Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti

Riepilogo

Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l'orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.

Abstract

cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 ⁵ cavità / cm ^2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un'architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato 'portauova', SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l'adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l'identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell'anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l'allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.

Introduzione

Di corrente in saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti ^1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all'interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di questi farmaci se non riescono quando applicata a modelli animali a causa della condizione coltura 2D artificiale nelle prime fasi di screening di farmaci. Inoltre, utilizzando questo approccio, organelli cellulari specifici non possono essere correttamente visualizzati, ad esempio l'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare, e in generale strutture che si stanno evolvendo nel piano perpendicolare al piano di osservazione. Alcuninuovi test 2D sono stati proposti al fine di superare gli inconvenienti suddetti e importanti informazioni sull'organizzazione citoscheletro sono stati osservati ^2,3. Tuttavia, questi test ancora presenti una seria limitazione: celle mostrano un fenotipo molto diffuse a differenza di quanto si osserva in vivo, in cui le cellule presentano un'architettura 3D. Tali artefatti associati al metodo di coltura possono innescare caratteristiche non fisiologici, come fibre di stress potenziate ^1,4,5.

Tridimensionali saggi di colture cellulari forniscono molteplici vantaggi rispetto ai 2D ambienti ^6,7. Essi sono fisiologicamente più rilevanti, ed i risultati sono quindi significativi. Come esempio, cellule incorporati in idrogel mostrano strutture 3D-like ma le loro morfologie differiscono da una cella all'altra ^8,9. Tuttavia, le loro morfologie differiscono da una cella all'altra, il che complica applicazioni di screening. Una strategia alternativa è quella di incorporare singolocellule in cavità microfabbricate ^10,11. la posizione delle cellule, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule possono quindi diventare normalizzata. Oltre a fornire l'architettura 3D-come le cellule, microcavità permette anche per gli studi di screening ad alto contenuto ^10,12-14; singole cellule possono essere ordinati in microarray e organelli cellulari e le loro evoluzioni possono essere osservati in parallelo. Questa regolarità fornisce buone statistiche con un basso numero di cellule e migliori risoluzioni temporali / spaziale. Composti utili sono facili da identificare in maniera affidabile.

In questo studio, dimostriamo la fabbricazione e l'applicazione di un nuovo sistema di celle singola cultura 3D come ad alto contenuto di screening applicazioni ^10,12,13. Il dispositivo è costituito da una matrice di microcavità elastomerici (10 ⁵ cavità / cm ^2), coniati 'eggcups' (EC). Dimensioni e volume totale di CE in questo lavoro sono ottimizzati per il volume tipico delle singole cellule NIH3T3 e HeLadurante la divisione cellulare. Morfologia delle cavità cilindriche - - è selezionato per la forma delle cellule correttamente orientare per la visualizzazione dei processi attivi. Stampaggio replica viene utilizzato per una vasta gamma di modello CE su un (PDMS) strato sottile polidimetilsilossano aderito su un bicchiere coprivetrino ^15,16. Le cellule vengono introdotti nella CE per centrifugazione. Riportiamo qui di osservazione e la normalizzazione degli organelli cellulari (stress fibers di actina, apparato del Golgi e nucleo) in 3D (CE) in confronto con le stesse celle 2D (piatta) superfici. Riportiamo anche l'osservazione dei processi dinamici attivi quali la chiusura dell'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare ^17. Infine, mostriamo risultati di questa metodologia su altri sistemi con pareti rigide, come il lievito in erba, lievito di fissione e C. embrioni elegans che conferma l'applicabilità della nostra metodologia per una vasta gamma di sistemi modello.

Abbiamo poi presentiamo una p dettagliato ed esaustivoROTOCOLLO al fine di fabbricare e applicare le "Portauova" per microfabbricazione 3D. Il nostro approccio è semplice e non richiede una camera pulita. Prevediamo che questa nuova metodologia sarà particolarmente interessante per test di screening di farmaci e medicina personalizzata, in sostituzione di piastre di Petri. Infine, il dispositivo sarà utile per studiare le distribuzioni di cellule risposte a stimoli esterni, ad esempio nel cancro ¹⁸ o nella ricerca di base ^19.

