Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

Resumen

La levadura, Saccharomyces cerevisiae, ha sido un modelo de organismo clave para identificar y estudiar los genes que regulan la biogénesis y funciones del sistema endosomal. Aquí se presenta un protocolo detallado para el etiquetado específico de los compartimentos endosomal para estudios ultraestructurales.

Resumen

Los endosomas son uno de los principales puntos de control de clasificación de membrana en células eucariotas y regulan el reciclado o la destrucción de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática y el aparato de Golgi. Como resultado, el sistema endosomal juega un papel central en el mantenimiento de la homeostasis celular, y las mutaciones en los genes que pertenecen a esta red de orgánulos interconectados por el transporte vesicular, causan patologías graves como el cáncer y trastornos neurobiológicos. Por lo tanto, de primordial importancia es entender los mecanismos subyacentes a la biogénesis y la organización del sistema endosomal. La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido fundamental en esta tarea. Para etiquetar y analizar a nivel ultraestructural el sistema endosomal de este organismo modelo en concreto, presentamos aquí un protocolo detallado para la captación nanogold cargado positivamente por esferoplastos seguido de la visualización de estas partículas a través de una reacción en la mejora de plata. Este método es también una valiosa demasiadol para el examen morfológico de mutantes con defectos en el tráfico endosomal. Por otra parte, no sólo es aplicable para los exámenes ultraestructurales pero también se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje para investigaciones de localización de proteínas.

Introducción

El sistema endosomal es un aparato de clasificación de membrana importante que desempeña múltiples funciones celulares importantes, incluyendo el tráfico de la enzima lisosomal receptores de clasificación y el reciclaje de la membrana plasmática (PM), los receptores ^1,2. Endosomes se dividen en tres compartimentos diferentes, es decir. los endosomas tempranos (EE), a finales de los endosomas (LE) y los endosomas de reciclaje. Esta clasificación se basa en el tiempo que toma para el material endocytosed para llegar a ellos, en las proteínas marcadoras específicas y en su morfología. Las membranas, es decir, proteínas y lípidos bicapa, interiorizadas del PM pueden o bien ser entregados a través de endosomas lisosomas para la degradación o se reciclan de nuevo. Las membranas también son transportados a los endosomas de el aparato de Golgi y de manera similar, ya sea seguir a los lisosomas o ser recuperada de nuevo a los de Golgi. Además, las proteínas se pueden clasificar en vesículas luminales en ciernes hacia el interior de la membrana endosomal limitación, un proceso que conduce a la formación deuna subcategoría de LE, los cuerpos multivesiculares.

El sistema endosomal levadura es relativamente menos compleja que la de las células eucariotas altos. Endosomas levadura se dividen en EE y LE. En contraste con las células de mamífero que no contienen los endosomas de reciclaje, sino también orgánulos relacionados con los lisosomas-específicos de tejido. En consecuencia, tienen una red de menor complejidad de las rutas de tráfico endosomal ^3,4. Por lo tanto, la levadura ha representado y sigue representando un sistema experimental ventajosa para estudiar algunos de los principios del tráfico de membrana subyacente en el sistema endosomal. Esta ventaja se acentúa por el hecho de que numerosos genes implicados en las vías de endosomal se han aislado inicialmente con pantallas genéticas en la levadura ^5. Mientras que el sistema endosomal levadura en las células de tipo salvaje y mutantes se ha estudiado ampliamente el uso de enfoques de microscopía de fluorescencia y bioquímicos, su investigación en el nivel ultraestructural sólo ha sidomínimo. Los análisis morfológicos son particularmente relevantes en la levadura porque la mayoría de los orgánulos endosomales son detectados como estructuras puntiformes por microscopía de fluorescencia, lo que hace difícil su identificación inequívoca ^6. Desgraciadamente, sólo un número limitado de antisueros reconocimiento de los marcadores de proteínas endosomal levadura está trabajando en inmuno-microscopía electrónica (IEM) preparaciones ^7-10. Para algunas proteínas, este problema se ha eludido por el etiquetado endógena del gen de interés y el uso de un anticuerpo que reconoce la etiqueta para detectar que ^7,11,12. A menudo, sin embargo, las proteínas son indetectables por IEM debido a sus bajos niveles de expresión. Su sobreexpresión no es una solución, porque este enfoque puede inducir mis-localizaciones y / o alteraciones en los orgánulos morfología / funciones. Así, el etiquetado de los compartimentos endocítica con una sonda detectable por microscopía electrónica de EM es una opción efectiva. Esta es una solución óptima sobre todo si la PRobe está entrando en la ruta endocítica de una manera dependiente del tiempo, lo que permite saber cuándo va a marcar un orgánulo específico ^6.

