酵母核内体系统的超微结构分析的纳米金标记

摘要

酵母， 酿酒酵母 ，一直是一个关键模式生物识别和研究基因调节内体系统的生物合成和功能。在这里，我们提出了内体车厢的超微结构研究特定的标签一个详细的协议。

摘要

内涵体是主要的膜排序在真核细胞中的检查点中的一个和它们调节回收的蛋白质或毁坏大多从质膜和高尔基体。其结果是内体系统在维持细胞稳态中发挥中心作用，并在属于该网络的细胞器通过小泡运输相互连接的基因的突变，引起严重的病症，包括癌症和神经生物学障碍。因此，黄金的相关性是理解内涵体系统的生物合成和组织相关的机制。 酿酒酵母中一直举足轻重的完成这项任务。要明确标示，并在超微结构水平这一​​模式生物的内体系统的分析，我们在座的带正电荷的纳米金摄取原生质其次是这些粒子通过银增强反应可视化的详细协议。这种方法也是一种宝贵的太l适用于与内体运输缺陷突变体的形态学检查。此外，它不仅适用于超微结构检查，但它也可与免疫标号用于蛋白质定位的调查相结合。

引言

内体系统中起着至关重要的多种细胞的作用包括贩运溶酶体酶分选受体和质膜（PM）的回收受体^1,2的主要膜分拣设备。内涵体被划分在三个不同的车厢， 即 。在早期内涵体（EE），晚期内涵体（LE）和回收内涵体。这种分类是基于它需要的内吞物质到达他们，对特定的标记蛋白，并且在其形态的时间。膜， 即蛋白质和脂质双层，从PM内在设计可以通过内体输送到溶酶体中降解或再循环回。膜也被输送到内涵体从高尔基体，同样，要么继续溶酶体或检索返回到高尔基体。此外，蛋白质可以分为管腔囊泡从内体界膜，这一过程导致形成向内出芽子类别LE时，多泡体。

酵母胞内体系统是相对较不复杂的较高的真核细胞中的一个。酵母胞内体分为EE和LE。相反，哺乳动物细胞中不含有回收内涵体，而且组织特异性溶酶体相关细胞器。因此，他们有一个不太复杂的内体的贩运路线^3,4的网络。因此，酵母曾代表仍然表示一个有利的实验系统，研究一些基础原则膜交通的内体系统。这个优点是通过以下事实，涉及该内体途径的许多基因已被初步分离与遗传筛选在酵母⁵强调。 而酵母胞内体系统中的野生型和突变的细胞已被广泛采用的生化和荧光显微镜方法的研究，其在超微结构水平调查至今只有最小的。形态分析是特别相关的酵母，因为大部分核内体的细胞器被检测为通过荧光显微镜圈点结构，这使得他们难以明确识别^6。不幸的是抗血清仅有限数量识别酵母胞内蛋白标志物是工作在免疫电子显微镜（IEM）制剂^7-10。对于一些蛋白质，这个问题已经绕过由感兴趣的基因的内源性标记和使用的抗体识别，检测它^7,11,12和标签。然而，通常蛋白是因为它们的低表达水平的检测不到的IEM。他们的表达是不是一个解决方案，因为这种方法可以诱导误本地化和/或改建中的细胞器形态/功能。因此，内吞区室中与探针可检测通过电子显微镜EM标签是一种有效的选择。这是特别是如果一个最优解的公关OBE是进入细胞内吞途径中以时间依赖性方式，它允许知道什么时候会标记一个特定的细胞器^6。

带正电荷的纳米级金的酵母原生质球（ 即 ，酵母，其中细胞壁已酶促去除）的摄取已经被成功地用于识别酵母胞内隔室^10。这些颗粒牢固结合到带负电荷的脂质构成的生物膜。因此，带正电荷的纳米级金的联系人与PM，穿透细胞通过内吞作用和通过EE和LE到达液泡之前。这些小的金颗粒，但是，没有一个合适的尺寸由EM待观察。以使它们可见，它们的大小可通过化学反应，导致银或金的周围的黄金探测器^13-15的沉积被放大。我们已经开发并成功应用的IEM方法的基础上，得安方法来执行的亚细胞定位研究^8,16。这种方法允许进行酵母制剂免疫标记与形态^8,17-24一个出色的分辨率。我们还建立了一个程序结合本IEM协议与酵母核内体系统的纳米金标记舱^6。使用这种方法，我们已形态学特征内涵体的不同亚类和超微结构研究突变体与内体运输缺陷^6,25。此外，我们已经证明，这种纳米金标记可以与免疫标号提供探索对不同亚群内体目标蛋白的分布的可能性相结合。在这里，我们介绍如何在酵母核内体系统的带正电的纳米金标记实际上是执行。

