Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

Résumé

De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.

Résumé

La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau et doivent être importées dans l'organite. Importation peut se produire alors que la protéine est synthétisée à proximité des mitochondries. L'assistance pour cette possibilité est fondée sur des études récentes, dans lequel de nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales ont été présentées à être localisées à proximité de mitochondries. Avec des manifestations antérieures de l'association des ribosomes à la membrane externe, ces résultats suggèrent un processus de traduction localisée. Cette traduction localisée peut améliorer l'efficacité de l'importation, fournir des sites de régulation uniques et réduire les cas de l'expression ectopique. Diverses méthodes ont été utilisées pour caractériser les facteurs et les éléments qui assurent la médiation de traduction localisée. Norme d'entre eux est un fractionnement sous-cellulaire par centrifugation différentielle. Ce protocole présente l'avantage d'isoler des ARNm, les ribosomes et les protéines en une seule procédure. Ceux-ci peuvent ensuite être caractérisés par divers moléculaire et biméthodes ochemical. En outre, la transcriptomique et la protéomique méthodes peuvent être appliquées à la matière résultante, permettre ainsi un aperçu de l'ensemble du génome. L'utilisation de la levure comme organisme modèle pour ces études a les avantages de rapidité, de simplicité et de coût. En outre, les outils de la génétique de pointe et des souches de suppression disponibles faciliter la vérification des facteurs de candidats.

Introduction

Les cellules eucaryotes sont organisés dans des compartiments distincts ayant des fonctions spécifiques. Pour remplir sa fonction, chaque compartiment contient un ensemble unique de protéines qui sont essentielles pour son activité. Un mécanisme possible par lequel ces protéines abordent leur compartiment est localisée par ^1,2 de traduction. Dans ce procédé, la protéine est synthétisée à sa destination par les ribosomes et les ARNm qui y sont situés. Parmi les avantages probables de traduction localisée augmentent l'efficacité de la protéine de ciblage, de réduction du besoin de protéines chaperons, et permettant des mécanismes de régulation spécifiques au site. En outre, les ARNm et des ribosomes localisées peuvent être un réservoir isolé de machinerie de traduction en cas de stress cellulaire, lorsque la traduction générale est inhibée.

Mitochondries est devenu ces dernières années un modèle central à étudier traduction localisée. La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau, traduites dans le cytosol,et importées dans l'organite. Divers éléments de preuve indiquent que bon nombre de ces protéines sont produites par un processus de traduction locale. Initialement, les études de microscopie électronique et de fractionnement biochimique détectés ribosomes associés aux mitochondries ^5.3. Ces études ont été ensuite corroborées in vivo par le travail sur des ARNm spécifiques, qui ont été trouvés à être importés que d'une manière ^6,7 cotraductionnelle. études de génome entier d'ARNm liaison avec les mitochondries ont montré qu'une fraction significative d'ARNm sont localisés au voisinage de la mitochondrie ^8-10. Certains de ces ARNm ont été en outre caractérisé par fluorescence in vivo méthodes, comme le poisson ou MTAG ^9,11. Une interprétation straight-forward de cette association est que ces ARNm servent de modèles pour la traduction localisée.

Les mécanismes par lesquels ces ARNm approchent les mitochondries ne sont pas connus. domaines non codantes (plus significantl3 'UTR y) ont été présentés à participer à l'ARNm association aux mitochondries ^12. Ces domaines sont susceptibles de servir de site de liaison à des protéines liant l'ARN qui assurent la médiation de leur transport. Les études chez la levure ont révélé qu'un membre de la famille de PUM de protéines (Puf3) prend en charge l'association d'ARNm avec des mitochondries ^8,13. Un rôle plausible pour Puf3, qui est basée sur les fonctions des autres membres de la famille, est d'inhiber la traduction de l'ARNm en est en route ^14. Ainsi, les ARNm peuvent être transportés dans un état non traduite, par des protéines de liaison d'ARN qui interagissent avec les régions non codantes. En variante, un grand nombre de travaux suggèrent que le transport a lieu pendant que la protéine est synthétisée. En particulier, les inhibiteurs de la traduction ont été montrés pour affecter ARNm association ^8,13. En outre, les caractéristiques traduits tels que l'AUG, la séquence de ciblage mitochondrial (MTS) ou les régions ORF sont présentés pour aider à la localisation ^8,11,15. Hsp70-famille de protéines chaperone et récepteur de la protéine sur la membrane externe des mitochondries ont également été présentés à l'appui de liaison de l'ARNm, ce qui implique en outre que les caractéristiques-protéine codée sont importantes pour la localisation de l'ARNm ^16. Ceci est en accord avec un modèle dans lequel la protéine de ribosome-émergentes sert d'élément de reconnaissance pour le ciblage complexe ribosome-ARNm-protéine à la mitochondrie ^17.