La captación de nanogold cargado positivamente por esferoplastos de levadura (es decir. De levadura donde la pared celular se ha eliminado enzimáticamente) con éxito ha sido utilizado para identificar el endosomal levadura compartimentos ^10. Estas partículas se unen fuertemente a los lípidos cargados negativamente que componen las membranas biológicas. Por lo tanto los asociados Nanogold cargados positivamente con la PM, penetra en la célula por endocitosis y pasa a través de la EE y LE antes de llegar a la vacuola. Estas pequeñas partículas de oro, sin embargo, no tienen un tamaño adecuado para ser visto por EM. Para hacerlos visibles, su tamaño se puede ampliar por reacciones químicas que conducen a la deposición de plata o de oro alrededor de la sonda de oro ^13-15. Hemos desarrollado y aplicado con éxito un enfoque IEM basado en el método Tokuyasu para realizar subcelularlocalización estudia ^8,16. Este método permite realizar inmunomarcaje sobre los preparativos de la levadura con una excelente resolución de la morfología ^8,17-24. También hemos establecido un procedimiento que combina este protocolo IEM con el etiquetado nanogold del sistema endosomal levadura compartimentos ^6. Con este enfoque hemos caracterizado morfológicamente diferentes subclases de endosomas y ultraestructuralmente examinado mutantes con un tráfico endosomal defecto ^6,25. Por otra parte, hemos demostrado que este etiquetado nanogold se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje proporcionar la posibilidad de explorar la distribución de una proteína de interés en las diferentes subpoblaciones endosoma. Aquí presentamos cómo se realiza prácticamente el etiquetado del sistema endosomal levadura con nanogold cargado positivamente.

Protocolo

1. Preparación Esferoplasto

1. Incubar la levadura durante la noche a 30 ° C en 10 ml del medio apropiado determinado por el diseño del experimento.
2. El día después, medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD ₆₀₀₎ usando un fotómetro, Diluir las células en el mismo medio de cultivo hasta una DO ₆₀₀ de 0,2-0,4 y crecer a una fase de crecimiento exponencial a menos que el diseño de la experimento requiere una condición diferente. Las células se encuentran en la fase exponencial cuando la cultura tiene un OD ₆₀₀ de 1-2.
3. Recoger 10 OD ₆₀₀ equivalentes de células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min en un tubo de 50 ml. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante.
4. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de tubos de 100 mM (pH 9,6), ditiotreitol 10 mM y se incubaron a 30 ° C durante 10 min.
5. Recoger de nuevo las células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
6. Resuspender las células in 5 ml de medio (determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y 5 mg de enzima lítica, e incubar la mezcla a 30 ° C con agitación suave durante 30 min.
7. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min para recoger la fracción de sedimento, que se corresponde con los esferoplastos. Eliminar el sobrenadante.
8. Resuspender los esferoplastos en 960 l de hielo frío medios (medio determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y transferir la mezcla en un frío de hielo 2 ml tubo de microcentrífuga.

