的IFN-γ酶联免疫斑点检测，以评估水痘 - 带状疱疹病毒特异性细胞免疫继脐血移植的发展

摘要

新世代的功能测定法如γ干扰素（IFN-γ）的酶联免疫斑点法，其检测细胞因子的产生在单细胞水平，并提供T细胞应答的定量和定性特征，可用于评估细胞介导的​​针对水痘 - 带状疱疹免疫应答病毒（VZV）。

摘要

水痘 - 带状疱疹病毒（VZV）是发病率和死亡率以下脐血移植（UCBT）的显著原因。出于这个原因，抗疱疹预防系统地施用给小儿脐血移植​​接受者，以防止水痘病毒感染相关的并发症，但没有强大的，基于证据的共识，它定义了最佳治疗时间。因为T细胞介导的​​免疫是负责水痘感染的控制，评估的VZV特异性T细胞反应的重建下列UCBT可以表示出对预防是否应保持或可停药。为此，一个特定的VZVγ干扰素（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）测定法的开发是由T淋巴细胞响应于体外刺激与照射减毒活水痘疫苗来表征的IFN-γ的产生。此法提供了水痘特定的C的快速，重复性好，灵敏的测量埃尔介导的免疫适于监测VZV特异性免疫的重构在临床环境和评估免疫反应对VZV抗原。

引言

在1989年第一次演出，脐血移植是越来越多地用作各种肿瘤和非肿瘤性血液疾病的儿童¹治疗的一部分。水痘是一种细胞病变人力alphaherpesvirus这会导致两种不同的疾病，水痘（原发感染后），带状疱疹（激活后）。继原发感染，水痘持续整个背根神经节的感觉神经内避风的主机的使用寿命。其中最有威胁的感染性并发症以下UCBT是与水痘^2-4关联。在我们的临床中心，在没有水痘预防，水痘水痘病的发病在3年累积发病率postUCBT为^46％2。在这些患者中， 从头感染或VZV的激活通常与内脏传播到中枢神经系统，肺和肝^5-7相关联。因此，阿昔洛韦，伐昔洛韦或泛昔洛韦预防通常给药至UBCT收件人^8,9。然而，这种治疗策略不考虑VZV特异性T淋巴细胞或VZV特异性T细胞反应重建动力学的保护电位。随着国家扩大利用长期抗疱疹预防相关的潜在问题包括:a）病人过度治疗;二）抗病毒抗药性^10,11的发展;和c）的VZV特异性免疫重建^12,13减值。因为检测的功能VZV特异性T淋巴细胞相关性。和VZV感染长期保护的存在，改善临床结果^4,14,15，监测细胞介导的针对水痘的免疫反应在移植后的时期，可能会导致更合理地使用抗病毒药物通过治疗使医生来区分谁的病人将受益于水痘预防从那些免疫系统能够控制VZV复制^4,13的。

的IFN-γ酶联免疫斑点测定法被广泛地用于在多种试验系统及临床情况的监测细胞介导的​​免疫反应。斑产生下列显色底物的裂解，产生一个可见的和稳定的沉淀物在反应的位点。每个单独的点，从而代表一个单独的细胞因子产生细胞的足迹。 IFN-γ酶联免疫斑点法不仅测量单个细胞在体外的产生IFN-γ响应于体外刺激同源抗原的能力，但它也提供了在一个给定的细胞群体^16,17响应单元的频率的估计。除了其高灵敏度，IFN-γ酶联免疫斑点法是直接执行，使得它的使用可能在旨在指导开始抗病毒治疗或终止个性化临床治疗方案的上下文。该过程详述如下describES是专门设计由外周血单核细胞下列体外刺激用VZV的抗原检测和测量产生IFN-γ的ELISPOT测定。

研究方案

本研究方案经朱圣 - 和Justine，蒙特利尔，魁北克，加拿大，那里的研究进行的制度伦理审查委员会。知情同意书，并寻求从所有研究参与者，他们的父母或法定监护人获得。在第一天进行的所有程序和2必须是无菌的条件下（ 即在层流罩）下进行。标准的安全程序来处理人体血液必须严格遵守。

1，涂料的板

1. 通过加入到每个孔中20微升35％乙醇中1分钟，透化聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在96孔MultiScreen IP白色的ELISpot板的底部。膜应该成为稍透亮。
2. 使用MUL;立即用200μl1X磷酸盐缓冲盐水（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫米的Na ₂ HPO _4，2mM的KH ₂ PO _4，pH 7.4的PBS）洗涤各孔3次声道音吸管或类似的装置。由于乙醇的残基可以影响细胞的活力和捕获抗体结合这一步是至关重要的。酶联免疫斑点法板是脆弱的，必须小心处理:使用自动洗板机，不推荐。
3. 涂层的孔与10微升纯化的小鼠抗人IFN-γ捕获抗体稀释在1×PBS中的10微克/毫升的最终浓度。覆盖板与普通保鲜膜孵育过夜，4°C。

2，挡板

1. 空井，窃听他们干，并用200微升的1×PBS洗板5次。
2. 填充孔用200μl的完全RPMI 1640培养基中孵育板2小时，在37℃（分块步骤）。
3. 洗涤板5倍用200μl的1×PBS中并保持在孔中充满的1×PBS中，直到细胞准备进行电镀。