Traduction localisée près de la mitochondrie a été étudié par diverses méthodes, y compris la microscopie électronique (pour visualiser les ribosomes) ^3, FISH ^9, ARN vert (pour détecter les ARNm spécifiques) ^11, et le fractionnement biochimique (pour détecter l'ARN et des ribosomes) ^10,18. Alors que les méthodes antérieures de détecter la localisation in vivo et peuvent permettre la visualisation de la dynamique de transport, celui-ci permet une détection de plusieurs ARNm différents dans une seule expérience. En outre, pour le codage de fractionnement biochimique ou non codantes domaines n'ont pas besoin d'être altation, par conséquent, leurs rôles spécifiques peut être évaluée. Fractionnement biochimique a été utilisée avec succès pendant de nombreuses années, pour l'isolement de nombreux compartiments cellulaires différents. Ses principes et les limites sont bien établies, et on peut facilement modifier les protocoles existants à des fins différentes. L'instrumentation nécessaire est la norme dans de nombreux laboratoires, il est donc généralement la première méthode de choix pour l'étude de la localisation intracellulaire. Nous décrivons un protocole qui a été optimisée pour l'isolement des ARNm tandis que les ribosomes sont associés aux mitochondries. Ce protocole est donc optimale pour étudier les facteurs impliqués dans la traduction localisée près de mitochondries.

Protocole

Une. Mitochondries Purification

Peser le culot de cellules. Environ 0,6 g sont obtenus à partir de 100 cellules ml.

1. Cultivez 100-150 ml de cellules de levure à DO ₆₀₀ = 1-1,5 à 30 ° C sur un milieu de croissance non-fermentescible, comme milieu de croissance à base de galactose, de façon à enrichir pour des mitochondries.
2. Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
3. Laver le culot avec de l'eau distillée deux fois et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant.
4. Reprendre le culot dans 1 ml de tampon TNT par 0,5 g de cellules. Il est important de traiter les cellules avec un agent réducteur afin de rompre les liaisons disulfures à l'intérieur de la paroi cellulaire, ce qui améliore l'hydrolyse.
5. Incuber les cellules pendant 10 min à 30 ° C avec agitation douce. Pendant ce temps, peser zymolyase 6 mg pour 1 g de cellules et de le suspendre dans le tampon Zymolyase.
6. Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min untempérature t ambiante et jeter le surnageant.
7. Reprendre le culot dans 1 ml de tampon Zymolyase par 0,15 g de cellules. Ne pas vortex.
8. Mesurer la DO ₆₀₀ de 10 ul aliquote de cellules dans 990 ul d'eau.
9. Ajouter Zymolyase (étape 1.5) aux cellules d'hydrolyser des polymères de glucose à des liaisons β-1 ,3-glucane et de générer des sphéroplastes. A partir de cette étape, les sphéroplastes doivent être conservés dans une solution isotonique pour éviter la lyse.
10. Incuber les cellules pendant 15 min à 30 ° C (pour une activité optimale de zymolyase) avec agitation douce. Pour vérifier l'hydrolyse de la paroi cellulaire et la production de sphéroplastes, mélanger 10 ul de cellules avec 990 ul d'eau. Sphéroplastes sont attendus à la lyse osmotique due à la différence, et la DO ₆₀₀ devraient être au moins 10 fois inférieure à la valeur déterminée dans l'étape 1.9. Sinon, continuez incubation avec zymolyase pendant 15 min.
11. Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min à température ambiante. Dis soigneusementcarte du surnageant, comme le culot peut être instable.
12. Laver sphéroplastes avec Zymolyase tampon et jeter le surnageant.
13. Reprendre sphéroplastes avec 100 ml de milieu de récupération. Transfert sphéroplastes à un Erlenmeyer et incuber pendant 1 heure à 30 ° C avec agitation. Cette étape de récupération est nécessaire, car lors de la translation de Zymolyase traitement est arrêté et la localisation de l'ARNm est perturbée (figure 1B).
14. Ajouter 0,1 mg / ml CHX et sphéroplastes de transfert à un tube conique de 50 ml préalablement refroidi. plus de CHX est important de geler l'association des ribosomes avec des ARNm. Ainsi, les ribosomes dépendantes association d'ARNm avec des mitochondries est maintenue.
15. sphéroplastes à centrifuger à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
16. Laver deux fois avec le tampon mannitol froid.
17. Reprendre sphéroplastes avec 4 ml de tampon mannitol froid et les transférer dans un homogénéisateur Dounce de 15 ml de capacité équipé hermétiquepilon. Briser doucement sphéroplastes avec 15 coups et transférer le lysat dans un tube de 13 ml.
18. Centrifuger le lysat à 1500 x g pendant 6 minutes à 4 ° C pour sédimenter les noyaux et les cellules non rompues.
19. Soigneusement transférer le surnageant dans un nouveau tube. Mettre de côté 1 ml (25%) de l'échantillon comme un échantillon non fractionnée (échantillon «Total»). Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4X LSB pour l'analyse Western blot. Précipité l'ARN du reste de l'échantillon «Total» (voir le protocole 3, ARN précipitations).
20. Centrifuger le surnageant à 10000 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les mitochondries.
21. Transférer le surnageant (~ 3 ml) dans un nouveau tube et le garder sur la glace. Il s'agit de la fraction "cytosolique". Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4x LSB pour l'analyse Western blot. ARN précipité du reste de l'échantillon "cytosolique" (Voir Protocol 3, ARN précipitations).
22. Laver le culot avec 3 ml de tampon mannitol et centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C.
23. Reprendre le culot avec 3 ml de mannitol tampon. Cet exemple contient les mitochondries, et appelé fraction «mitochondries». Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4x LSB pour l'analyse Western blot.