研究方案

1，原生质球的制备

1. 过夜孵育的酵母在30℃下在10毫升的实验设计来确定适当的介质中。
2. 一天后，用光度计测定培养物的光密度在600nm（OD _600），在相同的培养基稀释细胞至OD ₆₀₀为0.2-0.4，并将它们生长至指数生长期除非的设计实验需要不同的条件。细胞处于指数生长期时，培养具有OD ₆₀₀为1-2。
3. 收集离心10 OD ₆₀₀细胞等价物，在3,500 xg离心5分钟，在50毫升的试管。离心后，弃上清。
4. 重悬细胞沉淀在5毫升100毫摩尔PIPES（pH 9.6）中，10 mM的二硫苏糖醇温育于30℃下10分钟。
5. 通过离心再次收集细胞，在3,500 xg离心5分钟。弃上清。
6. 悬浮细胞我ñ5毫升培养基（由实验的​​设计确定）含1M山梨醇和5mg溶解酶，并在30℃孵育混合物，轻轻摇动30分钟。
7. 离心细胞悬浮液以300×g离心5分钟，收集沉淀级分，其对应于球状体。弃上清。
8. 重悬原生质球在960微升冰冷的培养基（培养基由实验的设计确定）含1M山梨糖醇，将混合物转移至冰冷的2 ml离心管。

2，吸收纳米金

1. 使用移液管，轻轻混合的原生质球用4纳摩尔再悬浮于40μl水中带正电的纳米金颗粒。该混合物的终体积必须为1毫升。
2. 放置在冰上将得到的细胞悬浮液15分钟。
3. 转移的悬浮液在室温下孵育它为所需要的时间，以允许内化纳米金通过电子邮件ndocytosis。
   注:一个5分钟的摄取将主要导致内吞囊泡和早期内涵体室的标签，而15分钟的摄取将允许标记整个内体系统（早期和晚期内涵体）。潜伏期较长时间（超过30分钟）也将允许标注液泡。
   注:脉冲追踪标记实验中不能用这种方法进行的。因此，LE的分析标记时，纳米金也将在下午和INEE发现。

3，固定和切片

1. 加入1 ml的双重强度固定液停止纳米金摄取[4％多聚甲醛（PFA），0.4％的戊二醛（GA）在0.1M PHEM缓冲液（20mM PIPES，50mM的HEPES，pH值6.9，20mM的EGTA，4毫摩尔MgCl _2）]含1M山梨醇在细胞悬浮液。保持在管中于室温下进行。
2. 在30分钟轻轻手动反转micocentrifuge管数次（这将允许保持在原生质球悬浮液），然后离心两次在1700×g离心25秒。
3. 通过丢弃上清，加入1ml新鲜的标准强度固定液（2％PFA中，0.2％GA在0.1M PHEM缓冲液）含有1M山梨糖醇，孵育2小时，在室温下在缓慢旋转轮更换固定液。
4. 如前面所述⁶处理细胞冷冻切片。注:对于吸收纳米金，银增强程序，在指定的协议描述的周期性酸处理并没有被执行。周期性酸处理是为了更好地透化细胞壁^26，但这种结构也球状体的生成过程中被消除。
5. 切50nm的薄的冷冻切片在-120℃下干燥钻石刀使用UCT超薄切片机如前所述^8，并将其放置在涂福尔瓦碳50啮合镍网格。

