Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Резюме

Многие мРНК, кодирующих митохондриальные белки связаны с внешней мембраны митохондрий. Мы описываем субклеточную процедуру фракционирования, направленную на изоляцию митохондриях дрожжей и связанные с ним мРНК и рибосом. Этот протокол может быть применен к клеток, выращенных в разнообразных условиях с целью выявления механизмов локализации мРНК и локализованный перевод около митохондрий.

Аннотация

Большинство митохондриальных белков закодированы в ядре и должны быть импортированы в органеллы. Импорт может произойти в то время как белок синтезируется около митохондрий. Поддержка этой возможности является производным от недавних исследований, в которых были показаны многие мРНК, кодирующие митохондриальные белки, которые будут локализованы в митохондриях близости. Вместе с ранее демонстраций ассоциации рибосомы "с наружной мембраны, эти результаты предполагают, локализованный процесс перевода. Такие локализованные перевод может повысить эффективность импорта, обеспечить уникальные сайты регулирования и минимизировать случаи эктопической экспрессии. Различные методы были использованы, чтобы охарактеризовать факторы и элементы, которые опосредуют локализованного перевода. Стандартный среди них внутриклеточного фракционирования дифференциальным центрифугированием. Этот протокол имеет преимущество изоляции мРНК, рибосом и белков в одной процедуры. Они могут характеризоваться различными молекулярными и Biрадиохимический методы. Кроме того, транскриптомику и протеомики методы могут быть применены к полученного материала, тем самым позволяют генома Insights. Использование дрожжей в качестве модельного организма для таких исследований имеет преимущества скорости, расходов и простоты. Кроме того, передовые генетические инструменты и доступные штаммы удаления облегчить проверку факторов кандидатов.

Введение

Эукариотические клетки организованы в различных отсеках, имеющих определенные функции. Чтобы выполнить свою функцию, каждый отсек содержит уникальный набор белков, которые необходимы для его деятельности. Возможным механизмом, посредством которого эти белки подходят к своей отсек является локализованной перевода ^1,2. В этом процессе, белок синтезируется в пункт назначения по рибосом и мРНК, которые расположены там. Среди несомненных преимуществ локализованного перевода увеличивается эффективность таргетинга белка, уменьшается потребность в белковых сопровождающих, и позволяет механизмы регулирования по каждому конкретному объекту. Кроме того, локализованные мРНК и рибосомы могут быть уединенный резервуар перевода машин в случаях клеточного стресса, когда вообще перевод тормозится.

Митохондрии стал в последние годы центральным моделью для изучения локализованных перевод. Большинство митохондрии белки кодируются в ядре, переведенной в цитозоле,и импортируются в органеллы. Различные линии доказательств указывают, что многие из этих белков производятся через локальную процессе перевода. Изначально электронная микроскопия и биохимические фракционирования исследования обнаружены рибосомы, связанные с митохондрий ^3-5. Эти исследования, где затем подтверждено в естественных условиях работы по конкретным мРНК, которые были найдены, которые будут импортироваться только в cotranslational образом ^6,7. Генома исследования мРНК ассоциации с митохондриях показали, что значительная часть мРНК локализованы в митохондриях вблизи ^8-10. Некоторые из этих мРНК были дополнительно характеризуется ин виво флуоресценции методов, таких как рыба или Мечел Трейдинг АГ ^9,11. Прямо вперед интерпретация этого объединения является то, что эти мРНК служить в качестве шаблонов для локализованной перевода.

Механизмы, с помощью которых эти мРНК подойти к митохондрии неизвестны. Некодирующие домены (наиболее significantlу 3'-НТО) было показано, что участие в мРНК ассоциации в митохондрии ^12. Эти домены, скорее всего, чтобы служить в качестве сайта связывания с РНК-связывающих белков, которые опосредуют их транспорт. Исследования на дрожжах показали, что член PUM семейства белков (Puf3) поддерживает мРНК ассоциацию с митохондриями ^8,13. Правдоподобным роль Puf3, которая основана на функциях других членов семьи, является ингибирование перевод в то время как мРНК находится в пути ^14. Таким образом, мРНК могут перевозиться в нетранслируемой статуса, РНК-связывающих белков, которые взаимодействуют с некодирующих регионах. Кроме того, большой объем работы предполагает, что перенос осуществляется в то время как белок синтезируется. В частности, ингибиторы перевод показали повлиять мРНК ассоциацию ^8,13. Кроме того, переведенные функции, такие как август, митохондриальная последовательность таргетинг (МТС) или ORF регионы были показаны для оказания помощи в локализации ^8,11,15. Белок ч Hsp70-семьяaperone и белок рецептора на внешней мембраны митохондрий также показали поддерживать связь мРНК, далее означает, что характеристики закодированный-белковые важны для локализации мРНК ^16. Это согласуется с моделью, согласно которой рибосома возникающие белок служит в качестве элемента распознавания для ориентации мРНК-рибосома-белкового комплекса в митохондрии ^17.