2. Extraction de l'ARN

1. Ajouter à chaque échantillon un volume de 8 M de guanidinium-HCl et deux volumes d'éthanol à 100%. Vortex et incuber pendant au moins 2 heures à -20 ° C.
2. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. Soyez prudent car la pastille peut être instable.
3. Laver le culot avec 70% EtOH.
4. Reprendre le culot avec 400 ml d'eau sans RNase et transférer l'échantillon dans un nouveau tube Eppendorf.
5. Précipiter l'ARN à nouveau en ajoutant 0,1 volume d'acétate de 3 M de sodiume pH 5,2 et deux volumes d'EtOH à 100%. Vortex et incuber pendant au moins 2 heures à -20 ° C.
6. Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver avec de l'EtOH à 70%.
7. Air sécher le culot et remettre en suspension avec de l'eau sans RNase. échantillons d'ARN de magasin à -80 ° C. Les échantillons peuvent être utilisés pour l'analyse du nord ¹⁹ ou analyse de puces à ADN ¹⁸ (voir protocole 3).

3. Préparation de l'ARN pour l'analyse de puces à ADN

1. Reprendre l'ARNm de l'étape 2.2 avec 650 ml d'eau sans RNase.
2. Pour retirer tout l'ADN ou de protéines résiduel, ajouter un volume égal (650 ml) d'acide phénol: chloroforme (5:1, pH 4,7) et vortexer vigoureusement. Centrifuger à vitesse maximale pendant 2 min.
3. Transférer 500 ml de la phase supérieure (phase aqueuse) dans un nouveau tube. Évitez de prendre de l'interphase, car il contient de l'ADN. Aussi soyez prudent de prendre phénol, qui peut inhiber la réaction de transcription inverse.
4. L'échantillon d'ARN contient une quantité importante de l'héparine, qui est un puissant inhibiteur de la transcriptase inverse. Ainsi, par RT-PCR ou le marquage par puce à ADN, il doit être retiré. Retirer l'héparine par la précipitation de LiCl: ajouter LiCl à une concentration finale de 2 M et incuber les échantillons pendant une nuit à -20 ° C.
5. Décongeler les échantillons à 4 ° C et centrifuger à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
6. Prenez soin de le surnageant et laver le culot avec 80% d'éthanol. Centrifuger à nouveau comme décrit dans l'étape 3.5.
7. Jeter le surnageant, l'air sec et remettre en suspension le culot dans 150 ml d'eau sans RNase.
8. Pour retirer tout résidu LiCl, précipiter à nouveau avec 0,1 volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,3 et 3 volumes d'éthanol à 100%. Incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures.
9. Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min à 4 ° C. Laver soigneusement la pastille transparente avec 80% d'éthanol et de l'air sec.
10. Reprendre leculot avec de l'eau sans RNase 25 ml et conserver les échantillons à -80 ° C.
11. Suivez les étapes de l'étiquetage de l'ARN et hybridation décrit dans ^18,20.

Résultats

Ce protocole permet la séparation d'une fraction contenant des mitochondries, à partir des composants cytosoliques. La meilleure façon de tester son succès consiste à effectuer une analyse de Northern et une analyse Western (figure 1) à partir des échantillons des différentes étapes d'isolement. Trois paramètres de la qualité de l'isolation sont obtenus à partir de ces analyses. Tout d'abord, si l'ARN ou des protéines dans les échantillons sont intacts - ceux-ci sont d?...

Discussion

Les progrès technologiques en matière d'imagerie ont donné des outils de haute résolution pour étudier la localisation des ARNm. Aujourd'hui, on peut mesurer le mouvement même d'une molécule d'ARNm unique à l'échelle de temps ms ^23-26. Pourtant, des approches biochimiques traditionnels, comme celui décrit ci-dessus, sont également informative et sont préférables dans certains cas. L'isolement biochimique permet la purification d'un large répertoire d'ARNm et de pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle