Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Resumo

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Resumo

A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.

Introdução

Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças ^1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV ^2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT ^2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado ^5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT ^8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral ^10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica ^12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica ^4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV ^4,13.

O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular ^16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.

Protocolo

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis ​​legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estritamente observados.

1. O revestimento das placas

1. Permeabilizar o difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membranas na parte inferior de 96 poços placas ELISpot branco MultiScreen IP, adicionando a cada poço 20 ul de etanol a 35% durante 1 min. Membranas deve tornar-se um pouco translúcido.
2. Imediatamente lavar os poços 3 vezes com 200 ul de 1x tampão fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) utilizando uma multichannel pipeta ou dispositivo semelhante. Esta etapa é fundamental, uma vez que os resíduos de álcool pode afetar a viabilidade celular e ligação do anticorpo de captura. Placas ELISpot são frágeis e devem ser manuseados com cuidado: não é recomendado o uso de uma placa de lavadora automática.
3. O revestimento das cavidades com 10 pi de rato purificada anticorpo anti-humano de captura de IFN-γ diluída em 1x PBS para uma concentração final de 10 ug / ml. Cubra as placas com filme plástico regular e incubar durante a noite a 4 ° C.

2. Bloqueio placas

1. Esvaziar os poços, batendo-os secar e lavar placas 5 vezes com 200 mL de PBS 1x.
2. Encha as cavidades com 200 ul de meio completo RPMI 1640 e incubar as placas durante 2 horas a 37 ° C (passo de bloqueio).
3. Lavar as placas 5 vezes com 200 ul de PBS 1x e manter os poços cheios de PBS 1x até que as células estão prontas a ser revestida.

3. Celular chapeamento e Estimulação

1. Prepare pAs células mononucleares do sangue eripheral (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso humano por centrifugação em gradientes de Ficoll-Paque, utilizando procedimentos padrão. Alternativamente, usando métodos padrão, descongelar alíquotas de PBMC congelados em azoto líquido. Após centrifugação os últimos, ressuspender as células em uma concentração final de 2 x 10 ⁶ células / ml e incubar durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de _CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água.
2. Retirar CMSP da incubadora e ressuspender-los em um volume final de 5 ml de meio completo de RPMI 1640.
3. Incubar de PBMC na presença de 10 ul de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens, durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Retirar uma aliquota de 50 ul de PBMC e misturar-se com 50 ul de corante azul de tripano. Contar as células e avaliar a viabilidade% utilizando um hemocitómetro e exame microscópico (método de exclusão de corante). Vários métodos automatizados para contagem de células e avaliação da viabilidade celular pode alentão ser utilizado. PBMC deve ser> 95% viáveis. Descartar amostra quando a viabilidade for inferior a 95%.
5. Centrífuga PBMC a 700 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (HIS) a uma concentração final de 2 x 10 ⁶ células / ml. Manter a 37 ° C até que as misturas de estimulação são adicionados à placa.
6. Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, 100 uL da mistura de estimulação adequado. Três misturas de estimulação devem ser utilizados como descrito abaixo:
   1. Utilização meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (IHS) como controlo negativo.
   2. Use anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), diluída em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS para uma concentração final de 0,5 ug / ml como controlo positivo).
   3. Use antigénio VZV, sob a forma de um ou outro irradiadas-γ (10.000 Gy, 30 min de tempo de exposição) vivo atenuado da vacina de VZV (unidades formadoras de placa 1350 UFP [] / ml) diluiçãoted a 1:200 em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS) ou 1 ug de uma mistura equimolar de 67 péptidos (15 resíduos de aminoácidos) sintetizados com base na sequência do VZV imediatamente precoce (IE63) fosfoproteína . Controlar a eficácia da irradiação por monitorização da ausência de sinais visíveis de efeitos citopáticos após 4 dias em culturas de CMSP.
   4. Prepare todos os poços em duplicado.
7. Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, a 100 ul de células preparado no passo 5.4 aos poços apropriados. Dois poços devem ser deixados sem células (controle negativo). Incubar durante 20 horas a 37 ° C sob uma atmosfera de _CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. Não agite, mover ou empilhar as placas em cima uns dos outros durante a incubação.

4. Ponto de Desenvolvimento e Detecção

1. Descartar as células e lava-se as placas 10 vezes com 1x de PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ajuda a separar as células que aderiram ao PVDF membrane após incubação durante a noite.
2. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de 0,5 mg / ml biotina conjugado anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (clone 4S.B3) diluído em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA). Incubar as placas durante 2 horas à temperatura ambiente.
3. Lavar os poços 6x com PBST e adiciona cada poço 100 ul de estreptavidina conjugatd com fosfatase alcalina diluído 1:1000 em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de BSA. Cobrir as placas e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
4. Lavar as placas 3x com PBST e 3x com PBS 1x. Adicionar 100 ul de um fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) nitro solução de substrato / azul de cloreto de tetrazólio (NBT) e incuba-se 5 minutos à temperatura ambiente.
5. Lavar as placas com água corrente destilada. Retirar a parte inferior da placa de ELISpot e lavar ambos os lados da membrana, com água destilada. Air secar os pratos.
6. Examinar os poços e enumerar os pontos usando um d estereoscópicomicroscópio issection ou digitalizar as placas utilizando um contador local automatizado. Mantenha as placas ao abrigo da luz, se não podem ser examinados no mesmo dia.
   1. Calcule a média dos números de pontos contados em poços em duplicado correspondentes e subtrai o número de manchas contadas nos poços de controlo negativo (ausência de células) a partir do número de pontos contados em poços de teste.
   2. Expressar a produção de IFN-γ como o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 10 ⁶ PBMC.
   3. Considere-se que as amostras de teste é positivo se o número de SFU é> 50 por 10 ⁶ PBMC e dois desvios padrão (DP) acima do controlo negativo (meio de células + AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS).
   4. Use um valor de 400 SFU por bem quando os pontos são numerosas demais para serem contados.
7. Teste se os dados ELISpot são normalmente distribuídos ou não pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando os dados são normalmente distribuídos, realizar comparações estatísticas utilizando tes t de Studentt (2 grupos) ou ANOVA e pós-teste de Bonferroni (comparações múltiplas). Se os dados não são normalmente distribuídos, use o teste de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (comparações múltiplas).

Resultados

O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV ^4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero ^18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específ...

Discussão

Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados ​​para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) ^24,25, vírus da hepatite C (HCV), ^{26, 27,} e Mycobacterium tuberculosis ^28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.