Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Zusammenfassung

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Zusammenfassung

Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.

Einleitung

Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von ¹ verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV ^4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative Inzidenz von VZV-Erkrankung VZV Krankheit nach 3 Jahren postUCBT 46% ^2. Bei diesen Patienten ist die de novo-Infektion oder Reaktivierung von VZV oft mit viszeralen Verbreitung des zentralen Nervensystems, der Lunge und der Leber ^5-7 verbunden. Als ein Ergebnis, Aciclovir, Valaciclovir oder Famciclovir Prophylaxe wird allgemein UB verwaltetCT-Empfänger ^8,9. Allerdings ist diese Behandlungsstrategie berücksichtigt nicht das Schutzpotential von VZV-spezifischen T-Lymphozyten oder die Kinetik der Wiederherstellung der VZV-spezifischen T-Zellreaktionen. Mögliche Probleme mit der expandierenden Verwendung von langfristigen Prophylaxe antiherpetischen verbunden sind, umfassen: a) Patientenübertherapie; b) die Entwicklung von antiviralen Medikamentenresistenz ^10,11; und c) Wertminderung von VZV-spezifische Immun Rekonstitution ^12,13. Weil Erkennung von Funktions VZV-spezifischen T-Lymphozyten korreliert mit der Anwesenheit von langfristigen Schutz von VZV-Infektion und verbesserte klinische Ergebnis ^4,14,15, Monitoring-Zell-vermittelten Immunantwort gegen VZV gerichteten während der Posttransplantationsphase könnte in einer rationelleren Verwendung von antiviralen führen Behandlung, indem Ärzte, Patienten, die von VZV-Prophylaxe profitieren würden, unterscheiden sich von denen, deren Immunsystem ist in der Lage zu kontrollieren VZV-Replikation ^4,13.

Die IFN-γ ELISPOT-Assay wird häufig für die Überwachung zellvermittelte Immunreaktionen in einer Vielzahl von experimentellen Systemen und klinischen Bedingungen verwendet. Punkte werden durch die Spaltung eines chromogenen Substrat erzeugt, wodurch ein sichtbarer Niederschlag und stabil an der Stelle der Reaktion. Jeder Spot stellt damit den Platzbedarf eines einzelnen Zytokin-produzierenden Zelle. IFN-γ ELISPOT misst nicht nur die Fähigkeit der einzelnen Zellen ex vivo IFN-γ in Antwort auf in vitro-Stimulation mit verwandten Antigen produzieren, sondern es stellt auch eine Abschätzung der Frequenz des reagierenden Zellen in einer gegebenen Zellpopulation ^16,17. Zusätzlich zu seiner hohen Empfindlichkeit, IFN-γ ist ELISpot unkompliziert durchzuführen, wodurch ihre Anwendung im Rahmen der personalisierten klinische Protokolle zu lenken Beginn oder nach Absetzen der antiviralen Behandlung richtet möglich. Das Verfahren unter describ detailliertes ein ELISpot Assay, der speziell entwickelt wurde, um durch periphere mononukleare Blutzellen erkennen und messen die Produktion von IFN-γ nach in vitro Stimulation mit VZV-Antigenen abgeleitet.

Protokoll

Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethik Institutional Review Board von CHU Sainte-Justine in Montreal, Quebec, Kanada, wo die Studie durchgeführt wurde genehmigt. Informierte Zustimmung wurde gesucht und von allen Studienteilnehmern, deren Eltern oder Erziehungsberechtigten erhalten. Alle Verfahren durchgeführt an den Tagen 1 und 2 müssen unter sterilen Bedingungen (dh unter einem Abzug mit laminarer Strömung) durchgeführt werden. Standard-Sicherheitsvorkehrungen im Umgang mit menschlichem Blut sollte unbedingt beachtet werden.