3，电池和电镀刺激

1. 准备peripheral血单核细胞（PBMC）从人的静脉血样离心上使用标准方法的Ficoll-Paque上的梯度。备选地，使用标准方法，解冻PBMC的等分试样在液氮下冷冻。在水套培养箱在5％CO ₂气氛下后，最后离心后，重新悬浮细胞以2×10 ⁶个细胞/ ml的终浓度，孵育过夜，在37℃。
2. 从培养箱中取出PBMC重悬他们于5ml RPMI 1640完全培养基中的终体积。
3. 在10微升从粘质沙雷氏菌 5分钟，在室温下遗传工程内切核酸酶的存在下培养PBMC。
4. 除去PBMC的一个50μl的等分试样，并用50μl的台盼蓝染料混合。计数细胞，并用血球和显微镜检查（染色排除法）估算％的生存能力。各种自动化方法进行细胞计数和细胞活力罐人评价所以可以使用。 PBMC应> 95％存活。丢弃当样品生存能力低于95％。
5. 离心机的PBMC，在700×g离心5分钟，弃去上清，重悬细胞以2×10 ⁶个细胞/ ml的终浓度添加2％（V / V）灭活的人血清（HIS）的AIM-V培养基。保持在37°C，直到刺激混合物加入到平板。
6. 加至孔中，1滴一次，加入100μl适当的刺激混合物。三刺激的混合物，应使用如下所述:
   1. 用AIM-V培养基补充有2％（V / V）灭活的人血清（IHS）作为阴性对照。
   2. 使用抗CD3单克隆抗体（克隆OKT3）稀释在AIM-V培养基补充有2％（V / V）的IHS至0.5微克/毫升作为阳性对照）的终浓度。
   3. 使用VZV抗原，无论是γ-辐射的形式（10,000戈瑞; 30分钟的曝光时间）减毒活疫苗VZV（1,350斑块形成单位[PFU] /毫升）的稀释泰德1:200在AIM-V培养基补充有2％（V / V）IHS）或1微克67肽（15个氨基酸残基）的基础上，VZV的顺序立即早期（IE63）磷蛋白合成的等摩尔混合物的。通过监测缺乏的细胞病变效应明显迹象后PBMC培养4天控制照射疗效。
   4. 准备一式两份的所有井。
7. 加至各孔，一减少的时间，将100μl制备步骤5.4至适当的孔中的细胞。两个井应保持无细胞（阴性对照）。在水套培养箱在5％CO ₂气氛下孵育20小时，在37℃。不要摇晃，移动或堆叠在另一个孵化过程中顶部的板块。

4，景点开发与检测

1. 弃去细胞用1×PBS洗涤板10倍的补充有0.05％（V / V）吐温20（PBST）。吐温20有助于分离已经坚持了我的PVDF细胞mbrane以下孵育过夜。
2. 使用多通道移液管加入100微升的0.5毫克/毫升生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体（克隆4S.B3）稀释在1×PBS中含有0.5％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）。孵育板2小时在室温下。
3. 洗涤各孔6倍用PBST和添加每孔加入100μl链霉亲和有机共轭的碱性磷酸酶稀释1:1,000在1x PBS中含有0.5％（重量/体积）BSA中。覆盖板并孵育1小时，在室温下进行。
4. 洗涤板3倍用PBST和3X用1×PBS。添加100μl的5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚磷酸（BCIP）/硝基蓝四唑氯化物（NBT）底物溶液孵育5分钟，在室温下进行。
5. 下运行蒸馏水冲洗板。取出的ELISpot板的底部部分，并用蒸馏水洗膜的两侧。空气干燥该板。
6. 检查各孔，并用立体ð列举的斑点issection显微镜或使用自动点计数器扫描板。保持板避光，如果他们不能检查在同一天。
   1. 平均斑点在相应的复孔计数的数量和从斑点中的测试孔计数的数目减去斑点在阴性对照孔计数的数目（无细胞）。
   2. 表达IFN-γ的生产为斑点形成单位的数量（SFU）每10 ⁶个PBMC。
   3. 认为试验样品是阳性如果SFU的数量为> 50每10 ⁶个PBMC和2个标准差（SD）以上的负对照（细胞+ AIM-V培养基中补充了2％（V / V）IHS）。
   4. 使用每孔400 SFU的值时，斑点更是不胜枚举进行计数。
7. 测试是否酶联免疫斑点法数据是正态分布的，或不使用Kolmogorov-Smirnov检验。当数据是正态分布，采用学生t TES进行统计比较T（2组）或单因素方差分析和Bonferroni法检测后（多重比较）。如果数据不是正态分布，用曼-惠特尼U检验（2组）或Kruskal-Wallis检验和邓恩的后测（多重比较）。

结果

上面详述的IFN-γ酶联免疫斑点协议被开发，并在我们的实验室优化测量的幅度和针对VZV ⁴细胞介导的免疫应答的质量。可用于刺激步骤的VZV抗原的不同来源。这些措施包括:a）由水痘市售清洁剂灭活提取物感染的Vero细胞^18;从具体的VZV编码的蛋白质，包括IE63 ¹⁵和¹⁹的ORF4重叠合成肽二）池;三）减毒活水痘带状疱疹疫苗^20;及d）VZV紫外线灭活抗原准备从破碎的VZV?...

讨论

修改和故障排除:IFN-γ酶联免疫斑点测定法已被用于检测细胞介导的针对多种微生物病原体，包括人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的^24,25，丙型肝炎病毒^（HCV）26免疫反应^{， 27，}和结核杆菌 ^28,29，只是仅举几例。在这里，我们描述的IFN-γ酶联免疫斑点法的发展来衡量细胞对免疫，用在定义儿科复苏脐血移植受者的VZV特异性免疫重建相互关系的希望。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.