Локализованная перевод вблизи митохондрий изучали с помощью различных методов, в том числе электронной микроскопии (визуализировать рибосомы) ^3, рыба ^9, зеленый РНК (выявления конкретных мРНК) ^11, и биохимической фракционирования (для обнаружения как РНК, так и рибосом) ^10,18. В то время как прежние методы обнаружения локализации в естественных условиях и может позволить визуализацию динамики транспортных, последний позволяет обнаруживать множество различных мРНК в одном эксперименте. Кроме того, для биохимического фракционирование кодирования или некодирующих областей не должны быть др.убито, поэтому их конкретные роли могут быть оценены. Биохимический фракционирование успешно используется на протяжении многих лет, для изоляции различных клеточных отсеках. Ее принципы и ограничения, хорошо известны, и можно легко изменять существующие протоколы для различных целей. Необходимая аппаратура является стандартом во многих лабораториях, поэтому, как правило, первым методом выбора для изучения внутриклеточную локализацию. Опишем протокол, который был оптимизирован для выделения мРНК в то время как рибосомы связаны с митохондрий. Этот протокол является поэтому оптимальным для изучения факторов, участвующих в локализованной перевода ближайшее митохондрий.

протокол

1. Митохондрии Очистка

Взвесьте осадок клеток. Примерно 0,6 г получают из 100 мл клеток.

1. Расти 100-150 мл дрожжевых клеток в OD ₆₀₀ = 1-1,5 на 30 ° С на среде роста nonfermentable, таких как галактоза основе ростовой среды, с тем чтобы обогатить для митохондрий.
2. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
3. Вымойте гранул с дважды дистиллированной воде и центрифуги снова. Удалите супернатант.
4. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера на DTT 0,5 г клеток. Важно, чтобы лечить клетки с восстановителем, чтобы разорвать дисульфидных связей в клеточной стенке, тем самым улучшая гидролиза.
5. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при 30 ° С при осторожном встряхивании. Между тем, весят 6 мг zymolyase на 1 г клеток и приостановить его в Zymolyase буфера.
6. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 5 мин ат при комнатной температуре и отбросить супернатант.
7. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера на Zymolyase 0,15 г клеток. Не вихрь.
8. Измерение оптической плотности ₆₀₀ 10 мкл аликвоты клеток в 990 мкл воды.
9. Добавить Zymolyase (этап 1.5) к клеткам для гидролиза полимеров глюкозы в β-1 ,3-глюкана связей и генерировать сферопластов. Из этой стадии сферопласты следует иметь в изотоническом растворе во избежание лизиса.
10. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при 30 ° С (для оптимальной активности zymolyase) при осторожном встряхивании. Для проверки гидролиз клеточной стенки и генерации сферопластов, смешать 10 мкл клеток с 990 мкл воды. Сферопласты, как ожидается, лизировать из-за осмотического разницы, и OD ₆₀₀ следует по крайней мере, в 10 раз меньше, чем значение, полученное в этапе 1.9. Если нет, то продолжать инкубацию с zymolyase еще 15 мин.
11. Центрифуга клеток при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно раскарта супернатант, как гранулы могут быть нестабильными.
12. Вымойте сферопластов с Zymolyase буфера и отбросить супернатант.
13. Ресуспендируют сферопластов 100 мл восстановления среды. Передача сферопластов в колбу Эрленмейера и инкубируют в течение 1 ч при 30 ° C при встряхивании. Этот шаг восстановления необходимо, так как при переводе лечения Zymolyase арестован и локализация мРНК нарушается (рис. 1В).
14. Добавить 0,1 мг / мл СНХ и передачи сферопластов в предварительно охлажденном 50 мл коническую трубку. СНХ дополнение важно, чтобы заморозить ассоциацию рибосомы "с мРНК. Таким образом, рибосомы-зависимые РНК ассоциация с митохондриями поддерживается.
15. Центрифуга сферопласты в 3000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
16. Промыть дважды холодным буфером маннита.
17. Ресуспендируют сферопластов с 4 мл холодного маннитол буфера и передавать их на Dounce гомогенизатор 15 мл мощности, оснащенных обтягивающиепестик. Аккуратно разбить сферопластов с 15 ударов и передать лизата к 13 мл трубки.
18. Центрифуга лизата при 1500 х г в течение 6 мин при 4 ° С для осаждения ядер и неразрушенных клеток.
19. Тщательно передачи супернатант в новую пробирку. Отложите 1 мл (25%) образца как нефракционированного образца ("Всего" образца). Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4X LSB для вестерн-блот анализа. Осадок РНК из остальной части "Total" образца (см. Протокол 3, РНК осадков).
20. Центрифуга супернатант при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения митохондрии.
21. Передача супернатант (~ 3 мл) в новую пробирку и держать его на льду. Это доля "цитозольного". Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4x LSB для вестерн-блот анализа. Осадок РНК от остальной части "цитозольного" образец (см. Protocol 3, РНК осадков).
22. Промыть гранулу с 3 мл маннита буфера и центрифугируют снова при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
23. Ресуспендируют гранул с 3 мл маннита буфером. Этот образец содержит митохондрии, и называют фракции "митохондрий". Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4x LSB для вестерн-блот анализа.