Protocollo

1. Microfabbricazione di 'Portauova'

1. Realizzazione del Master: microcavità Array
   1. Scaldare un wafer 3 '' di silicio fino a 200 ° C per evaporare l'eventuale presenza di umidità.
   2. Spin-coat un sottile strato di SU-8 fotosensibile. Regolare il volume di resina e filatura velocità a seconda del tipo e dello spessore photoresist desiderato. Questo spessore detterà la profondità dei 'portauova' (EC). Per uno strato spesso 30 micron e SU-8 2025, spin-coat a 2.800 giri al minuto.
   3. Pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli.
   4. Pre-cuocere il wafer a 95 ° C per 3 minuti (passaggio 2 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli.
   5. caricare ilwafer sul allineatore maschera per esposizione ai raggi UV. Posizionare la maschera fotolitografica su di esso. La maschera mostra un modello di caratteristiche circolari (dischi) di 20 micron di diametro. Garantire un perfetto contatto tra loro.
      NOTA: Diversi produttori offrono maschere di fotolitografia. La risoluzione spaziale determinerà il costo finale. maschere Acetato offrono una risoluzione accettabile (≈10 micron) a basso costo. maschere di cromo fornire una migliore risoluzione, ma sono più costosi. Adattare i diametri dei dischi (dalla maschera fotolitografica) al volume delle cellule. Dimensioni di dischi sulla maschera determinerà il diametro della cavità del dispositivo. I piccoli diametri porteranno ad un riempimento basso; troppo grande diametro non limiterà le cellule. Per le cellule HeLa e NIH3T3, diametro di 20 micron a 25 micron sono suggeriti.
   6. Controllare l'alimentazione della lampada UV prima esposizione e ottimizzare il tempo di esposizione. Irradiare (lunghezza d'onda = 365 nm) per 41,5 secondi (o il tempo di esposizione ottimale) a250 mJ / cm ^2.
      NOTA: SU-8 2025 è un fotoresist negativo, il che significa che le regioni esposte a raggi UV saranno curate. In questo caso, le caratteristiche circolari erano nere e trasparente resto. lavoro fotosensibile positiva nel modo opposto: le regioni non esposte sono guariti. Selezionare fotoresist conseguenza, a seconda del design e foto-maschera.
      NOTA: proteggere gli occhi dai raggi UV con occhiali di sicurezza adeguate.
   7. Rimuovere delicatamente la maschera dallo strato fotosensibile.
   8. Post-bake il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Post-bake il wafer a 95 ° C per 3 minuti (passaggio 2 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli. Dopo post-cottura, raffreddare la cialda a temperatura ambiente in panchina per circa 1 min.
   9. Posizionare il wafer nello spin-verniciatore e rilasciare qualche mm di SU-8 sviluppatore per coprirel'intera area wafer. Sviluppare per 2 minuti e poi spin-coat a 1.000 rpm per 30 sec. Ripetere la procedura per tre volte.
   10. Risciacquare con 2-propanolo per assicurare la completa rimozione non sviluppata SU-8. Aspetto delle regioni bianche è un'indicazione di sviluppo incompleto. Se è così, ripetere la fase di sviluppo di un tempo supplementare.
   11. Hard-bake il wafer a 200 ° C per assicurare robustezza delle microstrutture fabbricati. Questo passaggio è facoltativo.
   12. Conservare il 3 'wafer' con microstrutture all'interno di un 94 millimetri x 15 mm di polistirene Petri.
       NOTA: Non vi è alcuna necessità di un trattamento di superficie, in particolare silanizzazione, per i passi successivi.
2. Realizzazione della Polidimetilsilossano (PDMS) Replica: Colonne Array
   1. Mescolare in un rapporto 1:10 (w / w) il cross-linker e la pre-polimero per un totale di 30 g in un tubo da 50 ml.
      NOTA: Utilizzando un rapporto 1:10 (v / v) sta lavorando.