2. Nanogold captación

1. Con una pipeta, mezclar suavemente el esferoplasto con 4 nmol de partículas con carga positiva Nanogold resuspendieron en 40 l de agua. El volumen final de la mezcla tiene que ser de 1 ml.
2. Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 min.
3. Transferir la suspensión a temperatura ambiente y se incuba durante el tiempo necesario para permitir la internalización nanogold por correondocytosis.
   NOTA: A la recaptación de 5 min dirigirá principalmente al etiquetado de vesículas endocítica y endosomal compartimentos tempranos, mientras que la absorción de 15 minutos permitirá a marcar todo el sistema endosomal (a principios y finales de endosomes). Tiempos de incubación más largos (más de 30 min) también permitirá etiquetar la vacuola.
   NOTA: los experimentos de pulso-caza de etiquetado no se pueden realizar con este método. Por lo tanto, cuando el etiquetado para el análisis de LE, nanogold también puede encontrar en el PM y el INEE.

3. La fijación y seccionamiento

1. Detener la absorción nanogold mediante la adición de 1 ml de fijador doble fuerza [4% de paraformaldehído (PFA), 0,4% de glutaraldehído (GA) en tampón PHEM 0,1 M (TUBOS 20 mM, HEPES 50 mM, pH 6,9, 20 mM de EGTA, 4 mM de MgCl _2)] que contiene 1 M de sorbitol a la suspensión celular. Se mantuvo el tubo a temperatura ambiente.
2. Invertir suavemente manualmente los tubos micocentrifuge varias veces durante 30 min (esto permitirá mantener los esferoplastos ensuspensión) y centrifugar dos veces a 1.700 xg durante 25 s.
3. Reemplazar el fijador descartando el sobrenadante y mediante la adición de 1 ml de fijador estándar de la fuerza fresco (2% de PFA, 0.2% GA en tampón PHEM 0,1 M) que contiene 1 M de sorbitol y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente en una rueda que gira lentamente.
4. Procesar las células para la crio-seccionamiento como se describe anteriormente ^6. NOTA: Para los procedimientos de mejora de captación nanogold y plata, no tiene que realizarse el tratamiento con ácido periódico describe en el protocolo indicado. El tratamiento con ácido periódico es mejor para permeabilizar la pared de la célula ^26, pero esta estructura ha sido eliminado durante la generación de esferoplastos.
5. Cortar 50 cryosections delgadas nm a -120 ° C con un cuchillo de diamante en seco utilizando un ultramicrotomo UCT como se describió previamente ⁸ y colocarlos en carbono Formvar recubierto 50 mallas de rejillas de níquel.

4. Silver Enhancement para Nanogold partículas Visualización

NOTA: El procedimiento para preparar las mezclas de reacción es, básicamente, la indicada por el fabricante. Adaptaciones prácticas que utilizan este protocolo, hace que el procedimiento de mejora de la plata eficaz y fiable sobre cryosections.

