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要約

私たちは、デバイスと、細胞や胚を研究するための新しい方法を報告しています。単一細胞が正確にマイクロキャビティアレイに並べられます。その3Dの閉じ込めは、生理的条件に遭遇した3D環境への第一歩であり、細胞小器官の向きを可能にします。セル形状を制御することにより、この設定は、標準的なアッセイで報告変動を最小限に抑えることができます。

要約

生物細胞は、通常、平坦（2D）表面上に観察されます。この条件は、生理的ではなく、表現型と形状は非常に可変です。そのような環境下での細胞に基づくスクリーニングは、したがって、重大な制限があります細胞小器官は、異種および/または特定の細胞小器官が適切に可視化することができない極端な表現型、細胞形態とサイズを示しています。また、in vivoでの細胞は、3D環境に位置しています。このような状況では、細胞は主に組織の周囲の細胞外マトリックスとの相互作用の異なる表現型を示します。標準及び細胞ベースのアッセイのための生理学的に関連する3次元環境内の単一のセルの順序を生成するために、ここでは、インビトロの3D細胞培養のためのデバイスの微細化およびアプリケーションを報告します。このデバイスは、マイクロキャビティの2次元配列（典型的には、10 5の空洞/ cm 2）を、単一細胞または胚で満たされ、それぞれ構成されています。細胞ポジション、形状、極性および内部細胞組織は、3Dアーキテクチャを示す正規化となります。私たちは、カバーガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層の上に、「eggcups '、パターンにマイクロキャビティの配列をレプリカ成形を使​​用していました。空洞は、接着を促進するために、フィブロネクチンで被覆しました。細胞を遠心分離により挿入しました。充填率は80％まで許容するシステムごとに最適化しました。細胞および胚の生存率を確認しました。私たちは、このような核やゴルジ装置などの細胞小器官の可視化のためにこの手法を適用し、このような細胞有糸分裂中の細胞質分裂のリングの閉鎖などのアクティブなプロセスを、研究します。このデバイスは、ゴルジ体や核の位置合わせのための細胞質分裂の閉環と固めの表現型の間に、このような定期的な蓄積とミオシンとアクチンの不均一性などの新機能、の同定を可能にしました。我々は、哺乳動物細胞、分裂酵母、出芽酵母、C.するための方法を特徴としますエレガンスワットそれぞれの場合の具体的な適応i番目。最後に、このデバイスの特性は、薬物スクリーニングアッセイおよびパーソナライズされた医療のために特に興味深いもの。

概要

インビトロでの細胞ベースのアッセイにおける電流は、（2D）二次元です。この構成では、哺乳動物細胞のための自然ではないので、1生理学的に関連はありません。細胞は形状、サイズおよび異種の表現型の多様性を示します。このような平面や細胞小器官の極端な表現型（特にストレスファイバー）内の無秩序分布として、スクリーニング用途に適用されるとき、彼らは追加の重大な制限を提示します。これは、高予算が毎年費やされている薬物検査のための臨床試験において特に重要です。薬剤スクリーニングの初期段階であるため、人工2D培養条件の動物モデルに適用した場合、これらの薬物のほとんどはいえません。また、このアプローチを使用することによって、特定の細胞小器官は、適切に、そのような細胞質分裂のアクトミオシン細胞の有糸分裂の間にリング、および観察面に垂直な面内で進化している一般的な構造として、視覚化することができません。一部新しい2Dアッセイは、細胞骨格組織の上述の欠点及び重要な洞察が2,3観察されている解決するために提案されています。しかしながら、これらのアッセイは、まだ現在のもの重大な制限：細胞は、細胞が3次元構造を提示し、インビボで観察されるものとは対照的に、非常に広がり表現型を示します。培養法に関連したこれらのアーティファクトは、強化されたストレスファイバー1,4,5などの非生理的な機能をトリガすることができます。

2D環境6,7と比較した場合、三次元細胞培養アッセイは、多数の利点を提供します。彼らは、生理的に、より関連性の高い、との結果は、したがって、意味があります。一例として、ヒドロゲルに埋め込 ​​まれた細胞は、3Dのような構造を示すが、その形態は、他の8,9、1つのセルから異なります。しかし、その形態は、スクリーニングアプリケーションを複雑に別のセルとは異なります。別の戦略は、単一埋め込むことです微細加工キャビティ10,11内の細胞。セル位置、形状、極性および内部セル組織が正規化になることができます。細胞に3Dのようなアーキテクチャを提供するだけでなく、マイクロキャビティは、高コンテンツスクリーニング研究10,12-14を可能にします。単一細胞は、マイクロアレイおよび細胞小器官に注文することができ、それらの進化を並行して観察することができます。この規則は、細胞の数が少ない、より良い空間的/時間的解像度との良好な統計情報を提供します。有用な化合物を確実に識別しやすくなります。

本研究では、高コンテンツスクリーニングアプリケーション10,12,13のための新しい3Dのような単一細胞培養システムの製作と応用を示しています。デバイスは、エラストマーマイクロキャビティ（10 5の空洞/ cm 2）で、造語「eggcups」（EC）の配列で構成されます。この作品での寸法とECの総容積は、個々のNIH3T3およびHeLa細胞の典型的なボリュームに最適化されています細胞分裂時に。円筒 - - 空洞の形態は、アクティブなプロセスの可視化のための適切配向セルの形状に選択されています。 15,16カバースリップレプリカモールディングをガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層上にパターンにECのアレイを使用します。遠心分離により細胞をECに導入されます。ここでは、2D（平らな）表面上の同じ細胞と比較して、3D（EC）における細胞小器官（アクチンストレスファイバー、ゴルジ装置および核）の観察および正規化を報告しています。我々はまた、このような細胞有糸分裂17の間の細胞質分裂のアクトミオシンリングの閉鎖などの活性力学過程の観察を報告しています。最後に、我々はそのような出芽酵母、分裂酵母とCのような剛性の壁、と他のシステムでこの方法論の結果を示しますモデルシステムの広い範囲に私達の方法の適用性を確認するエレガンス胚 。

私たちは、詳細かつ網羅pは次の提示します3次元微細加工のための「eggcups」を製作し、適用するためにrotocol。我々のアプローチはシンプルで、クリーンルームを必要としません。私たちは、この新しい方法論がペトリ皿の代わりに、薬物スクリーニングアッセイおよびオーダーメイド医療のために特に興味深いものになることを期待しています。最後に、私たちのデバイスは、ガン18内または基礎研究19、例えば、外部刺激に対する細胞応答の分布を研究するために有用であろう。