   2. Centrifugare la provetta a 1.800 xg per 5 min arimuovere le bolle d'aria.
   3. Eliminare delicatamente le PDMS sulla parte superiore delle microstrutture.
      NOTA: Se le bolle d'aria appaiono durante questa fase, degassare il campione utilizzando una pompa a vuoto per 15-20 min.
   4. Porre il campione in un forno a 65 ° C per 4 ore.
      NOTA: Il tempo di indurimento varia tra utenti e, insieme con il cross-linker: percentuale pre-polimero. Questa volta detterà la rigidità dei PDMS. Si raccomanda di curare più di 2 ore e di attenersi a un tempo di polimerizzazione fisso.
   5. Utilizzare un bisturi per tagliare delicatamente l'area di interesse (timbro) di circa 1 cm ^2, che comprende circa 10 ⁵ microcavità o 'portauova.
      NOTA: Tagliare prima i PDMS e poi, buccia via delicatamente. Controllare la qualità della replica PDMS con un microscopio ottico.
3. Fabbricazione di '' portauova per stampaggio replica. Nel seguito, sono descritti due strategie alternative per la realizzazione di "portauova. Entrambi i protocolli sono similar e fornire risultati identici:
   1. strategia 1
      1. Attivare il timbro PDMS fabbricato da trattamento al plasma di ossigeno per 30 sec. Memorizzare temporaneamente i francobolli attivati ​​in un piatto chiuso Petri per impedire il deposito di polvere.
         NOTA: Regolare il tempo di esposizione in caso di utilizzo di altri gas per il plasma.
      2. Posizionare i PDMS attivate timbro a testa in su (il lato con le strutture) in una capsula di Petri accanto a un tappo di tubo da 15 ml. Riempire il tappo con 200 ml di Trimetilclorosilano (PTM). Chiudere la piastra di Petri e lasciare che il silanizzata francobollo per 7 min.
         NOTA: Alcune deformazione temporanea sul timbro e / o cambiamenti di colore (bianco) si può osservare. Il francobollo sarà recuperare la sua forma originale in breve tempo e le strutture non saranno interessati.
         NOTA: TMCS produce la tossicità per inalazione e per via cutanea acuta, ed è altamente infiammabile (con flashback di accensione in grado di verificarsi in tutta distanze considerevoli). Di conseguenza, dovrebbe essere usato in una cappa di distanza dalla sorgentes di accensione.
      3. Posizionare il timbro PDMS sulla spin-coater con le strutture a testa in su. Mettere una piccola goccia di pochi microlitri (circa 20 ml) di PDMS liquidi (1:10 w / w cross-linker: pre-polimero) sopra le strutture. Spin-coat a 1.500 rpm per 30 sec per depositare un sottile strato di PDMS sopra le strutture.
         NOTA: Se il timbro non si adatta il posto mandrino spin-coater il timbro sulla cima di un coperchio capsula di Petri con un piccolo foro al centro.
      4. Posizionare il timbro in forno a 65 ° C per 4 ore per curare il livello PDMS spin-rivestito depositato.
      5. Attiva il livello PDMS sottile posizionando il timbro PDMS a testa, insieme con un vetro coprioggetti # 0 di 25 mm, utilizzando pulitore plasma di ossigeno per 30 sec. Procedere rapidamente alla fase successiva.
         NOTA: coprioggetto con altri spessori, forme e dimensioni, può essere utilizzato come bene. Tuttavia, alcune strutture cellulari potrebbe essere difficile visualizzare a seconda dello spessore coprioggetto selezionato e obiettivoingrandimento e / o NA e / o la distanza di lavoro. Controllare il foglio di dati oggettivi.
      6. Mettere in contatto il timbro (il lato con il sottile strato di spin-patinata) con il coprioggetto di vetro. Premete delicatamente tutto intorno alla superficie del timbro con una pinzetta per rendere il 'legame'. Infine, mantenere una pressione costante sulla parte superiore del timbro per circa 10 sec.
      7. Dopo 30 minuti delicatamente 'buccia' il timbro fuori dal vetrino, al fine di 'liberare' 'portauova' (vedi Figura 1). Sciacquare abbondantemente con etanolo e asciugare. Se PDMS 'portauova' non sono ben rispettati sul vetrino di vetro (ad esempio spiccano durante la fase di 'staccandosi'), prendere in considerazione la regolazione delle impostazioni del pulitore plasma e riavviare al punto 1.3.1.5.
         NOTA: Questo passaggio è delicato. Prestare attenzione al fine di evitare la rottura del vetrino e / o distacco dello strato PDMS sottile.
      8. Incollare un piccolo pezzo (maniglia) di PDMS curato di 1 mm x 1mm x 3 mm di volume al bordo del vetrino con una piccola goccia di PDMS liquidi e curare le PDMS come prima. Ciò faciliterà la manipolazione del campione in seguito (vedi Figura 1). Questo passaggio è facoltativo.
   2. strategia 2
      1. Hydrophilize il PDMS fabbricati francobolli di trattamento al plasma di ossigeno per 30 sec. Memorizzare temporaneamente i francobolli attivati ​​in un piatto Petri chiusa per evitare la deposizione di polvere.
         NOTA: Regolare il tempo di esposizione in caso di utilizzo di altri gas per il plasma.
      2. Hydrophilize il coprioggetto di vetro del diametro # 0 ossigeno trattamento al plasma di 25 mm a 15 W per 30 sec. Procedere rapidamente alla fase successiva.
         NOTA: coprioggetto con altri spessori, forme e dimensioni, può essere utilizzato come bene. Tuttavia, le strutture cellulari sarà difficile visualizzare a seconda dello spessore coprioggetto selezionato e caratteristiche oggettive (vedi nota sopra).
      3. Spin-coat una piccola goccia di PDMS (1:10 w / w cross-linker: pre-polYmer) di pochi microlitri sul vetrino. Spin-coat a 1.500 rpm per 30 sec per uno spessore finale di circa 50 micron.
      4. Colla un piccolo pezzo (maniglia) di PDMS induriti 1 mm x 1 mm x 3 mm volume al bordo del vetrino con una piccola goccia di PDMS liquidi e curare le PDMS come prima. Ciò faciliterà la manipolazione del campione in seguito (vedi Figura 1). Questo passaggio è facoltativo.
      5. Memorizzare temporaneamente i coprioggetti PDMS-rivestiti su un panno pulito all'interno di una capsula di Petri per proteggere dal deposito di polvere.
      6. Mettere una goccia di reagente silanizzazione in cima ad ogni timbro e farlo evaporare per 1-2 min. Poi, asciugarle sotto flusso di N _2.
         NOTA: In questa fase, una deformazione temporanea del timbro può essere osservato durante l'evaporazione. Il francobollo sarà recuperare la sua forma originale dopo l'asciugatura con N ₂ senza alcuna deformazione permanente delle microstrutture.
      7. Eliminare molto delicatamente il timbro silanizzata in cima allaPDMS-spin rivestite coprioggetto di vetro memorizzati nella scatola di Petri. Assicurarsi che entrambe le parti sono completamente parallelo durante il contatto. Evitare di premere o spostare il timbro dopo immissione sul vetrino PDMS rivestite.
      8. Porre la capsula di Petri con i campioni nel vuoto per 1-2 ore per rimuovere le bolle d'aria.
         Nota: Assicurarsi che i campioni siano completamente orizzontale per evitare lo spostamento timbro. Anche evitare vibrazioni potenzialmente causata dalla pompa a vuoto.
      9. Porre i campioni in forno a 65 ° C per 4 ore.
      10. Delicatamente, staccare il francobollo per rivelare 'portauova. Sciacquare abbondantemente con etanolo e asciugare.
          La pratica è necessaria a questo punto: NOTA. Prestare attenzione per evitare la rottura del vetrino e / o distacco dello strato PDMS sottile.