1. Retire el kit de mejora de la plata del congelador y descongele en un 37 ° C incubadora o baño de agua. Cuando descongelado, coloque el kit en una incubadora de 24 ° C se coloca en un cuarto oscuro hasta su uso (ver 4.7).
2. Coloque la placa de calefacción en la habitación oscura y deje que se caliente a la temperatura final de 24 ° C.
3. Cubra la parte superior de la placa de calentamiento con el protector de la superficie, el lado brillante hacia arriba, y seguro que con una cinta.
4. Coloque el Parafilm sobre la Benchkote y marcar los bordes con un marcador negro para poder ver los bordes de Parafilm en la oscuridad.
5. Cinta de un termómetro en la parte superior de la Benchkote para controlar la temperatura de la placa de calentamiento. Poco a poco ajustar la temperatura si no es 24 ° C.
6. PlaCE El tubo de 50 ml con agua bidestilada y el kit de mejora de plata dentro.
7. Llene las pequeñas cajas de Petri con agua doblemente destilada, previamente calentada a 37 ° C. Coloque las rejillas en el agua, espécimen lado de abajo, durante 30 minutos.
8. Repita este paso 4.7 una vez más.
9. Transfiera las rejillas en la caja de almacenamiento y llevarlos a la sala oscura.
10. Enjuague las rejillas de nuevo pasándolos (con el lado de la muestra hacia abajo) en varias gotas de agua doble destilada a 24 ° C colocados en el Parafilm que se ha fijado en la placa de calentamiento.
11. Asegúrese de que 9 gotas de agua destilada dobles adicionales están dispuestos en el Parafilm, para el enjuague después de la reacción mejora plata.
12. Apaga la luz y asegúrese de que todas las luces están apagadas. Encienda la luz roja.
13. Sacar las soluciones A y B del kit de mejora de la plata de la incubadora 24 ° C.
14. Ponga primero 6 gotas de la solución A y luego 6 gotas de la solución B en un 1,5 mtubo de microcentrífuga de L, y mezclar bien con una pipeta Pasteur de vidrio evitando para hacer burbujas. La solución es bastante gruesa y tiene que ser mezclada manualmente con una pipeta antes de que finalmente vórtex brevemente.
15. Poner las soluciones A y B de nuevo en la incubadora de 24 ° C y retirar la solución C.
16. Añadir 6 gotas de la solución C a la mezcla A / B. A continuación, mezclar de nuevo en primer lugar con una pipeta Pasteur y luego por agitación, evite hacer burbujas.
17. Utilizar inmediatamente la mezcla final mediante la colocación de gotas (~ 20 l / gota) en el Parafilm.
18. Con unas pinzas limpias, anti-magnético, colocar las rejillas en la mezcla (por ejemplo., Reacción mejorar plata) para 6 a 15 min dependiendo de la mejora (es decir. Tamaño de las partículas de oro) deseado a obtener.
19. Retire las rejillas de la mezcla y pasarlos en la parte superior del agua doblemente destilada cae a 24 ° C para el lavado. En primer lugar, el uso en la sucesión rápida 6 gotas y luego 3 gotas con 7 min tiempo de incubación por gota, Antes de encender las luces.
20. Continúe con el siguiente paso, ya sea etiquetado inmuno-oro o tinción de la membrana ²⁷ con el fin de visualizar el resultado de una investigación de EM.

Resultados

De acuerdo con el protocolo presentado, la morfología del sistema endosoma de la levadura puede ser el acceso por EM de transmisión. Figura 1 muestra diferentes tipos de compartimientos endosomal que han sido alcanzados y por lo tanto marcadas con nanogold. El nanogold mejorada de plata se puede ver claramente como partículas densas de electrones. Los ajustes óptimos establecidos para la reacción mejora la plata permite tener partículas de oro en un intervalo de tamaño homogéneo entre 5 y 15 nm,...

Discusión

Inmuno-microscopía electrónica es una técnica que permite la combinación de localización de las proteínas con la resolución ultraestructural de los portadores y orgánulos donde residen estas proteínas. Esto es especialmente importante cuando se estudia el sistema endosomal levadura porque sus compartimentos aparecen como estructuras puntiformes en la microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, es difícil distinguirlas. Por esta razón el uso de una sonda detectable por EM y de entrar en la ruta endocítica de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germany	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germany	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2.6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitol	Sigma, St louis, MO	S1876
Positively charged Nanogold	Nanoprobes, Yaphank, NY	2022	store at -20 ̊C
HQ-silver™ enhancement kit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	store at -20 ̊C
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldehyde 8% EM grade	Polyscience, Inc. , Warrington, PA	216	store at 4 ̊C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	store at 4 ̊C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	G209N
Cryo-immuno diamond knife 35 º	Diatome AG, Biel, Switzerland	N.A.
UCT ultramicrotome	Leica, Solms, Germany	N.A.
Formvar 15/95 resine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15800
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Grids storage box	Leica, Solms, Germany	162-50
Falcon 100mmx15mm petri dishe	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands	10216234
1.5 ml microcentrifuge	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
50 ml tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands	210296
Benchkote surface protector	Whatman, Maidstone, United Kingdom	1159201