Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Zusammenfassung

Hefe, Saccharomyces cerevisiae, war ein wichtiger Modellorganismus zu identifizieren und zu untersuchen Gene Regelung der Biogenese und Funktion des endosomalen Systems. Hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die spezifische Markierung von den Endosomen für ultrastrukturelle Studien.

Zusammenfassung

Endosomen sind einer der Hauptmembransortier Checkpoints in eukaryotischen Zellen, und sie Verwertung oder Vernichtung von Proteinen regulieren hauptsächlich von der Plasmamembran und Golgi. Als Ergebnis der endosomalen System spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Zelle, und Mutationen in Genen zu diesem Netzwerk von Organellen durch Vesikeltransport miteinander verbunden gehören, verursachen schwere Erkrankungen wie Krebs und neurobiologischen Erkrankungen. Es ist daher von größter Bedeutung, um die Mechanismen der Biogenese und der Organisation des endosomalen System zugrunde liegen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist in dieser Aufgabe entscheidend. Um spezifisch zu markieren und zu analysieren, auf ultrastruktureller Ebene die endosomalen System dieser Modellorganismus, hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die positiv geladenen Nanogold-Aufnahme durch Spheroplasten gefolgt von der Visualisierung dieser Teilchen durch eine Silberverstärkung Reaktion. Dieses Verfahren ist auch ein wertvoller zul für die morphologische Untersuchung von Mutanten mit Defekten in endosomalen Handel. Darüber hinaus ist es nicht nur anwendbar für ultrastrukturelle Untersuchung kann aber auch mit Immun Markierungen zur Proteinlokalisierung Untersuchungen kombiniert werden.

Einleitung

Die endosomalen System ist ein Hauptmembransortiervorrichtung, die mehrere entscheidende Rollen einschließlich Mobilhandel lysosomalen Enzyms Sortier Rezeptoren und das Recycling von Plasmamembran (PM)-Rezeptoren spielt ^1,2. Endosomen in drei Kammern, nämlich unterteilt. die frühen Endosomen (EE), die späten Endosomen (LE) und die Recycling-Endosomen. Diese Einstufung basiert auf der Zeit, die für die Endozytose Material, um sie zu erreichen, auf die bestimmte Markerproteine ​​und über deren Morphologie. Membranen, dh Protein-und Lipiddoppelschichten, von der PM verinnerlicht kann entweder über Endosomen zu den Lysosomen zum Abbau geliefert werden oder zurückgeführt werden. Membranen werden auch Endosomen vom Golgi transportiert und in ähnlicher Weise entweder weiterhin Lysosomen oder zurück zu den Golgi abgerufen werden. Weiterhin können Proteine ​​in luminalen Vesikel angeh nach innen von der endosomalen Grenzmembran, ein Verfahren, das zur Bildung von führt sortierteine Unterkategorie der LE, die multivesikulären Körpern.

Die Hefe endosomalen System ist relativ weniger komplex als die der Hoch eukaryotischen Zellen. Hefe Endosomen in EE und LE unterteilt. Im Gegensatz zu Säugerzellen sie Recycling Endosomen als auch gewebespezifische Lysosom bedingten Organellen enthalten. Folglich haben sie ein weniger komplexes Netzwerk von Handelsrouten endosomalen ^3,4. Daher Hefe vertreten und stellt noch immer eine vorteilhafte experimentelle System, einige der zugrunde liegenden Prinzipien Membran Verkehr in der endosomalen System zu studieren. Dieser Vorteil wird durch die Tatsache, dass zahlreiche Gene in den Endosomen Wegen beteiligt wurden zunächst mit genetischen Screens in Hefe isoliert ⁵ hervorgehoben. Während die Hefe endosomalen System in Wildtyp-und mutierten Zellen wurde ausgiebig mit biochemischen und Fluoreszenzmikroskopie Ansätze untersucht, hat ihre Untersuchung auf ultrastruktureller Ebene erst seitminimal. Morphologische Analysen sind in der Hefe besonders relevant, weil die meisten der endosomalen Organellen werden als punktförmigen Strukturen, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die ihre zweifelsfreie Ermittlung schwierig machen ⁶ nachgewiesen. Leider nur eine begrenzte Anzahl von Antiseren erkennen Hefe endosomalen Protein-Marker in immunelektronenmikroskopische Arbeits (IEM) Zubereitungen ^7-10. Bei einigen Proteinen wurde dieses Problem durch die Markierung des endogenen Gens von Interesse, und die Verwendung eines Antikörper, der das Etikett, um es zu erfassen, ^7,11,12 umgangen. Oft jedoch sind Proteine ​​nachweisbar durch IEM wegen ihrer niedrigen Expressionsniveaus. Die Überexpression ist keine Lösung, weil dieser Ansatz falsch Lokalisierungen und / oder Änderungen in den Organellen-Morphologie / Funktionen zu induzieren. So ist die Beschriftung der endozytischen Fächer mit einer Sonde durch Elektronenmikroskopie EM nachweisbar ist eine wirksame Option. Dies ist eine optimale Lösung, insbesondere wenn die probe ist die Eingabe der endozytischen Route in einem zeitabhängig, was zu wissen, wenn es eine spezifische Organelle ⁶ kennzeichnen können.

Die Aufnahme von positiv geladenen Nanogold durch Hefe Spheroplasten (Hefe, wo die Zellwand enzymatisch entfernt also.) Erfolgreich verwendet worden, um die Hefe zu identifizieren endosomalen Fächer ^10. Diese Partikel stark an die negativ geladenen Lipide, aus denen die biologischen Membranen zu binden. Somit werden die positiv geladenen Nanogold assoziiert mit dem PM, dringt in die Zelle durch Endocytose und gelangt durch die EE und LE vor Erreichen der Vakuole. Diese kleinen Goldpartikel, jedoch nicht über eine geeignete Größe von EM gesehen werden. Um sie sichtbar zu machen, kann ihre Größe durch chemische Reaktionen, die zur Abscheidung von Silber oder Gold auf der Goldsonde ^13-15 führen vergrößert werden. Wir haben uns entwickelt und erfolgreich angewandt eine IEM-Ansatz auf der Basis der Tokuyasu Methode, um subzelluläre durchführenLokalisierungsstudien ^8,16. Diese Methode ermöglicht die Durchführung Immunogoldmarkierung auf Hefe Zubereitungen mit einem hervorragenden Auflösung der Morphologie ^8,17-24. Wir haben auch eine Kombination dieser Verfahren IEM Protokoll mit der Nano-Gold-Markierung des Hefe endosomalen System Fächer ^6. Mit diesem Ansatz haben wir morphologisch charakterisiert verschiedenen Unterklassen der Endosomen und ultrastrukturell untersucht Mutanten mit einem Defekt endosomalen Handel ^6,25. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Nanogold-Markierung kann mit Immun Markierungen bietet die Möglichkeit, die Verteilung eines Proteins von Interesse in den verschiedenen Subpopulationen Endosom erkunden kombiniert werden. Hier präsentieren wir, wie die Kennzeichnung der Hefe endosomalen System mit positiv geladenen Nanogold praktisch durchgeführt.

Protokoll

1. Spheroplastenpräparation

1. Inkubieren der Hefe über Nacht bei 30 ° C in 10 ml des entsprechenden Mediums durch die Gestaltung des Experiments bestimmt.
2. Am Tag danach Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ unter Verwendung eines Photometers, verdünnt Zellen im gleichen Kulturmedium bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2-0,4 wachsen sie zu einem exponentiellen Wachstumsphase, wenn die Konstruktion der Experiment erfordert einen anderen Zustand. Zellen in der exponentiellen Phase, wenn die Kultur eine OD ₆₀₀ von 1-2.
3. Sammeln 10 OD ₆₀₀ Äquivalente Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g für 5 min in ein 50 ml Röhrchen. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen.
4. Zellpellet in 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM Dithiothreitol bei 30 ° C für 10 min inkubiert.
5. Sammeln wieder die Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g für 5 min. Überstand verwerfen.
6. Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium (von der Gestaltung des Experiments bestimmt), enthaltend 1 M Sorbit und 5 mg lytischen Enzym, und Inkubieren der Mischung bei 30 ° C unter leichtem Schütteln für 30 min.
7. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 × g für 5 min, um die Pelletfraktion, die den Sphäroplasten entspricht sammeln. Überstand verwerfen.
8. Resuspendieren der Sphäroplasten in 960 ul eiskaltem Medium (Medium, durch das Design des Experiments bestimmt), enthaltend 1 M Sorbit und überführt die Mischung in eine eiskalte 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

2. Nanogold-Aufnahme

1. Mit einer Pipette vorsichtig mischen die Sphäroplast mit 4 nmol von positiv geladenen Teilchen in Nanogold 40 ul Wasser resuspendiert. Das endgültige Volumen der Mischung zu 1 ml betragen.
2. Legen Sie die erhaltene Zellsuspension auf Eis für 15 min.
3. Übertragen Sie die Suspension bei Raumtemperatur inkubiert und es für die erforderliche Zeit, um Nanogold Internalisierung per E erlaubenndocytosis.
   HINWEIS: Ein 5 Minuten-Aufnahme wird in erster Linie für die Etikettierung von endozytischen Vesikel und frühen Endosomen führen, während eine 15 min-Aufnahme wird es ermöglichen, das gesamte System Endosomen (frühe und späte Endosomen) zu markieren. Längere Inkubationszeiten (über 30 min) wird auch erlauben, die Vakuole zu beschriften.
   HINWEIS: Pulse-Chase-Markierungsexperimente können mit dieser Methode nicht durchgeführt werden. Deshalb, wenn die Kennzeichnung für die Analyse von LE, Nanogold wird auch auf der Uhr und INEE gefunden werden.

3. Fixierung und Schnitt

1. Stoppen des Nanogold-Aufnahme durch Zugabe von 1 ml doppelt konzentrierten Fixierlösung [4% Paraformaldehyd (PFA), 0,4% Glutaraldehyd (GA) in 0,1 M PHEM-Puffer (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl _2)], enthaltend 1 M Sorbitol zu der Zellsuspension. Hielt das Rohr bei Raumtemperatur.
2. Während 30 min vorsichtig manuell invertieren die micocentrifuge Rohre mehrmals (dies wird erlauben, die in Spheroplasten haltenSuspension) und dann zweimal zentrifugieren bei 1.700 g für 25 Sekunden.
3. Ersetzen Sie das Fixiermittel durch Verwerfen des Überstandes und durch Zugabe von 1 ml frischem Normfestigkeit Fixiermittel (2% PFA, 0,2% GA in 0,1 M PHEM Puffer) mit 1 M Sorbitol und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem langsam drehenden Rades.
4. Verarbeiten Sie die Zellen, die für Kryo-Schnitte wie zuvor ⁶ beschrieben. HINWEIS: Für die Aufnahme Nanogold und Silber Verbesserung Verfahren hat die in der angegebenen Protokoll beschrieben periodische Säurebehandlung nicht durchgeführt werden. Die Periodsäure-Behandlung ist besser zu permeabilisieren die Zellwand ^26, aber diese Struktur bei der Erzeugung von Sphäroplasten eliminiert.
5. Cut 50 nm dünne Gefrierschnitte bei -120 ° C mit trockenen Diamantmesser mit Hilfe eines Ultramikrotoms UCT wie zuvor beschrieben, ⁸ und legen Sie sie auf Formvar Kohlenstoff beschichtet 50 Maschen Nickelgittern.

4. Silber Erweiterung für Nanogold Particle Visualisierung

HINWEIS: Das Verfahren, um die Reaktionsgemischen herzustellen, ist im Grunde die ein vom Hersteller angegeben. Praktische Anpassungen dieses Protokoll verwenden, macht der Silberverstärkung Verfahren effektiv und zuverlässig auf Gefrierschnitten.

1. Entfernen Sie die Silberverstärkung Kit aus dem Gefrierschrank und tauen sie in einem 37 ° C Inkubator oder Wasserbad. Wenn aufgetaut, legen Sie das Kit in einer 24 ° C-Inkubator in einen dunklen Raum bis zur Verwendung platziert (siehe 4.7).
2. Legen Sie die Heizplatte in den dunklen Raum und warm es auf die Endtemperatur von 24 ° C
3. Decken Sie die Oberseite der Heizplatte mit dem Oberflächenschutz, glänzenden Seite nach oben, und befestigen Sie sie mit einem Band.
4. Setzen Sie den Parafilm auf der Benchkote und markieren die Ränder mit einem schwarzen Marker, um die Parafilm Kanten in der Dunkelheit zu sehen.
5. Kleben Sie ein Thermometer auf der Oberseite des Benchkote, um die Temperatur der Heizplatte überwachen. Nach und nach die Temperatur einstellen, wenn nicht 24 ° C.
6. PlaCE Die 50-ml-Tube mit doppelt destilliertem Wasser und Silberverstärkung Satz im Inneren.
7. Füllen Sie die kleinen Petrischalen mit doppelt destilliertem Wasser, bei 37 ° C vorgewärmt Legen Sie die Netze im Wasser, Probenseite nach unten, für 30 min.
8. Wiederholen Sie diesen Schritt 4.7 noch einmal.
9. Übertragen Sie die Netze in der Aufbewahrungsbox und bringen sie in den dunklen Raum.
10. Spülen Sie die Gitter wieder, indem man sie (mit der Probenseite nach unten) auf einige Tropfen doppelt destilliertem Wasser bei 24 ° C auf dem Parafilm gelegt, die auf der Wärmeplatte fixiert wurde.
11. Stellen Sie sicher, dass 9 weitere doppelt destilliertem Wasser Tropfen bereit sind, auf die Parafilm, zum Spülen nach der Silberverstärkung Reaktion.
12. Schalten Sie das Licht aus, und stellen Sie sicher, dass alle Lichter ausgeschaltet sind. Schalten Sie das rote Licht auf.
13. Nehmen Sie die Lösungen der Silberverstärkung Kit von der 24 ° C-Inkubator A und B.
14. Setzen ersten 6 Tropfen der Lösung A und dann 6 Tropfen der B-Lösung in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und gut mischen mit einem Glas Pasteur-Pipette, um Blasen zu vermeiden, zu machen. Die Lösung ist recht dick und manuell mit einer Pipette, bevor sie schließlich Vortexen es kurz gemischt werden, die es hat.
15. Setzen Sie die Lösungen A und B wieder in der 24 ° C-Inkubator und nehmen Sie die C-Lösung.
16. 6 Tropfen der Lösung C in die A / B-Gemisch. Dann mischen Sie wieder zuerst mit einer Pasteur-Pipette und dann durch Wirbeln, verhindern, dass Blasen.
17. Verwenden Sie sofort die endgültige Mischung, indem Tropfen (~ 20 ul / Drop) auf dem Parafilm.
18. Mit einem sauberen, anti-magnetischen Pinzette, legen Sie die Gitter auf die Mischung (zB., Silber Verbesserung Reaktion) für 6 bis 15 min je nach der Erweiterung (zB. Größe der Goldpartikel) wollte zu erhalten.
19. Entfernen Sie die Gitter aus der Mischung und leiten sie an die Spitze der doppelt destilliertem Wasser sinkt bei 24 ° C wäscht. Verwenden Sie zuerst in schnell nacheinander und dann 6 Tropfen 3 Tropfen mit 7 min Inkubationszeit pro Tropfen, Bevor die Lichter an.
20. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt entweder Immuno-Gold-Kennzeichnung oder Membranfärbung ^27, um das Ergebnis für einen EM-Untersuchung zu visualisieren.

Ergebnisse

Gemäß der vorgestellten Protokoll kann die Morphologie der Hefe Endosom System zugänglich sein durch Übertragungs EM. Fig. 1 zeigt verschiedene Arten von Endosomen, die erreicht haben und deshalb mit Nanogold markierten. Das Silber-Nanogold verbessert deutlich als Elektronen-dichten Teilchen gesehen werden. Die für die Silberverstärkung Reaktion etabliert optimalen Einstellungen können mit Goldpartikeln in einer homogenen Größenbereich zwischen 5 und 15 nm, die nicht mit der Ultrastruktur der H...

Diskussion

Immuno-Elektronenmikroskopie ist eine Technik, kombiniert Lokalisierung von Proteinen mit der ultra Auflösung der Träger und Organellen, in denen diese Proteine ​​befinden können. Dies ist besonders wichtig, wenn die Untersuchung der Hefe endosomalen System, weil seine Fächer erscheinen als punktförmigen Strukturen in der Fluoreszenzmikroskopie. Es ist daher schwierig, sie zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist der Einsatz einer Sonde nachweisbar EM und Eingabe der endocytischen Weg in einer zeitabhängigen Wei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germany	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germany	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2.6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitol	Sigma, St louis, MO	S1876
Positively charged Nanogold	Nanoprobes, Yaphank, NY	2022	store at -20 ̊C
HQ-silver™ enhancement kit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	store at -20 ̊C
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldehyde 8% EM grade	Polyscience, Inc. , Warrington, PA	216	store at 4 ̊C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	store at 4 ̊C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	G209N
Cryo-immuno diamond knife 35 º	Diatome AG, Biel, Switzerland	N.A.
UCT ultramicrotome	Leica, Solms, Germany	N.A.
Formvar 15/95 resine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15800
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Grids storage box	Leica, Solms, Germany	162-50
Falcon 100mmx15mm petri dishe	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands	10216234
1.5 ml microcentrifuge	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
50 ml tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands	210296
Benchkote surface protector	Whatman, Maidstone, United Kingdom	1159201