2. L'introduzione di cellule nel 'Eggcups'

Al fine di introdurre all'interno di cellule di mammifero "portauova ', PDMS superficie needs essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione della matrice extracellulare. Questo esempio utilizza fibronectina ma altre proteine ​​di interesse, come il collagene, potrebbe essere utilizzato.

1. Hydrophilize il 'portauova' nel pulitore plasma di ossigeno per 30 sec.
   NOTA: Ottimizzare i parametri, se necessario.
2. Preparare una soluzione in PBS 1x di 20 mg ml ^-1 fibronectina da fonti bovina.
3. Sterilizzare il 'portauova' con UV per 5 min. Depositare una piccola goccia (circa 20-50 ml) di soluzione fibronectina per coprire l'intera area 'portauova' e incubare per 1 ora a RT. Proteggere il campione dalla essiccazione.
4. Lavare delicatamente le 'portauova' con PBS 1x. Ripetere 3 volte.
   NOTA: Il campione è pronto per l'uso immediatamente o conservato a 4 ° C al buio per diverse settimane.
5. Introdurre un pezzo di plastica su misura cilindrico di 63 mm di altezza, 26 mm di raggio esterno e 7 mm di dimensioni raggio interno in un tubo da 50 ml (vediFigura 2) ²⁰
   ATTENZIONE: gli elementi Usa UV-sterilizzato o sterilizzare loro utilizzo precedente.
   NOTA: Questo pezzo può essere facilmente fabbricato in laboratorio. o da qualsiasi officina disponibili.
6. Mettere 13 ml di mezzo di coltura cellulare all'interno del tubo (vedi Tabella 1). Il mezzo deve riempire almeno 2 cm sopra il pezzo cilindrico per assicurare immersione completa del campione.
   NOTA: Per i dettagli di specifici tipi cellulari e altri sistemi modello come il lievito o C. elegans embrioni, e il relativo supporto utilizzato, fare riferimento alla sezione 5 e Tabella 1. Il protocollo descritto è stato ottimizzato per HeLa, cellule NIH3T3, e altre linee cellulari (vedi tabella 1).
7. Introdurre delicatamente i "portauova 'all'interno del tubo e parallela al lato superiore della parte in plastica. Utilizzare le pinzette taglienti per tenere il campione utilizzando la maniglia PDMS. Premere delicatamente il coprioggetto fino giace sopra il lato superiore della parte in plastica, until è completamente immerso (vedi figura 2).
   NOTA: Si consiglia di utilizzare le pinzette taglienti e dritto. Con pinzette curvi, la manipolazione del campione è difficile e può causare la rottura.
8. cellule di coltura fino a 80-100% confluenza in un P60 capsula di Petri e alla loro raccolta da tripsinizzazione.
   NOTA: Le celle possono essere wild-type, trasfettate o trattati con qualsiasi farmaco di interesse.
   NOTA: Evitare la formazione di aggregati di cellule che eviterà singole cellule per entrare nel 'portauova. Per ottimizzare questo passaggio, pipetta su e giù con cura dopo tripsinizzazione.
9. Risospendere le cellule in terreno di coltura 5 ml. Pipettare 200 microlitri di cellule sulla parte superiore dei 'portauova.
   NOTA: goccia cellule più centrato possibile sopra dei 'portauova' ma evitando il contatto fisico. Questo impedirà la rottura e / o danneggiamento del campione.
10. Centrifugare a 1800 xg per 2 min.
    NOTA: Dopo la prima centrifugazione, il check-in un microfonoROSCOPE la percentuale di riempimento dei 'portauova.
11. Dispensare ancora 200 ml di cellule sulla parte superiore dei 'Portauova' e centrifugare a 1.800 xg per 2 minuti. Ripetere per un totale di tre volte per ottimizzare la percentuale di riempimento.
    NOTA: Dopo l'ultima centrifugazione, verificare con un microscopio la percentuale di riempimento del 'portauova. Se necessario, ripetere le operazioni di riempimento + centrifugazione fino a raggiungere la percentuale di riempimento desiderato.
12. Rimuovere il campione dalla provetta utilizzando le pinzette taglienti che fissano il manico PDMS. Assicurarsi di fare attenzione a non le cellule 'inquietanti' che si svolgono negli Portauova "(vedi figura 2).
13. Trasferire il campione in una capsula di Petri con il mezzo. Risciacquare per rimuovere l'eccesso di cellule che non sono negli portauova 'pipettando su e giù tre volte dolcemente accanto a ciascun lato (totale 4 lati) della matrice microstruttura.
    NOTA: Pipetting troppo forte può rilasciarealcune cellule dalla 'portauova'.
14. Sostituire il mezzo con terreno fresco per rimuovere le cellule nonattached.
    NOTA: In questa fase un farmaco di interesse può essere aggiunto.
15. Fissare le cellule o prepararli per time-lapse imaging.See passo 4.1.