2. Экстракция РНК

1. Добавить в каждого образца одним объемом 8 М гуанидина-HCl и двух объемов 100% этанола. Vortex и инкубировали в течение по крайней мере 2 ч при -20 ° C.
2. Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C. Удалите супернатант. Будьте осторожны, как осадок может быть неустойчивым.
3. Вымойте гранул с 70% этанола.
4. Ресуспендируют гранул с 400 мл РНКазы без воды и переноса образца в новую пробирку Эппендорфа.
5. Осадок РНК снова добавлением 0,1 объема 3 М ацетат натрияэ рН 5,2 и два тома 100% этанола. Vortex и инкубировали в течение по крайней мере 2 ч при -20 ° C.
6. Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и мыть с 70% этанола.
7. Воздух сухой гранул и ресуспендируют с РНКазы воды. Образцы магазин РНК при -80 ° C. Образцы могут быть использованы для северной анализа ¹⁹ или микрочипов анализа ¹⁸ (см. Протокол 3).

3. Подготовка РНК для Microarray анализа

1. Ресуспендируют мРНК с шага 2.2 с 650 мл РНКазы свободной воды.
2. Чтобы удалить остатки ДНК или белки, добавить равный объем (650 мл) кислого фенола: хлороформ (5:1, рН 4,7) и вихрь энергично. Центрифуге при максимальной скорости в течение 2 минут.
3. Передача 500 мл верхней фазы (водной фазы) в новую пробирку. Избегайте интерфазу, так как она содержит ДНК. Также будьте осторожны с фенол, который может ингибировать реакции обратной транскрипции.
4. Образец РНК содержит значительное количество гепарина, который является мощным ингибитором обратной транскриптазы. Таким образом, для RT-PCR или микрочипов маркировки она должна быть удалена. Удалить гепарин по LiCl осадков: добавить LiCl до конечной концентрации 2 М, а нагрев образцов в течение ночи при -20 ° C.
5. Оттепель образцов при 4 ° C и центрифугируют при 20000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
6. Осторожно удалите супернатант и мыть гранул с 80% этанола. Центрифуга снова, как описано на стадии 3.5.
7. Жидкость над осадком сливают, высохнуть на воздухе и вновь суспендируют таблетку в 150 мл РНКазы воды.
8. Чтобы удалить остатки LiCl, осадок снова с 0,1 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,3 и 3 объемов 100% этанола. Выдержите при -20 ° С в течение не менее 2 часов.
9. Центрифуге при максимальной скорости в течение 20 мин при 4 ° C. Промыть тщательно прозрачную гранул с 80%-ным этанолом и сушат на воздухе.
10. Ресуспендируютосаждения с 25 мл РНКазы без воды и сохранить образцы при -80 ° C.
11. Следуйте инструкциям для РНК маркировки и гибридизации, описанной в ^18,20.

Результаты

Этот протокол позволяет разделение на митохондрии, содержащие фракции из цитозольных компонентов. Лучший способ проверить свой ​​успех является выполнение северную анализ и западную анализ (рис. 1) с образцами из разных стадий выделения. Три параметры качества изоляции явля...

Обсуждение

Технологические достижения в визуализации уступил инструменты с высоким разрешением для изучения локализации мРНК. Сегодня можно измерить движение даже одной молекулы мРНК в мс масштабе времени ^23-26. Тем не менее, традиционные биохимические методы, как описана выше, также информ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle