente, die lokalisierte Übersetzung vermitteln zu charakterisieren. Norm unter diesen ist subzellulärer Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation. Dieses Protokoll hat den Vorteil der Trennung von mRNAs, Ribosomen und Proteine ​​in einem einzigen Verfahren. Diese können dann durch verschiedene molekulare und Bi charakterisiert werdenochemical Methoden. Darüber hinaus können Transkriptomik und Proteomik Methoden, um das entstehende Material aufgebracht werden, dadurch zu ermöglichen, genomweite Einsichten. Die Nutzung von Hefe als Modellorganismus für solche Studien hat die Vorteile von Geschwindigkeit, Kosten und Einfachheit. Darüber hinaus sind die fortschrittlichen Werkzeugen und genetische verfügbar Deletionsstämmen erleichtern die Überprüfung der Kandidaten Faktoren.

Einleitung

Eukaryotische Zellen sind in verschiedene Abteile mit spezifischen Funktionen organisiert. Um ihre Funktion zu erfüllen, enthält jedes Kompartiment einen einzigartigen Satz von Proteinen, die für seine Aktivität sind. Ein möglicher Mechanismus, durch den diese Proteine ​​ihre Raum zu nähern, ist durch lokalisierte Übersetzung ^1,2. Bei diesem Verfahren wird das Protein an seinem Ziel durch Ribosomen und mRNAs, die dort angeordnet sind, synthetisiert. Unter den wahrscheinlichen Vorteile der lokalisierten Übersetzung erhöht Effizienz der Protein Targeting, verringert müssen für die Protein Chaperone und ermöglicht somit eine gezielte Regulationsmechanismen. Auch können lokalisierte mRNAs und Ribosomen eine abgelegene Reservoir der Translationsmaschinerie in Fällen von zellulären Stress, wenn allgemeine Übersetzung wird gesperrt sein.

Mitochondrien wurde in den letzten Jahren ein zentrales Modell, um lokalisierte Übersetzung zu studieren. Mitochondrien sind die meisten Proteine ​​in den Zellkern, in das Cytosol übersetzt codiert,und in den Organellen importiert. Verschiedene Beweislinien zeigen an, dass viele dieser Proteine ​​werden durch einen lokalen Übersetzungsverfahren hergestellt. Zunächst erfasst Elektronenmikroskopie und biochemische Fraktionierung Studien Ribosomen mit ^3-5 Mitochondrien verbunden. Diese Studien, in denen dann in vivo durch die Arbeit an spezifischen mRNAs, die gefunden wurden, nur in einer Art und Weise cotranslationalen ^6,7 importiert werden bestätigt. Genomweite Assoziationsstudien von mRNAs mit Mitochondrien zeigten, dass ein signifikanter Anteil der mRNAs zu den Mitochondrien lokalisiert Bereich ^8-10. Einige dieser mRNAs wurden durch in vivo Fluoreszenzverfahren, wie z. B. Fisch oder MTag ^9,11 gekennzeichnet. Eine geradlinige Auslegung des Vereins ist, dass diese mRNAs dienen als Vorlagen für die lokale Übersetzung.

Die Mechanismen, mit denen diese mRNAs nähern sich den Mitochondrien sind unbekannt. Nicht-kodierende Bereiche (die meisten significantly 3 'UTR) wurde gezeigt, dass in der mRNA-Assoziation zu den Mitochondrien ¹² beteiligt werden. Diese Domains sind wahrscheinlich als eine Bindungsstelle an RNA-bindende Proteine, die ihre Transport vermitteln zu dienen. Studien in Hefe gezeigt, dass ein Mitglied der Familie von Proteinen PUM (Puf3) unterstützt mRNA Assoziation mit Mitochondrien ^8,13. Eine plausible Rolle Puf3, die auf Funktionen der anderen Familienmitglieder basiert, ist die Translation hemmen, während die mRNA ist auf dem Weg ^14. Somit kann in einer nicht-translatierte mRNAs Zustand transportiert werden, die durch RNA-bindende Proteine, die mit nicht-kodierenden Regionen interagieren. Alternativ kann eine große Menge an Arbeit schlägt vor, dass der Transport stattfindet, während das Protein synthetisiert wird. Insbesondere wurden Übersetzung Inhibitoren gezeigt mRNAs beeinflussen Verband ^8,13. Darüber hinaus übersetzt Features wie die AUG mitochondriale Targeting-Sequenz (MTS) oder ORF Regionen wurde gezeigt, dass in der Lokalisierung ^8,11,15 unterstützen. Hsp70-Proteinfamilie chaperone und Protein-Rezeptor auf der äußeren Mitochondrien-Membran wurde auch gezeigt, unterstützt mRNA Assoziation, ferner impliziert, dass codierte Protein-Funktionen sind wichtig für die mRNA-Lokalisierung ^16. Dies steht im Einklang mit einem Modell, in dem die Schwellenribosomenprotein dient als Erkennungselement für das Targeting mRNA-Ribosom-Protein-Komplex zu den Mitochondrien ^17.

Lokalisierten Übersetzungs nahe der Mitochondrien wurde durch verschiedene Verfahren, einschließlich Elektronenmikroskopie (Ribosomen sichtbar) ^3, FISH ^9, grün-RNA (mRNA spezifisch zu erkennen) ^11, und biochemische Fraktionierung (sowohl RNA und Ribosomen erkennen) ^10,18 sucht. Während die früheren Methoden erfassen Lokalisierung in vivo und können Visualisierung der Verkehrsdynamik zu ermöglichen, letzteres ermöglicht den Nachweis von verschiedenen mRNAs in einem einzigen Experiment. Außerdem für biochemische Fraktionierung Codierung oder nicht-kodierenden Bereiche brauchen nicht zu alNamen daher ihren jeweiligen Rollen ausgewertet werden. Biochemische Fraktionierung wurde erfolgreich seit vielen Jahren verwendet, für die Isolierung von verschiedenen zellulären Kompartimenten. Seine Prinzipien und Grenzen sind gut etabliert, und man kann den bestehenden Protokollen für verschiedene Zwecke leicht ändern. Die notwendige Instrumentierung ist in vielen Labors Standard, daher ist es in der Regel die erste Methode der Wahl für die Untersuchung intrazelluläre Lokalisation. Wir beschreiben ein Protokoll, das für die Isolierung von mRNAs optimiert wurde, während Ribosomen sind mit Mitochondrien assoziiert. Dieses Protokoll ist daher optimal für die Untersuchung Faktoren in der Nähe von Mitochondrien lokalisiert Übersetzung beteiligt.

Protokoll

1. Mitochondrien Reinigung

Wiegen Sie das Pellet der Zellen. Etwa 0,6 g werden aus 100 ml Zellen erhalten.

1. Wachsen 100-150 ml Hefezellen bei 30 OD ₆₀₀ = 1-1,5 ° C auf einem Wachstumsmedium nichtfermentierbaren, wie Galactose-basierten Wachstumsmedium, um die für Mitochondrien zu bereichern.
2. Centrifuge Zellen bei 3.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen.
3. Wieder Waschen des Pellets mit doppelt destilliertem Wasser und Zentrifuge. Überstand verwerfen.
4. Das Pellet in 1 ml DTT-Puffer pro 0,5 g Zellen. Es ist wichtig, um die Zellen mit einem Reduktionsmittel, um die Disulfidbrücken innerhalb der Zellwand brechen zu behandeln, wodurch Hydrolyse zu verbessern.
5. Die Zellen für 10 min bei 30 inkubieren ° C unter leichtem Schütteln. Inzwischen wiegen 6 mg Zymolyase pro 1 g Zellen zu suspendieren und in Zymolyase Puffer.
6. Zentrifuge Zellen bei 3000 × g für 5 min eint Raumtemperatur und den Überstand verwerfen.
7. Das Pellet in 1 ml Puffer pro Zymolyase 0,15 g Zellen. Nicht mit dem Vortex.
8. Messen OD ₆₀₀ von 10 &mgr; l Aliquot der Zellen in 990 &mgr; l Wasser.
9. Hinzufügen Zymolyase (Schritt 1.5), um die Zellen zu Glucosepolymeren auf die β-1 ,3-Glucan-Bindungen hydrolysiert und erzeugen Sphäroplasten. Von diesem Schritt sollte Sphäroplasten in einer isotonischen Lösung, um die Lyse zu vermeiden gehalten werden.
10. Zellen für 15 min Inkubation bei 30 ° C (für eine optimale Aktivität der Zymolyase) unter leichtem Schütteln. , Um eine Hydrolyse der Zellwand und Sphäroplasten Generation Verifizierung mischen 10 ul der Zellen mit 990 &mgr; l Wasser. Sphäroplasten werden voraussichtlich durch osmotische Differenz lysieren, und die OD ₆₀₀ sollte mindestens das 10-fache geringer ist als die im Schritt 1.9 bestimmt wird. Wenn nicht, weiterhin die Inkubation mit Zymolyase für weitere 15 min.
11. Zentrifuge Zellen bei 3000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Dis vorsichtigKarte der Überstand, wie die Pellet könnte instabil sein.
12. Waschen Sie Spheroplasten mit Zymolyase Buffer und den Überstand verwerfen.
13. Resuspendieren Spheroplasten mit 100 ml Recovery-Medium. Übertragen Sphäroplasten in einen Erlenmeyerkolben und Inkubation für 1 Std. bei 30 ° C unter Schütteln. Diese Erholung Schritt ist notwendig, da bei der Behandlung Zymolyase Übersetzung wird verhaftet und mRNA-Lokalisierung ist gestört (Abbildung 1B).
14. Mit 0,1 mg / ml CHX und Transfer Sphäroplasten auf eine vorgekühlte 50 ml konischen Röhrchen. CHX hinaus ist wichtig, Verein Ribosomen 'mit mRNAs einfrieren. So wird Ribosomen-abhängigen mRNA Assoziation mit Mitochondrien gehalten.
15. Centrifuge Spheroplasten bei 3.000 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
16. Zweimal waschen mit kaltem Mannit Buffer.
17. Resuspendieren Spheroplasten mit 4 ml kaltem Puffer Mannit und sie auf einem Dounce Homogenisator von 15 ml Inhalt mit eng anliegenden ausgestattetStößel. Vorsichtig brechen Spheroplasten mit 15 Hüben und übertragen das Lysat auf eine 13 ml Tube.
18. Zentrifugieren des Lysats bei 1.500 × g für 6 Minuten bei 4 ° C pelletiert Kernen und aufgebrochene Zellen.
19. Vorsichtig den Überstand zu übertragen, um ein neues Röhrchen. Beiseite 1 ml (25%) der Probe als unfraktioniertes Probe ("Total"-Probe). Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4X LSB für Western-Blot-Analyse. Niederschlag-RNA aus dem Rest der "Total"-Probe (siehe Protokoll Nr. 3, RNA Niederschlag).
20. Zentrifugieren des Überstands bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C, um die Mitochondrien zu pelletieren.
21. Den Überstand (~ 3 ml) in ein neues Röhrchen und halten Sie es auf Eis. Dies ist die "cytosolische" Fraktion. Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4x LSB für Western-Blot-Analyse. Niederschlag-RNA aus dem Rest der "Cytosolic" Probe (Siehe ProtOcol 3, RNA-Niederschlag).
22. Waschen des Pellets mit 3 ml Puffer Mannitol und Zentrifuge wieder bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
23. Das Pellet mit 3 ml Mannit-Buffer. Dieses Beispiel enthält die Mitochondrien und als "Mitochondrien"-Fraktion. Über 50 ml dieser Probe in ein neues Röhrchen und 15 ml 4x LSB für Western-Blot-Analyse.

