Нанозолото Маркировка из дрожжей эндосомных системы для Ультраструктурные Анализы

Резюме

Дрожжи, Saccharomyces CEREVISIAE, является одним из ключевых модельный организм для выявления и изучения генов, регулирующих биогенез и функции системы эндосомный. Здесь мы представляем подробный протокол для конкретного маркировке эндосомных отсеков для ультраструктурных исследований.

Аннотация

Эндосомы являются одним из основных мембраны сортировки контрольно-пропускные пункты в эукариотических клетках и регулируют утилизацию или уничтожение белков в основном из мембраны плазмы и Гольджи. В результате система эндосомный играет центральную роль в поддержании гомеостаза клетки, и мутации в генах, принадлежащих к этой сети органелл, соединенных между собой везикулярного транспорта, вызвать серьезные патологии, включая рак и нейробиологических расстройств. Поэтому первостепенное значение для понимания механизмов, лежащих в основе биогенеза и организацию системы эндосомный. Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE уже сыграли ключевую роль в решении этой задачи. Чтобы специально маркировать и анализировать на ультраструктурном уровне в эндосом систему этого модельного организма, мы представляем здесь подробный протокол для положительно заряженной поглощения Нанозолото по сферопластов последующим визуализации этих частиц через реакции повышения серебра. Этот метод также является ценным слишкомл для морфологического исследования мутантов с дефектами торговли эндосомный. Кроме того, он применим не только для ультраструктурных экзаменов, но он также может быть объединена с immunogold маркировок для локализации белка исследований.

Введение

Система эндосомный является одним из основных мембрана сортировка аппарат, который играет несколько важных клеточных функций, включая торговлю лизосомальных ферментов сортировки рецепторов и утилизации мембране (PM) рецепторов ^1,2. Эндосомы делятся в трех различных отсеков, то есть. ранние эндосомы (EE), поздние эндосомы (LE) и эндосомы утилизации. Эта классификация основана на время, необходимое для эндоцитарных материала для их достижения, на конкретных маркерных белков и их морфологии. Мембраны, то есть белковые и липидные бислои, интернализованные от премьер-министра может быть либо доставлен лизосом через эндосомах деградации или быть возвращен. Мембраны также транспортируется в эндосомах от Гольджи и, аналогично, либо продолжать лизосом или быть получены обратно в Гольджи. Кроме того, белки можно разделить на просвета пузырьков начинающим внутрь от эндосомный ограничения мембраны, процесс, который приводит к образованиюподкатегория LE, то мультивезикулярные органы.

Система эндосом дрожжи относительно менее сложным, чем у высоких эукариотических клетках. Дрожжи эндосомы делятся на ЭО и LE. В отличие от клеток млекопитающих они не содержат переработки эндосомы, но и тканеспецифические лизосомы, связанных с органеллы. Следовательно, они имеют менее сложную сеть маршрутов эндосомных торговли людьми ^3,4. Поэтому дрожжи представлял и до сих пор представляет собой выгодное экспериментальной системы для изучения некоторых из принципов, лежащих мембраны трафика в системе эндосомный. Это преимущество подчеркивается тем фактом, что многочисленные гены, участвующие в эндосомных путей были первоначально изолированных с генетическими экранах в дрожжах ^5. В то время как система эндосомный дрожжи в дикого типа и мутантных клеток была тщательно изучена с помощью биохимических и флуоресцентных подходы микроскопии, ее исследование в ультраструктурном уровне только былминимальным. Морфологические анализы особенно актуальны в дрожжах, потому что большинство эндосомных органелл определяются как знаки препинания структур с помощью флуоресцентной микроскопии, которые делают трудным их Однозначная идентификация ^6. К сожалению, только ограниченное число антисыворотками признавая белковых маркеров дрожжи эндосомные работает в иммуно-электронной микроскопии (IEM) препараты ^7-10. Для некоторых белков, эта проблема была преодолена путем эндогенного мечения интересующего гена и использование антитела, распознающего тег, чтобы обнаружить его ^7,11,12. Часто, однако, белки не обнаруживается IEM из-за их низкого уровня экспрессии. Их экспрессия не является решением, потому что такой подход может вызвать неправильное локализации и / или изменения в органелл морфологии / функций. Таким образом, маркировка из эндоцитотических отсеков с зондом обнаруживаемых с помощью электронной микроскопии EM является эффективным методом. Это оптимальное решение, особенно если пр.ОБЕ входит в эндоцитического маршрут в зависимости от времени, что позволяет узнать, когда это будет означать определенную органеллу ^6.

Поглощение положительно заряженного нанозолотом дрожжевыми сферопластов (т.е.. Дрожжевых где клеточная стенка была ферментативно удалены) успешно используется для выявления дрожжи эндосомный отделений ^10. Эти частицы сильно связываются с отрицательно заряженных липидов, составляющих биологические мембраны. Таким образом, положительно заряженные Нанозолото ассоциируется с ПМ, проникает в клетку путем эндоцитоза и проходит через ЭО и LE до достижения вакуоль. Эти мелкие частицы золота, однако, не имеют подходящий размер, чтобы быть замеченными EM. Чтобы сделать их видимыми, их размер может быть увеличен за счет химических реакций, которые приводят к отложению серебра или золота вокруг золотого зонда ^13-15. Мы разработали и успешно применяется подход IEM на основе метода Tokuyasu выполнять субклеточнаялокализация изучает ^8,16. Этот метод позволяет выполнять immunogold маркировку на дрожжевых препаратов с отличным разрешением морфологии ^8,17-24. Мы также установил процедуру, сочетающий этот протокол IEM с Нанозолото маркировки системы дрожжи эндосомный отсеков ^6. Используя этот подход, мы морфологически характеризуются различные подклассы эндосомах и ультраструктурному анализу мутантов с людьми эндосомный дефект ^6,25. Более того, мы показали, что это Нанозолото маркировки могут быть объединены с immunogold маркировок обеспечивая возможность изучить распределение белка имеется заинтересованность, на различных субпопуляций эндосом. Здесь мы представляем, как маркировка системы дрожжи эндосомный с положительно заряженным нанозолотом практически выполнена.

протокол

1. Сферопластного Подготовка

1. Инкубировать дрожжи в течение ночи при 30 ° С в 10 мл соответствующей среды определяется конструкцией эксперимента.
2. На следующий день после измеряют оптическую плотность культуры при 600 нм (OD ₆₀₀₎ с использованием фотометра, Развести клетки в той же культуральной среде до оптической плотности 0,2-0,4 ₆₀₀ и выращивают их в экспоненциальной фазе роста, если конструкции Эксперимент требует иного состояние. Клетки в экспоненциальной фазе, когда культура имеет OD ₆₀₀ из 1-2.
3. Сбор 10 OD ₆₀₀ эквивалентов клеток путем центрифугирования при 3500 х г в течение 5 мин в 50 мл пробирку. После центрифугирования отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл 100 мМ трубы (рН 9,6), 10 мМ дитиотреитола и инкубируют при 30 ° С в течение 10 мин.
5. Сбор снова клеток путем центрифугирования при 3500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант.
6. Ресуспендируют клеток ян 5 мл среды (определяется конструкцией эксперимента), содержащего 1 М сорбит и 5 мг литического фермента, и инкубируют смесь при 30 ° С при осторожном встряхивании в течение 30 мин.
7. Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 5 мин, чтобы собрать фракцию гранул, что соответствует Сферопласты. Удалите супернатант.
8. Ресуспендируют сферопластов в 960 мкл охлажденного льдом среды (среда определяется конструкцией эксперимента), содержащего 1 М сорбит и передавать смесь в охлажденный льдом 2 мл микроцентрифужных трубки.

2. Нанозолото Поглощение

1. С помощью пипетки, осторожно перемешать с сферопластного 4 нмоль положительно заряженных частиц нанозолота ресуспендировали в 40 мкл воды. Конечный объем смеси должна быть от 1 мл.
2. Поместите полученную клеточную суспензию на льду в течение 15 мин.
3. Передача суспензии при комнатной температуре и инкубировать его в течение необходимого времени, чтобы позволить Нанозолото интернализации по электроннойndocytosis.
   ПРИМЕЧАНИЕ: поглощение 5 мин будет принципиально привести к маркировке эндоцитотических пузырьков и начале эндосомных отсеков, в то время как поглощение 15 мин позволит отмечать всю систему эндосом (ранние и поздние эндосомы). Более длительное время инкубации (более 30 мин) также позволит маркировать вакуоль.
   Примечание: Пульс-чейз-эксперименты маркировки не может быть выполнена с помощью этого метода. Таким образом, при маркировке для анализа LE, Нанозолото также можно найти на PM и МСОЧС.

3. Фиксация и Секционирование

1. Стоп поглощение Нанозолото добавлением 1 мл двойного фиксатора прочности [4% параформальдегид (PFA), 0,4% глутаральдегид (GA) в 0,1 М ФЭУ буфера (20 мМ ТРУБЫ, 50 мМ HEPES, рН 6,9, 20 мМ EGTA, 4 мМ MgCl _2)], содержащего 1 М сорбит к клеточной суспензии. Kept трубки при комнатной температуре.
2. Аккуратно перевернуть вручную micocentrifuge трубок несколько раз в течение 30 мин (это позволит сохранить сферопластов вподвеска) и затем центрифуги его дважды в 1700 мкг в течение 25 сек.
3. Заменить фиксатором путем отбрасывания супернатант и путем добавления 1 мл свежей стандартной прочности фиксатором (2% PFA, 0,2% GA в 0,1 М буфере ФЭУ), содержащего 1 М сорбит и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на медленно вращающемся колесе.
4. Процесс клетки для крио-срезов, как описано выше ^6. Примечание: для процедур повышения поглощения Нанозолото и серебра, лечение периодический кислота описано в указанном протоколе не должны быть выполнены. Лечение периодический кислота является более проницаемыми клеточную стенку ^26, но эта структура была ликвидирована при генерации сферопластов.
5. Вырезать 50 нм тонкие криосрезы при -120 ° С с сухим алмазного ножа с помощью UCT ультрамикротоме, как описано выше ⁸ и разместить их на формвар углерода, покрытой 50 входит в зацепление никеля сетки.

