Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Resumen

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Resumen

Varicela zoster (VZV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante de sangre de cordón umbilical (UCBT). Por esta razón, la profilaxis antiherpético se administra sistemáticamente a los destinatarios UCBT pediátricos para prevenir complicaciones asociadas con la infección por VZV, pero no existe un consenso fuerte, basada en la evidencia que define su duración óptima. Debido a inmunidad mediada por células T es responsable para el control de la infección por VZV, la evaluación de la reconstitución de respuestas de células T específicas de VZV siguiente UCBT podría proporcionar indicaciones en cuanto a si la profilaxis deben ser mantenidas o pueden ser interrumpidos. Para este fin, un interferón gamma específica de VZV (IFN-γ) inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) ensayo fue desarrollado para caracterizar la producción de IFN-γ por los linfocitos T en respuesta a la estimulación in vitro con la vacuna de VZV viva atenuada irradiado. Este ensayo proporciona una medición rápida, reproducible y sensible de VZV C específicaELL inmunidad adecuada para el seguimiento de la reconstitución de la inmunidad específica de VZV en un entorno clínico y la evaluación de la respuesta inmune a los antígenos de VZV mediada.

Introducción

Por primera vez en 1989, UCBT se utiliza cada vez más como parte del tratamiento de diversos trastornos de la sangre neoplásicas y no neoplásicas en niños ^1. VZV es un herpesvirus alfa humana citopático que hace que dos enfermedades diferentes de la varicela, (después de la infección primaria) y el herpes zóster (después de la reactivación). Después de la infección primaria, el VZV persiste durante toda la vida del huésped protegida dentro de los nervios sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. Una de las complicaciones infecciosas más amenazantes siguientes UCBT se asocia con VZV ^2-4. En nuestro centro clínico, en ausencia de profilaxis VZV, la incidencia acumulada de la enfermedad por VZV enfermedad VZV a los 3 años fue del 46% postUCBT ^2. En estos pacientes, la infección de novo con o reactivación de VZV se asocia a menudo con la difusión visceral al sistema nervioso central, pulmones y el hígado ^5-7. Como profilaxis resultado, aciclovir, valaciclovir o famciclovir se administra comúnmente UBDestinatarios CT ^8,9. Sin embargo, esta estrategia de tratamiento no tiene en cuenta el potencial de protección de VZV linfocitos T específicos o la cinética de la reconstitución de las respuestas de células T específicas para VZV. Los problemas potenciales asociados con la expansión del uso de la profilaxis a largo plazo incluyen antiherpéticos a) sobretratamiento paciente; b) el desarrollo de resistencia a los medicamentos antivirales ^10,11; y c) el deterioro de VZV reconstitución inmune específica ^12,13. Dado que la detección de linfocitos T funcionales específicos de VZV se correlaciona con la presencia de la protección a largo plazo de la infección por VZV y el resultado clínico mejorado ^4,14,15, el seguimiento de células mediada por las respuestas inmunes dirigidas contra VZV durante el período después del trasplante podría dar lugar a un uso más racional de antivirales tratamiento al permitir a los médicos a distinguir a los pacientes que se beneficiarían de VZV profilaxis de aquellos cuyo sistema inmunológico es capaz de controlar la replicación del VZV ^4,13.

El ensayo ELISPOT de IFN-γ se utiliza ampliamente para las respuestas inmunes mediadas por células de vigilancia en una variedad de sistemas experimentales y las condiciones clínicas. Las manchas se generan después de la escisión de un sustrato cromogénico, la generación de un precipitado visible y estable en el sitio de la reacción. Cada foco de ese modo representa la huella de una célula productoras de citoquinas individuales. IFN-γ ELISPOT no sólo mide la capacidad de las células individuales ex vivo para producir IFN-γ en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno afín, sino que también proporciona una estimación de la frecuencia de responder las células en una población de células dada ^16,17. Además de su alta sensibilidad, IFN-γ ELISPOT es sencillo de realizar, haciendo su uso posible en el contexto de protocolos clínicos personalizados destinados a guiar la iniciación o el cese del tratamiento antiviral. El procedimiento se detalla a continuación describiendoES un ensayo ELISPOT que está diseñado específicamente para detectar y medir la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica después de la estimulación in vitro con antígenos de VZV derivados.