2. RNA-Extraktion

1. In den jede Probe ein Volumen von 8 M Guanidinium-HCl und zwei Volumina 100% Ethanol. Vortex und Inkubation für mindestens 2 h bei -20 ° C.
2. Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Achten Sie darauf, wie das Pellet könnte instabil sein.
3. Mit 70% EtOH waschen des Pellets.
4. Das Pellet mit 400 ml RNase-freies Wasser zugeben und die Probe in ein neues Eppendorf-Röhrchen.
5. Ausfällung der RNA wieder durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natrium-Acetate pH 5,2 und zwei Volumen 100% EtOH. Vortex und Inkubation für mindestens 2 h bei -20 ° C.
6. Zentrifuge Proben bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und waschen mit 70% EtOH.
7. Luft trocknen und das Pellet resuspendieren mit RNase-freiem Wasser. Shop-RNA-Proben bei -80 ° C. Die Proben können für die Northern-Analyse ¹⁹ oder ¹⁸ Mikroarray-Analyse (siehe Protokoll Nr. 3) verwendet werden.

3. Vorbereitung der RNA für die Microarray-Analyse

1. Resuspendieren des mRNA aus Schritt 2.2 mit 650 ml RNase-freies Wasser.
2. Um jegliche Rest DNA oder Proteine ​​zu entfernen, fügen gleichen Volumen (650 ml) von saurem Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.7) und Vortex kräftig. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten.
3. Übertragen 500 ml der oberen Phase (wässriger Phase) in ein neues Röhrchen. Vermeiden Sie, die Interphase, wie es DNA enthält. Seien Sie auch vorsichtig zu nehmen Phenol, die die reverse Transkriptionsreaktion hemmen können.
4. Die RNA-Probe eine signifikante Menge an Heparin, das ein potenter Inhibitor der reversen Transkriptase ist. So kann RT-PCR oder Mikroarray-Kennzeichnung es entfernt werden muss. Entfernen Heparin durch LiCl Niederschlag: add LiCl zu einer endgültigen Konzentration von 2 M und Heizen von Proben über Nacht bei -20 ° C.
5. Tauen Sie die Proben bei 4 ° C und Zentrifugation bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
6. Vorsichtig den Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 80% Ethanol. Zentrifuge wieder wie in Schritt 3.5 beschrieben.
7. Überstand verwerfen, an der Luft trocknen und das Pellet in 150 ml RNase-freies Wasser.
8. Zum Entfernen Rest LiCl auszufällen erneut mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,3 und 3 Volumina 100% Ethanol. Inkubation bei -20 ° C für mindestens 2 Stunden.
9. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 20 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig mit 80% Ethanol und Luft trocknen Waschen Sie die transparente Pellets.
10. Resuspendieren derPellet mit 25 ml RNase-freies Wasser und halten Sie die Proben bei -80 ° C.
11. Folgen Sie den Schritten für die RNA-Markierung und Hybridisierung in ^18,20 beschrieben.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die Trennung einer Mitochondrien-enthaltende Fraktion von cytosolischen Komponenten. Der beste Weg, um den Erfolg zu prüfen ist, Northern-Analyse und Western-Analyse (Fig. 1), um Proben aus den verschiedenen Isolationsschritte durchzuführen. Drei Parameter für die Isolierung Qualität werden aus diesen Analysen abgeleitet. Erstens, ob die RNA oder Proteinen in den Proben intakt sind - diese werden als unterschiedliche Banden bei den Analysen nachgewiesen werden. Abbau Ver...

Diskussion

Technologische Fortschritte in der Bildgebung hatte hohe Auflösung Tools ergab mRNA-Lokalisierung zu studieren. Heute kann man die Bewegung auch nur eines einzigen mRNA-Molekül auf der ms-Zeitskala ^{von 23 bis 26} zu messen. Doch herkömmliche biochemische Methoden, wie das oben beschrieben wurde, sind auch informative und sind in einigen Fällen bevorzugt. Biochemische Isolierung ermöglicht die Reinigung eines großen Repertoires von mRNAs und Proteine, und ist daher bevorzugt für die Genom-weite Studien. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle