订货单细胞和单胚胎的三维约束:高内涵筛选新设备

摘要

我们报告的设备和新的方法来研究细胞和胚胎。单细胞精确下令微阵列。他们的3D坐月子是朝着在生理条件下遇到的3D环境的一个步骤，并允许细胞器的方向。通过控制细胞的形状，此设置最大限度地减少可变性中的标准试验的报道。

摘要

生物细胞通常在平面（2D）表面观察。这种条件是不生理和表型和形状是高度可变的。根据在这种环境中的细胞筛选具有因而严重的局限性:细胞器显示极端的表型，细胞形态和尺寸是异质和/或特定的细胞器无法正确显示。此外， 在体内细胞位于3D环境;在这种情况下，细胞表现出不同的表型的，主要是因为它们与组织的周围的细胞外基质相互作用的。为了标准化和产生单个细胞中对基于细胞的测定生理相关的3D环境的次序，我们在这里报告的装置的用于体外三维细胞培养物的微加工和应用。此装置由微腔的2D阵列（通常是10 ⁵的空腔/厘米^2）中 ，填充有单细胞或胚胎。细胞POSI化，形状，极性和内部细胞组织变得那么标准化呈现出3D架构。我们使用复制品成型图案的微腔的阵列，'eggcups'，到薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘附在盖玻片层。腔体上布满了纤维连接蛋白更容易粘附。细胞通过离心插入。填充百分比为每个系统允许高达80％的最优化。细胞和胚胎存活率证实。我们应用此方法对细胞器，如细胞核和高尔基体的可视化，并研究活动进程，如cytokinetic环的细胞有丝分裂期间的关闭。该器件允许cytokinetic闭环和压实表型的高尔基体细胞核对准期间的新功能，如周期性积累和肌球蛋白和肌动蛋白的不均匀性的鉴定。我们的特点的方法哺乳动物细胞，裂殖酵母，芽殖酵母，C.线虫 W¯¯在每种情况下i个具体的适应。最后，该装置的特性使得它特别有趣的药物筛选测定法和个性化的药物。

引言

当前在体外基于细胞的测定是二维（2D）。这种构造是不自然的哺乳动物细胞，因此不是生理有关^1;细胞显示的形状，大小和异构表型的多样性。当应用于筛选应用，如平面和细胞器的极端的表型（应力纤维，特别是）内的无序分布它们呈现额外严重的局限性。这是在药物测试，在高预算每年花在临床试验尤为重要。当因为在药物筛选的初期阶段人工2D培养条件适用于动物模型大多数这些药物​​虽然失败。另外，通过使用这种方法，具体细胞器无法正常显现，如细胞有丝分裂期间cytokinetic肌动球蛋白环，一般认为是在平面垂直演进到观察平面结构。一些新的二维测定人为了克服上述缺点和重要的见解上细胞骨架组织已经观察到^2,3被提出。但是，这些检测仍然存在一个严重的局限性:细胞表现出非常价差表型相反的是， 在体内 ，其中细胞呈现出3D架构观察。与培养法相关的这些文物可能引发非生理功能，如增强的应力纤维^1,4,5。

时相比2D环境^6,7-三维细胞培养测定提供多个优点。它们是生理上更相关的，并且结果是因此有意义。作为一个例子，嵌在水凝胶细胞显示3D状结构，但它们的形态从一个小区的不同而不同^8,9。然而，它们的形态从一个小区到另一个，其中筛选应用复杂不同。另一种策略是嵌入单细胞微制造的腔^10,11。然后细胞位置，形状，极性和内部细胞组织可以成为标准化。除了 ​​提供类似3D的架构，细胞，微腔还允许高内涵筛选研究^10,12-14;单电池可以订购成微阵列和细胞器和它们的演进可以并行进行观察。这个规律提供了较低的细胞数量和更好的时间/空间分辨率良好的统计数据。有用的化合物是更容易识别可靠。

在这项研究中，我们显示了高内涵筛选应用^10,12,13制作和全新的3D般的单细胞培养系统中的应用。该装置由弹性微腔（10 ⁵腔/厘米^2），创造'eggcups"（EC）的阵列。在这项工作中的尺寸和EC的总体积进行优​​化，个人NIH3T3细胞和HeLa细胞的典型体积在细胞分裂过程。圆柱形 - - 腔形态被选择为活动进程的可视化的正确东方细胞形状。复制品成型用于图案EC的阵列上附着在玻璃的薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）层盖玻片^15,16。细胞通过离心在欧盟出台。我们在2D使用相同的细胞相比在这里报告的观察和三维（EC）细胞器（应力纤维，高尔基体和胞核）正常化（平）表面。我们还报告，积极动力过程的观察，如cytokinetic肌动球蛋白环的细胞有丝分裂过程中¹⁷封。最后，我们表明与刚性壁，如出芽酵母，裂殖酵母和C的其它系统这种方法的结果线虫胚胎这证实了我们的方法是否适用于广泛的模型系统。

接下来我们提出一个详细而详尽的protocol为了制造和应用三维微细加工的"eggcups"。我们的方法是简单，并不需要一个干净的房间。我们预计，这一新方法将成为药物筛选试验和个性化的医学特别有意思，在更换培养皿。最后，我们的设备将用于癌症¹⁸或在基础研究¹⁹研究的细胞响应的分布对外部刺激，例如有用。

研究方案

1."Eggcups"的微细

1. 法师的制作:微腔阵列
   1. 热3''的硅晶片到200℃以蒸发湿度的任何存在。
   2. 旋涂层的SU-8光致抗蚀剂的薄层。调整树脂及纺丝速度取决于所需的厚度和光致抗蚀剂类型的体积。该厚度将决定'eggcups'（EC）的深度。对于2,800转30微米厚的层和SU-8 2025年，旋涂。
   3. 预烘烤在65℃下1分钟（第2步骤1）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
   4. 预烘烤在95℃下进行3分钟（第2步骤2）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
   5. 加载晶片上的掩模对准器为UV曝光。放置光刻掩模就可以了。掩模示出20微米直径的圆形特征（磁盘）的图案。确保相互之间的完美接触。
      注:不同制造商提供的光刻面具。的空间分辨率将确定的最终成本。醋酸口罩低成本提供可接受的分辨率（≈10微米）。铬面罩提供更好的分辨率，但更昂贵。适应磁盘的直径（从光刻掩模），以细胞的体积。在掩模磁盘尺寸将确定在设备的空腔的直径。小直径会导致较低的填充;过大直径将不限制细胞。用于HeLa和NIH3T3细胞，直径为20微米至25微米的建议。
   6. 检查紫外灯之前博览会的力量，相应地优化曝光时间。照射（波长= 365纳米），用于在41.5秒（或优化曝光时间）250毫焦/厘米^2。
      注意:SU-8 2025的负光致抗蚀剂，这意味着暴露区域到紫外线将被固化。在这种情况下，圆形特征是黑，其余的是透明的。以相反的方式正性光刻胶工作:未曝光区域固化。选择相应的光致抗蚀剂，这取决于设计和光掩模。
      注:用适当的防护眼镜从紫外线保护眼睛。
   7. 除去轻轻地从光致抗蚀剂层的掩膜。
   8. 后烘烤在65℃下1分钟（第2步骤1）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。后烘烤在95℃下进行3分钟（第2步骤2）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。后烘烤后，冷却所述晶片至室温长凳上为约1分钟。
   9. 放置晶片在旋转涂布机和落的SU-8显影剂几毫米以覆盖晶片的整个区域。制定2分钟，然后旋涂以1000rpm进行30秒。重复该过程三次。
   10. 用2-丙醇冲洗，以确保完全除去未显影SU-8的。白色区域的外观是不完全发展的指示。如果是这样，则重复显影步骤的额外时间。
   11. 硬烘烤在200℃的晶片，以确保所制造的微结构的稳健性。这个步骤是可选的。
   12. 存储与94毫米×15毫米的聚苯乙烯培养皿内的微观结构的3''晶片。
       注意:没有必要进行表面处理，特别是硅烷化，为下一个步骤。
2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）副本的制作:支柱阵列
   1. 在1:10的比例调匀（重量/重量）交联剂和预聚物为50ml管内共为30g。
      注意:使用1:10（体积/体积）比率也工作。
   2. 离心管中，在1800 XG 5分钟去除气泡。
   3. 轻轻地砸在微观结构顶部的PDMS。
      注:如果在该步骤中出现气泡，脱气使用真空泵15-20分钟的样品。
   4. 将样品在烘箱中在65℃下4小时。
      注:固化时间用户之间和不同而不同，与交联剂一起:预聚物的比例。此时将决定的PDMS的刚性。它建议以固化超过2小时，粘到一个固定的固化时间。
   5. 使用手术刀轻轻切利息（印记）的面积的约1cm ^2，它包括约10 ⁵的微腔或'eggcups'。
      注:先切PDMS，然后轻轻地把它剥开。检查PDMS复制品的质量用光学显微镜。
3. 通过复制成型"eggcups"的制作。在下文中，关于'eggcups'的制造两种替代策略进行说明。这两个协议都西米LAR并提供相同的结果:
   1. 策略1
      1. 激活通过氧等离子处理所制造的PDMS压模30秒。临时存储活化邮票成封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
         注:调整曝光时间，如果被用于等离子体等气体。
      2. 放置活化PDMS压模颠倒了（与结构的一侧）在培养皿旁边15毫升管帽。装满三甲基氯硅烷的200微升（TMCS）的上限。关闭培养皿，并让该印模silanize 7分钟。
         注:印花税和/或颜色（白色）改变一些临时的变形可以被观察到。该印模将恢复其初始形状在很短的时间和结构将不会受到影响。
         注:TMCS产生急性吸入和皮肤的毒性，是高度易燃（点火倒叙能够越过相当大的距离发生）。因此，它应该在通风橱中使用远离源小号点火。
      3. 放置在旋转涂布机的结构PDMS邮票上攻了。放几微升的液体PDMS一小滴（约20微升）（1:10重量/重量交联剂:预聚合物）上的结构的顶部。旋涂以1500rpm进行30秒的结构的顶部淀积的PDMS薄层。
         注意:如果印记不符合旋涂机夹头的地方在一个培养皿的盖子上面的印章在其中心的小孔。
      4. 放置在烤箱印模在65℃下4小时，以固化沉积旋涂的PDMS层。
      5. 通过将PDMS压模颠倒了一个玻璃盖玻片＃激活薄的PDMS层，一起25 0毫米直径，使用氧等离子体清洁30秒。迅速进行到下一个步骤。
         注意:与其它的厚度，形状盖玻片，和尺寸可以作为良好。但是，某些细胞结构可能是困难的，这取决于所选盖玻片厚度和客观的可视化放大和/或NA和/或工作距离。检查目标数据表。
      6. 在接触放置印章（与薄旋涂层的一侧）与玻璃盖玻片。按围绕印模的表面用镊子轻轻所有使"粘合"。最后，保持对印章的顶部有一个恒定的压力约10秒。
      7. 30分钟轻轻'剥离'的印记，以盖玻片为'解放'eggcups'后（ 见图1）。用乙醇和干燥的彻底冲洗。如果PDMS"eggcups"不上玻璃盖玻片附着好（ 也就是他们的'unpeeling"步骤中分离），考虑调整等离子清洗机的设置和步骤1.3.1.5重启。
         注:这一步是微妙的。为了要注意避免薄PDMS层的盖玻片和/或剥离的破坏。
      8. 胶的1毫米×1固化的PDMS中的一小片（手柄）毫米×在3体积毫米在含有液体的PDMS一小滴盖玻片的边缘，并作为前固化的PDMS。这将有利于样品的操作之后（参见图1）。这个步骤是可选的。
   2. 策略2
      1. 亲水通过氧等离子处理所制造。PDMS压模30秒。临时存储的激活邮票在一个封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
         注:调整曝光时间，如果被用于等离子体等气体。
      2. 在15瓦特，30秒亲水的直径25毫米的玻璃盖玻片＃0氧等离子体处理。迅速进行到下一个步骤。
         注意:与其它的厚度，形状盖玻片，和尺寸可以作为良好。然而，蜂窝结构将难以根据所选择的盖玻片的厚度和客观特征的可视化（见上文注）。
      3. 旋涂的PDMS（1:10的一小滴w / w的交联剂:预极化ymer）几微升到盖玻片的。旋涂层以1,500rpm进行30秒，约50微米的最终厚度。
      4. 胶1毫米×1毫米×3mm的固化的PDMS在体积小片（手柄）与液体PDMS一小滴盖玻片的边缘，并作为前固化的PDMS。这将有利于样品的操作之后（参见图1）。这个步骤是可选的。
      5. 暂时存放在涂PDMS-盖玻片到一个干净的擦拭培养皿内的灰尘沉积保护。
      6. 穿上每张邮票的顶部硅烷化试剂一滴并让它蒸发1-2分钟。然后，晾干下的N ₂流。
         注意:在此步骤中，可以在蒸发过程中可以观察到该印模的临时变形。用N ₂干燥，而不微观结构的任何永久变形后的印模将恢复其原始形状。
      7. 滴在顶部轻轻硅烷化邮票PDMS-旋涂存储在培养皿玻璃盖玻片。确保双方都在接触时完全平行。请勿按压或将其放置到PDMS涂层盖玻片后移动的印记。
      8. 放置培养皿样品中的真空为1-2小时，以去除气泡。
         注意:确保样品完全水平，以避免戳位移。避免也振动可能由真空泵造成的。
      9. 放置在烤箱的样品在65℃下4小时。
      10. 轻轻的，撕下邮票透露"eggcups"。用乙醇和干燥的彻底冲洗。
          需要实践在这一点上:注意。避免薄PDMS层的盖玻片和/或脱落破损注意。

2.引入细胞进入"Eggcups"

为了引进哺乳动物细胞内的'eggcups"，PDMS表面NE编与细胞外基质的粘附蛋白官能化。这个例子使用纤连蛋白，但其他感兴趣的蛋白质，如胶原，也可以使用。

1. 亲水在氧等离子体清洁器的'eggcups'30秒。
   注:如有需要优化的参数。
2. 准备在PBS 1X的20微克毫升牛源来源的解决方案^-1纤维连接蛋白。
3. 消毒'eggcups'用UV 5分钟。存款纤维连接蛋白溶液一小滴（约20-50微升），以覆盖整个"eggcups"区域，并在室温下孵育1小时。保护从干燥的样品。
4. 轻轻地冲洗了"eggcups'用PBS 1X。重复3次。
   注:该样品是准备在黑暗中立即或使用储存在4℃数周。
5. 介绍的圆柱形定做塑料片63毫米高，外部半径为26毫米和7毫米的半径尺寸到50毫升管（见图^2）20
   注意:使用UV-灭菌物品或消毒他们在先使用。
   注:这件作品可以在实验室中容易制造。或者通过任何可用的机加工车间。
6. 放将13ml该管内细胞培养基（ 见表1）。该介质应填写至少2厘米的圆柱形片以上，以确保样品完全浸没。
   注:对于特定细胞类型的详细信息，以及其他模型系统，如酵母或C.线虫胚胎，并使用相应的介质，参见第5和表1中 。所描述的协议是对海拉，NIH3T3细胞，以及其他细胞系（ 见表1）进行了优化。
7. 介绍轻轻管与平行里面'eggcups'到塑料片的上侧。用锋利的镊子持有使用PDMS手柄样本。轻轻按压盖玻片，直到它坐落在塑料片，联合国的上侧顶直到它完全浸入（ 见图2）。
   注:建议使用锋利的直镊子。具有弯曲镊子，样品的操作是困难的，并可能导致破损。
8. 培养细胞，直到在P60培养皿中80-100％汇合，并通过胰蛋白酶处理收集它们。
   注:细胞可以是野生型，转染或与感兴趣的药物治疗。
   注:避免细胞聚集体，这将避免单细胞进入'eggcups'的形成。为了优化这一步，吸管和胰酶消化下来后彻底。
9. 重新悬浮细胞到5ml培养基。吸取上的"eggcups'的前200微升细胞。
   注意:删除细胞中心尽可能对'eggcups"的顶部，但避免了身体接触。这将防止破损和/或样品的损伤。
10. 离心1800 XG为2分钟。
    注:第一次离心后，检查麦克风roscope的'eggcups'的填充比率。
11. 吸管再次200上的'eggcups'和离心机的顶部细胞微升在1800 xg离心2分钟。为了优化的填充比率重复，共三次。
    注:最后离心后，检查用显微镜"eggcups'的填充比率。如果需要的话，重复填充+离心步骤，直到达到所希望的填充百分比。
12. 删除使用拿着手柄PDMS大幅镊子从管样品。请务必要在这是在"eggcups"不持有"令人不安的"细胞小心（ 见图2）。
13. 将样品在一个培养皿中。冲洗通过上下吹打三次轻轻旁边的微观结构阵列的每一侧（总共4侧）以除去过量的不属于在'eggcups'细胞。
    注:移液过强可能释放部分细胞出从'eggcups"。
14. 用新鲜培养基更换培养基除去nonattached细胞。
    注:在此步骤中可以添加感兴趣的药物。
15. 修复细胞或时间推移imaging.See步4.1做好准备。

Cytokinetic闭环:在"Eggcups"活动细胞动力学3.观察

注意:此示例使用这些转染MYH10-GFP和Lifeact-mcherry肌球蛋白和肌动蛋白HeLa细胞，分别细胞有丝分裂过程中所涉及的cytokinetic闭环的关键活性分子。该装置用的直径25微米的微腔制备。对于自己的观察，使用落射荧光倒置显微镜，配备了60X油浸物镜（1.40 NA，DIC，计划APO）和GFP（肌球蛋白）和TxRed（肌动蛋白）滤波器。备选地，使用一个直立共聚焦显微镜，配备了25X或63X HCX IR APO升水目标（0.95 NA）。对于这个EXAmple，强烈建议使用双胸苷块，有丝分裂块或丝分裂摇断法^21-24同步细胞。
注:用于'eggcups"的PDMS的厚度允许各种既倒和直立放置显微镜目标的用法。

1. 地点"eggcups'变成显微镜保持器并用1ml 10％FCS的L-15观察介质的填充。为了避免蒸发，放置在支架的顶部上的玻璃盖或在medium.Select的60X油浸物镜的顶部应用矿物油的薄层。
   注:L-15介质是足够的非CO ₂大气压。还注意到，DMEM中一些化合物是自体荧光。当使用这种介质时，建议通过用1-2小时的高亮度灯照亮它以光漂白的荧光化合物。
   注:使用DIC成像时避免使用塑料盖。
2. 将持有人与'eggcups"安装前后和在显微镜VATION网上平台。小心集中使用明场光直到"eggcups'和细胞在观察同一平面上。
3. 打开软件和调整参数。选择过滤器TxRed和GFP肌动蛋白和肌球蛋白;调整曝光时间为每个通道。一个典型的采集速率为5秒的两个通道。
   注:曝光时间可以具有根据所使用的设置，染料或其他感兴趣的细胞器进行调整。
4. 选择感兴趣的区域，寻求利用无论是GFP或TxRed通道cytokinetic环。聚焦准确。
   注:环是在肌球蛋白清晰和更容易识别。
5. 运行在两个通道的自动采集，直到该环完全关闭。
   注意:有些漂白可以观察到。调整以减少它在显微镜参数。

4.修正了观察细胞器进入"Eggcups"

此步骤之前或之后，在步骤＃3中进行。细胞可以直接固定在离心步骤之后和染色为感兴趣的细胞器，或在显微镜观察后。这个例子显示了NIH3T3细胞高尔基体，细胞核和肌动蛋白纤维的"eggcups'染色。

1. 在"Eggcups"细胞固定
   1. 准备3％多聚甲醛（PFA）和温暖的37℃。从50毫升管（或显微镜持有人）删除'eggcups"样本，并将其放在一个P35培养皿中。用PBS 1X冲洗一次。
      注:协议为3％多聚甲醛的制备是广泛可用在别处。
      注意:使用丁腈手套和保护眼睛PFA的准备过程中。
   2. 彻底去除PBS和下降1×3％PFA和孵化17分钟。除去PFA，用1ml的PBS 1X中漂洗两次。使用1-毫升0.5％三叔通透细胞上3分钟，并用PBS 1×洗涤两次5分钟。
2. 在"Eggcups"细胞染色
   1. 孵育在1与初级抗体的兔多克隆抗Giantin高尔基体染色细胞1:500稀释在PBS中。放置的抗体溶液100μl的下降到塑料薄膜片，并培育细胞中的'eggcups'内倒置45分钟。
      注:带罩，防止干燥保护样品。
   2. 小心松开"Eggcups"，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
   3. 制备在PBS鸡尾酒与第二抗体的Cy3​​的山羊抗兔（1:1,000）中，用鬼笔环肽的Alexa Fluor 488（1:200）染色的肌动蛋白应力纤维。
   4. 孵育的抗体溶液加入100μl滴细胞在塑料薄膜片和孵育细胞'eggcups'内倒置45分钟。
   5. 发行仔细"eggc跌宕"，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
   6. 孵育放置的1微克毫升^-1的DAPI的PBS100μl的下降到塑料薄膜片细胞细胞核染色和孵育细胞'eggcups'内倒置45分钟。该步骤可以与步骤4.2.3进行。
   7. 小心松开"eggcups"，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
   8. 安装细胞使用15微升甘油:PBS（1:1体积/体积）上的标准显微镜玻片上，密封该样品与指甲油，以避免干燥。
      注:根据"eggcups'的厚度，安装可能很困难。建议将样品存放然后成P35培养皿在PBS，从干燥的保护。
3. 显微镜观测
   注:在这个例子中一个堂堂正正的共聚焦显微镜使用，配备了PMT和混合探测器。一个25X或63点¯xHCX IR APO升水目标（0.95 NA）被选择，以提供样品的广泛的领域，并显示高含量筛选的应用程序的设备的适用性。
   1. 选择25X 63X或水的目标。
      注意:不同的目标可根据不同的应用和信号可以使用。但推荐的高数值孔径物镜的使用。
   2. 将固定样本与"eggcups"，仔细用明光（相衬或DIC），直到"eggcups'和细胞中观察的平面焦点。
   3. 打开软件和调整参数。选择过滤器GFP，Cy3和DAPI肌动蛋白，高尔基体和细胞核的观察，分别;调整曝光时间所有通道。
      注:曝光时间可能会根据不同的设置进行调整。
   4. 选择和聚焦于感兴趣的区域;开始图像捕获（ 见图3）。