3. L'osservazione di dinamiche cellulari attivi in ​​'Eggcups': Cytokinetic Anello di chiusura

NOTA: Questo esempio utilizza cellule HeLa che sono trasfettate con MYH10-GFP e Lifeact-mCherry per miosina e actina, rispettivamente chiave molecole attive coinvolte nella chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Il dispositivo è preparato con microcavità di 25 micron di diametro. Per loro osservazione, un microscopio invertito epifluorescenza è stato usato, equipaggiato con un obiettivo 60X olio (1,40 NA, DIC, Plan Apo) e GFP (miosina) e TxRed (actina) filtri. In alternativa un microscopio confocale eretta stato usato, dotato di 25X o obiettivo acqua L 63X HCX IR APO (0,95 NA). Per questo example, si consiglia vivamente di sincronizzare celle utilizzando il blocco doppio timidina, blocco mitotico o un metodo shake-off mitotico ^21-24.
NOTA: Lo spessore dei PDMS utilizzati per il 'portauova' permette l'uso di una varietà di obiettivi sia in microscopi invertiti e retto posizionate.

1. Place 'Portauova' in un supporto del microscopio e riempirlo con 1 ml di FCS L-15 medio di osservazione di 10%. Per evitare l'evaporazione, posizionare un coperchio di vetro sulla parte superiore del contenitore o applicare un sottile strato di olio minerale in cima alla medium.Select dell'obiettivo olio 60X.
   NOTA: L-15 è sufficiente per non CO ₂ atmosfere. Si noti inoltre che alcuni composti di DMEM sono auto-fluorescente. Quando si utilizza questo mezzo, si raccomanda di photobleach i composti fluorescenti illuminandolo con una lampada ad alta intensità per 1-2 ore.
   NOTA: Evitare l'uso di coperchi di plastica quando si lavora con l'imaging DIC.
2. Posizionare il supporto con 'Portauova' e ossermedia vazione al microscopio. Primo accuratamente con luce brightfield fino agli portauova ', e le cellule sono nello stesso piano di osservazione.
3. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare i filtri TxRed e GFP per actina e miosina; regolare il tempo di esposizione per ciascun canale. Un tasso di acquisizione tipico è 5 secondi per entrambi i canali.
   NOTA: Il tempo di esposizione può essere regolata a seconda della configurazione utilizzata, tintura o di altri organelli cellulari di interesse.
4. Selezionare la regione di interesse e cercare un anello cytokinetic utilizzando la GFP o il canale TxRed. Mettere a fuoco con precisione.
   NOTA: L'anello è più nitida in miosina e più facile da riconoscere.
5. Eseguire l'acquisizione automatica in entrambi i canali fino a quando l'anello è completamente chiuso.
   NOTA: si può osservare Alcuni photobleaching. Regolare i parametri del microscopio per ridurlo.

4. L'osservazione di cellulari fissi Organelli nelle 'Eggcups'

Questa fase può essere eseguita prima o dopo il punto # 3. Le cellule possono essere fissate direttamente dopo la fase di centrifugazione e colorate per l'organello di interesse o dopo l'osservazione al microscopio. Questo esempio mostra la colorazione delle fibre apparato di Golgi, nucleo e actina su fibroblasti NIH3T3 in 'portauova.

1. Fissazione delle cellule negli Eggcups '
   1. Preparare 3% paraformaldeide (PFA) e calda a 37 ° C. Rimuovere il campione '' portauova dal tubo da 50 ml (o il titolare del microscopio) e posizionarlo all'interno di una capsula di Petri P35. Risciacquare una volta con PBS 1x.
      NOTA: Protocolli per la preparazione di 3% paraformaldeide sono ampiamente disponibili altrove.
      ATTENZIONE: Utilizzare guanti di nitrile e occhiali protettivi durante la preparazione del PFA.
   2. Rimuovere completamente il PBS e rilasciare 1 ml di 3% PFA e incubare per 17 min. Rimuovere la PFA e lavare due volte con 1 ml di PBS 1X. cellule permeabilize usando 1 ml di 0,5% Triton per 3 min e lavare due volte con PBS 1x per 5 min.
2. La colorazione delle cellule in '' Portauova
   1. Incubare le cellule per Golgi apparecchi colorazione con l'anticorpo primario policlonale di coniglio anti-Giantin in una diluizione 1: 500 in PBS. Mettere una goccia di 100 ml di soluzione di anticorpi su un foglio di pellicola di plastica e incubare le cellule all'interno dei 'portauova' a testa in giù per 45 min.
      NOTA: Proteggere il campione con un coperchio per evitare l'essiccazione.
   2. Rilasciare attentamente le 'Eggcups' e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
   3. Preparare un cocktail in PBS con l'anticorpo secondario Cy3 capra anti-coniglio (1: 1.000) e con falloidina Alexa Fluor 488 (1: 200) per la colorazione stress fibers di actina.
   4. Incubare le cellule con una goccia di 100 ml di soluzione di anticorpi su un foglio di pellicola di plastica e incubare cellule all'interno dell 'portauova' a testa in giù per 45 min.
   5. Uscita con attenzione il 'eggcup 'e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
   6. Incubare le cellule per la colorazione nucleo mettendo una goccia di 100 ml di 1 mg ml ^-1 DAPI in PBS su un foglio pellicola di plastica e incubare cellule all'interno dell 'portauova' a testa in giù per 45 min. Questa fase può essere eseguita con il punto 4.2.3.
   7. Rilasciare attentamente le 'portauova' e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
   8. cellule Mount utilizzando una Glicerina 15 ml: PBS (1: 1 v / v) su un vetrino da microscopio di serie e sigillare il campione con smalto per evitare l'essiccamento.
      NOTA: A seconda dello spessore '' portauova, il montaggio può essere difficile. Si consiglia di conservare il campione in un P35 Petri in PBS, protetto da essiccazione.
3. Microscopio osservazione
   NOTA: In questo esempio viene utilizzato un microscopio confocale verticale, dotata di rilevatori PMT e ibridi. Un 25X o 63 Obiettivo acqua L X HCX IR APO (0,95 NA) è stata selezionata per fornire un ampio campo del campione e mostra applicabilità del dispositivo per applicazioni ad alta contenuto screening.
   1. Selezionare l'obiettivo 25X o 63X acqua.
      NOTA: diversi obiettivi possono essere utilizzati a seconda dell'applicazione e del segnale. Ma si raccomanda l'utilizzo di elevati obiettivi apertura numerica.
   2. Mettere il campione fissato con i "portauova 'e mettere a fuoco con cura usando la luce campo chiaro (contrasto di fase o DIC) fino agli Portauova' e le cellule sono nel piano di osservazione.
   3. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare i filtri GFP, Cy3 e DAPI per actina, Golgi e di osservazione nucleo, rispettivamente; regolare il tempo di esposizione per tutti i canali.
      NOTA: Il tempo di esposizione può essere regolata a seconda della configurazione.
   4. Selezionare e mettere a fuoco la regione di interesse; avviare l'acquisizione delle immagini (vedi figura 3).

tle "> 5. Adattamento per l'osservazione di cellule di lievito e C. elegans Embryo

1. Le cellule di lievito di fissione e in erba
   NOTA: Questo esempio utilizza cellule di lievito di fissione, che sono contrassegnati con RLC1-mCherry e CHD-GFP rispettivamente miosina e actina,. Le cellule di lievito in erba non sono fluorescente qui. Per l'osservazione fissione lievito è stato utilizzato un disco rotante confocale microscopio invertito. Un obiettivo olio 100X HCX PL APO CS (1,4 NA) è stato utilizzato per tutte le acquisizioni. In alternativa, le cellule sono state anche osservate con un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di aria contrasto di fase 20X LCPlanFl (0,4 NA). In questo esempio, il protocollo è identica per entrambi i tipi di cellule.
   1. Preparare la superficie 'portauova' come descritto sopra. Per la fissione e cellule di lievito in erba, preparare cavità di 5 micron di diametro (vedi tabella 1). In questo caso, la superficie non deve essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione.
      NOTA: Il CA di riempimenton essere ottimizzato utilizzando 'portauova' coniche. Questa forma cattura e conserva le cellule evitando rilasciando durante la fase di risciacquo dopo centrifugazione. Riempimento percentuale ottimale a circa 80%. Questi '' portauova coniche possono essere fabbricati mediante profonda Reactive Ion Etching ^13.
   2. Cellule di lievito cultura in terreni di coltura corretto (vedere Tabella 1) fino a raggiungere una densità ottica (OD) nell'intervallo di 0,2 e 0,8. Sonicare la cultura di cellule di lievito per rimuovere aggregati.
   3. Inserire cellule di lievito in 'portauova' per centrifugazione. Per centrifugazione, 4 ml di cellule in coltura in OD venga aggiunta sul tubo con 'portauova. Dopo la prima centrifugazione, scuotere delicatamente il tubo per risospendere le cellule che non sono negli portauova ', mentre le cellule nel' portauova 'non sono disturbati. Senza aprire di nuovo il tubo, centrifuga e ripetere questo passaggio per due volte. Questo assicura la deposizionedi cellule della cultura nelle microcavità vuoti e aumenterà la percentuale di riempimento.
      NOTA: Quando si lavora con il lievito, si raccomanda di preriscaldare la centrifuga alla temperatura di lavoro durante gli esperimenti
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e ha continuato fino a 12 ore più tardi. In questo caso, conservare il campione alla temperatura di lavoro e coprire per evitare l'evaporazione.
   4. Place 'portauova' in un supporto del microscopio e riempire il supporto con filtro sterilizzato media per l'imaging. Ora lavare le cellule con lo stesso supporto finché le cellule di lievito galleggianti sono rimossi efficientemente. Fare attenzione a non disturbare le cellule in 'portauova' durante il processo di risciacquo.
   5. Selezionare l'obiettivo di olio 100X e mettere a fuoco con attenzione. Aprire il software e regolare i parametri. Per lievito di fissione, selezionare la GFP filtri e TxRed per actina e miosina e regolare il tempo di esposizione per entrambi i canali. Un tasso di acquisizione tipico è 3 sec.
      NOTA: a secondail fluoroforo, il tipo di tagging e il set-up, il tempo di esposizione varia per altri sistemi.
2. C. elegans Embrione
   NOTA: Questo esempio utilizza C. elegans embrioni 25-30 micron di larghezza e 50-55 micron lungo. Embrioni sono state coltivate come indicato in ^25. Un semplice protocollo visiva di come manipolare C. elegans può essere trovato in ^26. L'osservazione è stata effettuata utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di aria 40X 0,55 NA.
   1. Preparare la superficie 'portauova' come sopra descritta e 25 micron di diametro (vedi Tabella 1). In questo caso, la superficie non deve essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione.
   2. Culture del C. embrioni elegans in terreni di coltura corretto (vedi tabella 1).
   3. Inserire embrioni in "Portauova" per centrifugazione come descritto in precedenza (vedi sezione 2,6-2,12) utilizzando acqua ultrapura come mezzo di coltura.
      NOTA: Gli embrioni sono stati 'comportando' normalmente in acqua ultrapura per tutta la durata dell'esperimento. In alternativa, utilizzare un buffer fisiologico M9 per esperimenti a lungo termine.
   4. Lavare il campione come sopra descritto (vedi paragrafo 2.14). Posizionare i 'portauova' in un supporto microscopio. Selezionare l'obiettivo di aria 40X e mettere a fuoco con attenzione. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare un tasso di acquisizione di 3 sec.

Risultati

Le '' portauova (CE) sono un metodo di screening ad alto contenuto-romanzo che permette la visualizzazione di cellule orientate ed embrioni in un ambiente 3D. Inoltre, alcuni processi cellulari, che sono difficili da osservare nelle culture standard, 2D (flat), possono essere osservati da questo nuovo metodo. La figura 1a mostra una sintesi della procedura per la microfabbricazione CE (vedi anche la sezione 1 del protocollo sopra descritto ). Il metodo è semplice, veloce, efficiente e senza alc...

Discussione

stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i 'portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di 'portauova' alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del pl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2