Protocolo

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canadá, donde se realizó el estudio. El consentimiento informado se solicitó y obtuvo de todos los participantes en el estudio, sus padres o tutores legales. Todos los procedimientos realizados en los días 1 y 2 deberán llevarse a cabo en condiciones estériles (es decir, bajo una campana de flujo laminar). Procedimientos de seguridad estándar para la manipulación de sangre humana deben ser estrictamente observados.

1. Recubrimiento de las placas

1. Permeabilizar las difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en la parte inferior de 96 y placas de ELISPOT blanco MultiScreen IP mediante la adición a cada pocillo 20 l de etanol 35% durante 1 min. Las membranas deben hacerse ligeramente translúcida.
2. Inmediatamente lavar los pocillos 3 veces con 200 l de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) utilizando un multichannel pipeta o un dispositivo similar. Este paso es fundamental, dado que los residuos de etanol pueden afectar la viabilidad celular y la unión del anticuerpo de captura. Placas ELISpot son frágiles y deben manejarse con cuidado: no se recomienda el uso de un lavador de placas automatizado.
3. Recubrir los pocillos con 10 l de ratón purificada anticuerpo de captura de IFN-γ anti-humano diluido en 1x PBS a una concentración final de 10 mg / ml. Se cubren las placas con una envoltura de plástico normal y se incuba durante la noche a 4 ° C.

2. Placas de bloqueo

1. Vaciar los pocillos, tocándolos seco, y lavar las placas 5 veces con 200 l de PBS 1x.
2. Llenar los pocillos con 200 l de medio completo RPMI 1640 y se incuban las placas durante 2 horas a 37 ° C (el bloqueo de paso).
3. Lavar las placas 5x con 200 l de 1x PBS y se mantienen los pozos llenos de 1x PBS hasta que las células están listas para ser chapada.

3. Plating celular y estimulación

1. Preparar pcélulas mononucleares de sangre eripheral (PBMC) a partir de muestras de sangre venosa humana por centrifugación en gradientes de Ficoll-Paque utilizando procedimientos estándar. Por otra parte, el uso de métodos estándar, descongelar alícuotas de PBMC congelados en nitrógeno líquido. Después de los últimos centrifugación, las células se resuspenden a una concentración final de 2 x 10 ⁶ células / ml y se incuba durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de _CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua.
2. Eliminar PBMC de la incubadora y resuspender en un volumen final de 5 ml de medio RPMI 1640 completo.
3. Incubar las PBMC en presencia de 10 l de endonucleasa de ingeniería genética a partir de Serratia marcescens durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Quitar una alícuota de 50 l de PBMC y mezclar con 50 l de colorante azul de tripano. Contar las células y estimar% de viabilidad usando un hemocitómetro y el examen microscópico (método de exclusión del colorante). Varios métodos automatizados para el recuento de células y la evaluación de la viabilidad celular puede colpor lo que se utilizará. PBMC debe ser> 95% viables. Desechar la muestra cuando la viabilidad es más baja que 95%.
5. Centrífuga de PBMC a 700 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y volver a suspender las células en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (SU) a una concentración final de 2 x 10 ⁶ células / ml. Mantener a 37 ° C hasta que se agreguen las mezclas de estimulación a la placa.
6. Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de la mezcla de la estimulación apropiada. Tres mezclas de estimulación deben ser utilizados como se describe a continuación:
   1. Uso medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (IHS) como control negativo.
   2. Use anticuerpo anti-CD3 monoclonal (clon OKT3) diluido en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS a una concentración final de 0,5 mg / ml como control positivo).
   3. Utilice antígeno de VZV, en la forma de cualquiera de γ-irradiados (10.000 Gy; 30 min de tiempo de exposición) vivo atenuado de la vacuna de VZV (1350 unidades formadoras de placas [PFU] / ml) diluciónTed 1:200 en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS) o 1 g de una mezcla equimolar de 67 péptidos (15 residuos de aminoácidos) sintetizado basado en la secuencia de la VZV inmediatamente temprano (IE63) fosfoproteína . Controlar la eficacia de la irradiación mediante el control de la ausencia de signos visibles de efectos citopáticos después de 4 días en cultivos de PBMC.
   4. Preparar todos los pocillos por duplicado.
7. Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de células preparadas en el paso 5.4 a los pocillos apropiados. Dos pozos deben dejarse sin células (control negativo). Incubar durante 20 horas a 37 º C en una atmósfera de _CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua. No agitar, mover o colocar las placas en la parte superior de uno al otro durante la incubación.