1. Beschichtung der Platten

1. Permeabilisieren Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen an der Unterseite 96 sowie IP-Multiscreen-Platten weiße ELISpot, indem zu jedem Well 20 &mgr; l 35% Ethanol für 1 min. Membranen sollten leicht durchscheinend geworden.
2. Sofort die Wells 3-mal mit 200 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) mit einem mulChannel-Pipette oder einer ähnlichen Einrichtung. Dieser Schritt ist wichtig, dass Ethanol gegeben Rückstände können die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen und Bindung von Capture-Antikörper. ELISpot Platten sind empfindlich und sollte sorgfältig behandelt werden: die Verwendung eines automatisierten Plattenwasch wird nicht empfohlen.
3. Beschichtung der Vertiefungen mit 10 &mgr; l gereinigtem Maus-Anti-Human-IFN-γ-Capture-Antikörper in 1 × PBS auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml verdünnt. Decken Sie die Platten mit regelmäßigen Plastikfolie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C

2. Sperrplatten

1. Leeren Sie den Brunnen, tippen sie trocken, und waschen Platten 5 mal mit 200 ul 1x PBS.
2. Füllen der Vertiefungen mit 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium und Inkubation Platten für 2 Stunden bei 37 ° C (Blockbildungsschritt).
3. Waschen Sie die Platten 5x mit 200 ul 1x PBS und halten die Brunnen voller 1x PBS, bis die Zellen bereit sind, beschichtet werden.

3. Überzug und Zellstimulation

1. Bereiten peripheral mononukleare Blutzellen (PBMC) aus menschlichen Blutproben durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque-Gradienten unter Verwendung von Standardverfahren. Alternativ kann unter Verwendung von Standardverfahren, auftauen Aliquots von PBMC unter flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach der letzten Zentrifugation Die Zellen in einer Endkonzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml beimpft und über Nacht bei 37 ° C unter einer 5% CO _{2-Atmosphäre} in einem Wassermantel-Inkubator.
2. Entfernen PBMC aus dem Inkubator und resuspendieren sie in einem Endvolumen von 5 ml vollständigem RPMI-1640-Medium.
3. Inkubieren PBMC in Gegenwart von 10 ul gentechnisch Endonuklease aus Serratia marcescens für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie ein 50 ul Aliquot PBMC und mit 50 ul Trypanblau mischen. Zählen von Zellen und schätzen% Lebensfähigkeit mit einem Hämocytometers und mikroskopische Untersuchung (Farbausschlussmethode). Verschiedene automatisierte Verfahren zur Zellzählung und Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen kann also verwendet werden. PBMC sollte> 95% lebensfähig. Entsorgen Probe, wenn die Lebensfähigkeit unter 95% liegt.
5. PBMC Zentrifuge bei 700 × g für 5 Minuten, Verwerfen Standes und Resuspension Zellen in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (HIS) ergänzt war, bei einer Endkonzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml. Halten bei 37 ° C bis zur Stimulation Mischungen werden auf die Platte gegeben.
6. In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul der geeigneten Stimulations Mischung. Drei Stimulations Mischungen verwendet, wie unten beschrieben:
   1. Verwendung AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (IHS) als Negativkontrolle ergänzt.
   2. Verwenden monoklonalen Anti-CD3-Antikörper (Klon OKT3) in AIM-V-Medium verdünnt, mit 2% (v / v) ergänzt IHS zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml als positive Kontrolle).
   3. VZV-Antigen zu verwenden, in der Form von entweder γ-bestrahlten (10.000 Gy, 30 min Belichtungszeit) attenuierte VZV-Impfstoff (1.350 Plaque-bildende Einheiten [pfu] / ml) Verdünnungsted 1:200 in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) IHS) oder 1 &mgr; g einer äquimolaren Mischung von 67 Peptiden (15 Aminosäurereste), synthetisiert auf Basis der Sequenz des VZV unmittelbar frühen (IE63) ergänzt Phosphoprotein . Steuerung Bestrahlung durch Überwachen der Wirksamkeit ohne sichtbare Anzeichen von zytopathischen Wirkungen nach 4 Tagen in PBMC-Kulturen.
   4. Bereiten Sie alle Brunnen in zweifacher Ausfertigung.
7. In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul Zellen in Schritt 5.4 in die entsprechenden Vertiefungen hergestellt. Zwei Brunnen sollte ohne Zellen (Negativkontrolle) überlassen werden. Inkubation für 20 Stunden bei 37 º C unter einer 5% CO _{2-Atmosphäre} in einem Wassermantel-Inkubator. Nicht schütteln, verschieben oder stapeln Sie die Platten auf einander während der Inkubation.

4. Spot-Entwicklung und-Erkennung

1. Entsorgen Sie die Zellen und waschen die Platten 10x mit 1x PBS, ergänzt mit 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hilft lösen Zellen, die PVDF mir anhaftenmbrane folgenden Inkubation über Nacht.
2. Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit 100 ul 0,5 mg / ml Biotin-konjugiertem Anti-IFN-γ monoklonalen Antikörper (Klon 4S.B3) in 1x PBS, enthaltend 0,5% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA). Inkubation erfolgt für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Vertiefungen 6x mit PBST und fügen Sie jedem gut 100 ul Streptavidin conjugatd mit alkalischer Phosphatase 1:1000 verdünnt in 1x PBS mit 0,5% (w / v) BSA. Die Platten abdecken und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Platten 3x mit PBST und 3x mit 1x PBS. 100 l einer 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) / Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)-Substrat-Lösung, Inkubation 5 min bei Raumtemperatur.
5. Unter fließendem destilliertem Wasser waschen die Teller. Entfernen Sie den unteren Teil des ELISpot Platte und waschen Sie beide Seiten der Membran mit destilliertem Wasser. Luft trocknen die Platten.
6. Untersuchen Sie die Brunnen und die Punkte aufzählen, mit einem stereoskopischen dissection Mikroskop oder scannen die Platten mit Hilfe eines automatisierten Punktzähler. Halten Sie die Platten weg vom Licht, wenn sie nicht am selben Tag untersucht werden.
   1. Der Mittelwert der Anzahl von Flecken in entsprechenden doppelten Vertiefungen gezählt und subtrahiert die Anzahl von Punkten in der negativen Kontrollvertiefungen gezählt (keine Zellen) von der Anzahl der Punkte in den Testvertiefungen gezählt.
   2. IFN-γ Express Produktion wie die Anzahl der spot-bildenden Einheiten (SFU) pro 10 ⁶ PBMC.
   3. Bedenken Sie, dass Proben sind positiv, wenn die Anzahl der SFU> 50 pro 10 ⁶ PBMC und 2 Standardabweichungen (SD) über der Negativkontrolle (Zellen + AIM-V-Medium mit 2% (v / v) ergänzt IHS).
   4. Verwenden Sie einen Wert von 400 pro SFU gut, wenn zu viele Punkte zu zählen sind.
7. Testen Sie, ob ELISpot Daten normal verteilt sind oder nicht mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen statistische Vergleiche mit Student-t-test (2 Gruppen) oder ANOVA und der Bonferroni Post-Test (multiple Vergleiche). Wenn die Daten nicht normalverteilt sind, verwenden Sie den Mann-Whitney-U-Test (2 Gruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test und Dunn Post-Test (multiple Vergleiche).

Ergebnisse

Die IFN-γ ELISPOT-Protokoll oben beschrieben entwickelt wurde und in unserem Labor optimiert, um das Ausmaß und die Qualität der zellvermittelten Immunreaktionen gegen VZV ⁴ gerichtet messen. Verschiedenen Quellen der VZV-Antigen zur Stimulation Schritt verwendet werden. Dazu gehören: a) im Handel erhältlich Waschmittel inaktiviert Auszüge aus VZV-infizierten Vero-Zellen ^18; b) Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die aus spezifischen VZV kodierten Proteine, einschließlich IE63 <...

Diskussion

Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), ^24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) ²⁶ gerichtet zu ^{untersuchen, 27, 28,29} und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.