4. Серебряный расширение для Нанозолото частиц видеотехникализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовить реакционных смесей в основном тот, который указан заводом-изготовителем. Практические приспособления, использующие этот протокол, делает процедуру повышения серебро эффективным и надежным на криосрезов.

1. Извлеките набор усиления серебра из морозильника и разморозить его в 37 ° С инкубатор или водяной бане. Когда оттаивают, разместить комплект в инкубаторе 24 ° C, помещены в темной комнате до использования (см. 4.7).
2. Поместите плиту топления в темной комнате и прогрейте его до конечной температуры 24 ° C.
3. Обложка начало нагревательной пластины с поверхностью протектора, блестящей стороной вверх, и закрепите его при помощи ленты.
4. Поместите парафильмом на Benchkote и отметьте края с черным маркером, чтобы иметь возможность видеть края парафильмом в темноте.
5. Лента термометр на верхней части Benchkote контролировать температуру нагревательного элемента. Постепенно регулировать температуру, если не 24 ° С.
6. Пласе в 50 мл трубки с двойным дистиллированной воды и повышения серебро комплекта внутри.
7. Заполните небольшие чашки Петри с дважды дистиллированной воде, предварительно нагретого до 37 ° С. Поместите сетки в воде, образец стороной вниз, в течение 30 мин.
8. Повторите этот шаг 4.7 еще раз.
9. Перенесите сетки в ящик для хранения и привести их в темную комнату.
10. Промыть решетки снова, пропуская их (с образца стороной вниз) на нескольких капель дважды дистиллированной воде при 24 ° С, размещенных на Parafilm, что было зафиксировано на нагревательной пластине.
11. Убедитесь, что 9 дополнительных двойных капли дистиллированной воды готовы на парафильмом, для ополаскивания после реакции повышения серебро.
12. Выключи свет и убедиться, что все освещение выключено. Поверните красный свет.
13. Выньте решения А и В из усиливающего серебро комплекта из инкубатора 24 ° C.
14. Положите первые 6 капель раствора А, а затем 6 капель раствора В в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и хорошо перемешать со стеклянной пипетки Пастера, избегая, чтобы сделать пузыри. Решение довольно толстый и он должен быть вручную смешивали с пипеткой пока, наконец, встряхивая его кратко.
15. Положите решения А и В обратно в инкубатор 24 ° C и вынуть C решение.
16. Добавить 6 капель С решения смеси A / B. Затем смешать снова сначала с помощью пипетки Пастера и затем на вортексе, избежать пузырьков.
17. Используйте сразу готовой смеси путем размещения капли (~ 20 мкл / падение) на парафильмом.
18. С чистой, анти-магнитных пинцетом, положите решетки на смеси (серебро повышения реакционной например.) В течение 6 до 15 мин в зависимости от повышения (то есть. Размер частиц золота) хотел получить.
19. Удаление сетки из смеси и передавать их на верхней части бидистиллированной воды падает при 24 ° С в течение стирок. Во-первых, использовать в быстро подряд 6 капель, а затем 3 капли с 7 мин времени инкубации на падение, До поворота огни.
20. Перейдите к следующему шагу, либо иммуно-золотой маркировки или мембранного окрашивания ²⁷ для того, чтобы визуализировать результат для EM расследования.

Результаты

Согласно представленной протокола, морфология системы дрожжи эндосом может быть доступ по EM передачи. Рисунок 1 показывает различные типы эндосомных отсеков, которые были достигнуты, и поэтому меченные нанозолотом. Серебро повышенной Нанозолото можно ясно увидеть, как элект?...

Обсуждение

Иммуно-электронно-микроскопическое является метод, который позволяет объединить локализацию белков с ультраструктурном разрешением носителей и органелл, где эти белки проживают. Это особенно важно при изучении системы дрожжи эндосом, потому что ее отсеки выглядят как знаки препинан...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germany	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germany	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2.6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitol	Sigma, St louis, MO	S1876
Positively charged Nanogold	Nanoprobes, Yaphank, NY	2022	store at -20 ̊C
HQ-silver™ enhancement kit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	store at -20 ̊C
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldehyde 8% EM grade	Polyscience, Inc. , Warrington, PA	216	store at 4 ̊C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	store at 4 ̊C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	G209N
Cryo-immuno diamond knife 35 º	Diatome AG, Biel, Switzerland	N.A.
UCT ultramicrotome	Leica, Solms, Germany	N.A.
Formvar 15/95 resine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15800
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Grids storage box	Leica, Solms, Germany	162-50
Falcon 100mmx15mm petri dishe	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands	10216234
1.5 ml microcentrifuge	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
50 ml tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands	210296
Benchkote surface protector	Whatman, Maidstone, United Kingdom	1159201