4. Punto de Desarrollo y Detección

1. Desechar las células y lavar las placas 10 veces con 1x PBS suplementado con 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ayuda a desprender las células que se han adherido a la PVDF mímbrane después de la incubación durante toda la noche.
2. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de 0,5 mg / ml de biotina conjugado anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ (clon 4S.B3) diluida en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA). Incubar las placas durante 2 horas a temperatura ambiente.
3. Lavar los pocillos 6x con PBST y añadir cada pocillo 100 l de conjugatd estreptavidina con fosfatasa alcalina diluido 1:1.000 en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de BSA. Cubrir las placas e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Lavar las placas 3 veces con PBST y 3 veces con 1 × PBS. Añadir 100 l de un fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) solución de sustrato / cloruro de nitro azul tetrazolio (NBT) e incubar 5 min a temperatura ambiente.
5. Lave los platos bajo el chorro de agua destilada. Retire la sección inferior de la placa de ELISPOT y lavar ambos lados de la membrana con agua destilada. Secar las placas.
6. Examinar los pozos y enumerar las manchas utilizando un d estereoscópicamicroscopio issection o escanear las placas utilizando un contador punto automatizada. Mantener las placas protegidas de la luz, si no pueden ser examinados en el mismo día.
   1. La media de los números de manchas contadas en pocillos duplicados correspondientes y restar el número de manchas contadas en los pocillos de control negativo (sin células) desde el número de manchas contadas en los pocillos de ensayo.
   2. Expresar la producción de IFN-γ como el número de unidades formadoras de puntos (SFU) por 10 ⁶ PBMC.
   3. Tenga en cuenta que las muestras de la prueba son positivos si el número de SFU es> 50 por 10 ⁶ PBMC y 2 desviaciones estándar (SD) por encima del control negativo (células + medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS).
   4. Utilice un valor de 400 SFU por pozo cuando las manchas son demasiado numerosos para ser contados.
7. Comprobar si los datos ELISpot normalmente se distribuyen o no mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Cuando los datos se distribuyen normalmente, realizar comparaciones estadísticas mediante la t de Student test (2 grupos) o ANOVA y el post-test de Bonferroni (comparaciones múltiples). Si los datos no se distribuyen normalmente, utilice la prueba de Mann-Whitney U (2 grupos) o la prueba de Kruskal-Wallis y post-test de Dunn (comparaciones múltiples).

Resultados

El protocolo de ELISPOT de IFN-γ se detalla más arriba fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio para medir la magnitud y la calidad de las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra VZV ^4. Diversas fuentes de antígeno de VZV se pueden utilizar para la etapa de estimulación. Estos incluyen: a) de detergente disponible comercialmente extractos inactivadas de VZV infectaron células Vero ^18; b) piscinas de péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de VZV codificad...

Discusión

Modificaciones y solución de problemas: los ensayos de IFN-γ ELISPOT se han utilizado para examinar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra una variedad de patógenos microbianos, incluyendo virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) ^24,25, virus de la hepatitis C (VHC) ^{26, 27,} y Mycobacterium tuberculosis ^28,29, sólo para nombrar unos pocos. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo ELISPOT IFN-γ para medir la inmunidad celular contra, con ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.