TLE"> 5。为适应酵母细胞的观察和线虫胚胎

1. 裂变与芽殖酵母细胞
   注意:此示例使用这些标记RLC1-mcherry和CHD-GFP分别为肌球蛋白和肌动蛋白，裂殖酵母细胞。芽殖酵母细胞不会荧光标记在这里。对于裂殖酵母观测使用倒置旋转盘共聚焦显微镜。 100倍HCX PL APO CS油浸物镜（1.4 NA）用于所有的收购。可替代地，将细胞也用装有20X相衬空气客观LCPlanFl（0.4 NA）的倒相差显微镜观察。在本实施例中，协议是对两种类型的细胞是相同的。
   1. 如上所述准备"eggcups"表面。裂变和出芽酵母细胞中，制备5微米的直径腔（ 见表1）。在这种情况下，表面并不需要与粘附蛋白官能化。
      注:该灌装CAn使用锥形"eggcups"进行优化。这种形状捕获并保留避免在离心后漂洗步骤释放的细胞。填充百分比在大约80％是最佳的。这些圆锥形'eggcups'可以通过深反应离子蚀刻¹³的装置来制造。
   2. 在适当的培养基中培养酵母细胞（ 见表1），直到达到在0.2和0.8的范围内的光密度（OD）。超声处理的酵母细胞的培养物以除去聚集物。
   3. 通过离心插入酵母细胞中"eggcups"。用于离心4毫升适当外径培养的细胞中加入到管与'eggcups'。第一次离心后，轻轻摇动管重新暂停其不在'eggcups'细胞，而在"eggcups"细胞不受到干扰。无需再次打开管，离心和重复此步骤两次。这确保了沉积从文化到空的微腔细胞并会增加填充率。
      注意:当用酵母工作，建议以预热在实验过程中的离心分离机的工作温度
      注:该协议可以在这里停顿了一下，后来持续到12小时。在这种情况下，存储在工作温度下的样品并覆盖它，以防止蒸发。
   4. 将"eggcups"在显微镜座，并填写与成像过滤消毒媒体的持有人。现在冲洗细胞用相同的介质，直到浮动酵母细胞被有效地除去。注意不要在漂洗过程中扰乱"eggcups'细胞。
   5. 选择100X油客观，谨慎关注。打开软件和调整参数。对于裂殖酵母中，选择肌动蛋白和肌球蛋白的过滤器GFP和TxRed和调整曝光时间两个通道。一个典型的采集速率为3秒。
      注:根据荧光团，标记的类型和设置，曝光时间为其他系统而变化。
2. 线虫胚胎
   注:此示例使用C.线虫胚胎25-30微米，宽50-55微米长。如在²⁵所示的胚胎中培养。如何操纵C.一个简单的可视化协议线虫可以在²⁶找到。使用装有40X空气目标0.55 NA的倒置相差显微镜下进行观察。
   1. 以上所描述和25微米直径制备'eggcups'表面（ 见表1）。在这种情况下，表面并不需要与粘附蛋白官能化。
   2. 文化C.线虫胚胎在适当培养基中（ 见表1）。
   3. 如上所述通过离心将胚胎'eggcups"使用超纯水作为培养基（见2.6至2.12）。
      注意:胚胎'行为'通常在超纯水中的实验的持续时间。可替代地用于长期实验生理M9的缓冲区。
   4. 冲洗上述（见2.14）的样品。放置'eggcups'变成显微镜座。选择40X空中目标，并认真关注。打开软件和调整参数。选择3秒的采集速率。

结果

该'eggcups'（EC）是一种新型的高含量筛选方法，它允许导向细胞和胚胎的可视化在3D环境。此外，某些细胞过程，这是很难在标准2D（平面）培养物来观察，可以通过这种新的方法观察到的。 图1a显示了EC微细加工步骤的概要（参见章节1中的上述协议）。该方法简便，快捷，高效，无需特殊设备的任何要求。 图1b和1c显示了一个大型的图片和"eggcups"分别放...

讨论

副本成形，为了制造"eggcups"使用。的制造过程中不需要清洁室;它是容易和简单，但也有一些实践可能是需要的。具体地，释放PDMS压模是为了生产高品质'eggcups'的一个大的面积中最关键的步骤。由于这个原因，特别小心在这一步骤才能作出。如果这一步失败反复，考虑到优化之前的硅烷化和等离子结合等离子清洗机的参数。硅烷化不足，会导致邮票的PDMS膜粘着强。如果发生此种情况，培养?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2