4，银增强的纳米金粒子Visualization

注意:要准备反应混合物中的程序基本上是由制造商所指示的之一。使用此协议的实际适应性，使得银增强程序，有效和可靠的冰冻切片。

1. 从冰箱中取出银增强套件和解冻它在37℃培养箱或水浴。解冻时，将试剂盒在24℃培养箱放置到一个黑暗的房间里，直到使用（见4.7）。
2. 将加热板在黑暗的房间，并加热到24℃，终温
3. 覆盖加热板的顶部表面的保护，有光泽的一面朝上，并用胶带将其固定。
4. 将封口膜对Benchkote并标记边缘用黑色标记，以能够看到的封口膜边在黑暗中。
5. 磁带上的​​Benchkote顶部的温度计监测加热板的温度。逐步调整温度，如果不是24°C。
6. 解放军CE上的50ml管中用双蒸水和内部的银增强试剂盒。
7. 填充小培养皿用双蒸水，预加热至37℃。放置在网格中的水，试样面朝下，持续30分钟。
8. 重复此4.7步一个更多的时间。
9. 传送网格，储物箱，将他们的黑暗的房间。
10. 由上几滴双蒸水在24℃下放置于封口膜已被固定在加热板传递它们（与试样的一面朝下）再次冲洗的网格。
11. 确保9个附加双蒸水滴准备上的封口膜，用于冲洗的银增强反应后。
12. 关灯，并确保所有灯都熄灭。打开红灯。
13. 取出从24℃培养箱中银增强试剂盒的A和B的解决方案。
14. 把第一个6滴溶液中，然后加入6滴乙溶液在1.5米升微量离心管中，并用玻璃巴斯德吸管，避免使气泡拌匀。该解决方案是很厚，它有手动，最后才涡旋它简单地用吸管混合。
15. 把A和B的解决方案早在24℃培养箱中培养，并采取了C溶液。
16. 加入6滴了C解决了A / B混合。然后先混合再一次用巴氏吸管，然后通过涡旋，避免气泡。
17. 通过将滴（〜20微升/滴）上的封口膜立即使用最终混合物。
18. 用干净，防磁镊子，将网格的混合物（ 如 。，银增强反应）为6〜15 min，取决于希望得到增强（ 即 ，大小的金粒）的。
19. 从混合物中取出电网，并通过他们的双蒸水的顶部下降在24℃下洗涤。首先，在使用快速连续6滴，然后3滴，每滴7分钟孵育时间，开灯之前。
20. 继续下一个步骤，以可视化的结果为EM调查或者免疫金标或膜染色^27。

结果

根据所提出的协议，酵母核内体系统的形态可以是由接入传输的EM。 图1显示了不同类型的内体区室中已达成，因此，标记的纳米金。银增强纳米金可以清楚地看到作为电子致密颗粒。建立了银增强反应的最佳设置允许具有在5至15纳米，不与酵母细胞的超微结构的干扰之间的均匀粒度范围的金颗粒。质膜以及早期内涵体车厢都可以访问的纳米金5分钟孵化在24°C（ 图1A）后?...

讨论

免疫电子显微术是一种技术，它允许结合蛋白的定位与在这些蛋白质所在的载体和细胞器的超微结构分辨率。研究了酵母核内体系统时，因为它的车厢出现点状结构，在荧光显微镜中，这一点尤其重要。因此它是难以区分它们。由于这个原因，用一个探针通过EM检测并输入的内吞途径中一个时间依赖的方式是非常重要的特异性标记不同内涵体。这种类型的探针是有价值的，以评估细胞内吞作用^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germany	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germany	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2.6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitol	Sigma, St louis, MO	S1876
Positively charged Nanogold	Nanoprobes, Yaphank, NY	2022	store at -20 ̊C
HQ-silver™ enhancement kit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	store at -20 ̊C
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldehyde 8% EM grade	Polyscience, Inc. , Warrington, PA	216	store at 4 ̊C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	store at 4 ̊C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	G209N
Cryo-immuno diamond knife 35 º	Diatome AG, Biel, Switzerland	N.A.
UCT ultramicrotome	Leica, Solms, Germany	N.A.
Formvar 15/95 resine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15800
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Grids storage box	Leica, Solms, Germany	162-50
Falcon 100mmx15mm petri dishe	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands	10216234
1.5 ml microcentrifuge	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
50 ml tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands	210296
Benchkote surface protector	Whatman, Maidstone, United Kingdom	1159201