プロトコル

「Eggcups」の1微細加工

  1. マスターの作製：マイクロキャビティアレイ
    1. 湿度の任意の存在を蒸発させ、200℃に3 ''シリコンウエハを加熱。
    2. スピンコートSU-8フォトレジストの薄層を。所望の厚さとフォトレジストの種類に応じて樹脂と紡糸速度の音量を調整します。この厚さは「eggcups」（EC）の深さを決定するであろう。厚さ30μmの層とSU-8 2025、2800 rpmでスピンコートしました。
    3. 厚さ30μmのSU-8 2025層のための1分（2のステップ1）65℃でのウエハプリベーク。希望するフォトレジストの種類や厚さに応じて時間を調整します。詳細については、メーカーのデータシートを確認してください。
    4. 厚さ30μmのSU-8 2025層のための3分（2のステップ2）95℃でのウエハプリベーク。希望するフォトレジストの種類や厚さに応じて時間を調整します。詳細については、メーカーのデータシートを確認してください。
    5. ロードUV露光用マスクアライナー上のウエハ。その上に、フォトリソグラフィマスクを配置します。マスクは、直径20μmの円形の特徴（ディスク）のパターンを示しています。互いの間の完全な接触を確保します。
      注：別のメーカーは、フォトリソグラフィマスクを提供しています。空間分解能は、最終的なコストを決定します。酢酸マスクは、低コストで許容可能な解像度（≈10μm）を提供しています。クロムマスクは、良好な分解能を提供するが、より高価です。細胞の容積に（フォトリソグラフィマスクからの）ディスクの直径を適応させます。マスク上のディスクの寸法は、デバイス内の空洞の直径を決定します。小さい直径は、低充填につながります。あまりにも大きな直径は、細胞を閉じ込めることはありません。 HeLa細胞およびNIH3T3細胞の場合、20〜25μmでミクロンの直径が提案されています。
    6. UVランプの前博覧会の力を確認し、それに従って露光時間を最適化します。 41.5秒（または最適化された露光時間）にするために（波長= 365 nm）を照射250mJ / cm 2です。
      注：SU-8 2025 UVに露光領域が硬化されることを意味ネガ型フォトレジストです。この場合には、円形の特徴は、黒、残りは透明でした。反対の方法で、ポジ型フォトレジストの作業：非露光領域が硬化されます。デザインやフォトマスクに応じて、それに応じてフォトレジストを選択します。
      注：適切な安全メガネを有するUV光から目を保護します。
    7. 静かにフォトレジスト層からマスクを削除します。
    8. ポストベーク厚さ30μmのSU-8 2025層のための1分（2のステップ1）65℃でのウェハ。ポストベーク厚さ30μmのSU-8 2025層のための3分（2のステップ2）95℃でのウェハ。希望するフォトレジストの種類や厚さに応じて時間を調整します。詳細については、メーカーのデータシートを確認してください。ポストベークした後、約1分間のベンチ上で室温にウェーハを冷却します。
    9. スピンコーターにウェハを置き、カバーするために、SU-8の開発者の数mmをドロップ全体のウエハ領域。スピンコートを1000rpmで30秒間、その後2分間の開発と。手順を3回繰り返します。
    10. 未開発のSU-8の完全な除去を確実にするために、2-プロパノールで洗浄します。ホワイト領域の外観は、不完全な開発の指標です。そうであれば、現像工程に追加の時間を繰り返します。
    11. ハードベーク200℃でのウェハ製造された微細構造の堅牢性を確保するために。このステップはオプションです。
    12. 94ミリメートル×15ミリメートルのポリスチレンペトリ皿の内側微細構造を有する3 ''ウエハを保管してください。
      注：表面処理のための、特にシラン化で、次のステップのための必要はありません。
  2. 柱アレイ：ポリジメチルシロキサン（PDMS）のレプリカの作製
    1. 完全に1:10（w / w）の50mlチューブ30内gで合計架橋剤とプレポリマーに混合します。
      注：1：10（v / v）の比率を使用しても働いています。
    2. に5分間1800×gでチューブを遠心気泡を除去。
    3. 微細構造の上に静かにPDMSをドロップします。
      注記：気泡がこのステップの間に表示された場合、15〜20分間真空ポンプを使用してサンプルを脱気。
    4. 4時間65℃のオーブンでサンプルを置きます。
      注：プレポリマーの割合：硬化時間は一緒に架橋剤とユーザとの間で変化します。この時間は、PDMSの剛性を決定するであろう。 2つ以上の時間を硬化させるために、固定硬化時間に固執することをお勧めします。
    5. 穏やかに約10 5マイクロキャビティまたは'eggcups'を含む約1cm 2の関心領域（スタンプ）をカットしてメスを使用してください。
      注：最初のPDMSをカットした後、静かにはがし。光学顕微鏡でPDMSレプリカの品質を確認してください。
  3. レプリカ成形による「eggcups」の製作。以下では、「eggcups」の製造のための2つの代替戦略が記載されています。どちらのプロトコルも、シミありLARと同一の結果を提供します。
    1. 戦略1
      1. 30秒間酸素プラズマ処理により作製したPDMSスタンプを有効にします。埃の付着を防止するために、閉じたペトリ皿に一時的に活性化されたスタンプを保管してください。
        注：プラズマのための他のガスが使用されている場合は露出時間を調整します。
      2. 活性化されたPDMSは、次の15 mlチューブのキャップにペトリ皿に逆さまアップ（構造を持つ側）スタンプ置きます。トリメチルクロロシラン200μlの（TMCS）とキャップを埋めます。ペトリ皿を閉じ、7分間スタンプsilanizeをしましょう​​。
        注：スタンプおよび/または色（白）の変化のいくつかの一時的な変形を観察することができます。スタンプは、短時間で元の形状に回復すると構造が影響を受けることはありません。
        注：TMCSは急性吸入と皮膚毒性を生成し、（かなりの距離を横切って発生することができ、点火フラッシュバックで）非常に可燃性です。これにより、離れたソースからヒュームカップボード中で使用されるべきです点火の秒。
      3. アップ逆さま構造をスピンコーター上にPDMSスタンプを配置します。構造物の上に：（プレポリマー1：10 w / wの架橋剤）液体PDMSの（20μlの周りの）数マイクロリットルの小滴を入れてください。 30秒間1500rpmでスピンコートは、構造体の上にPDMSの薄層を堆積させます。
        注：スタンプは、その中央に小さな穴を持つペトリ皿のふたの上にスピンコータチャック場所スタンプに合わない場合。
      4. 堆積スピンコートPDMS層を硬化するために4時間65℃のオーブン中でスタンプを置きます。
      5. 30秒間酸素プラズマクリーナーを使用して、一緒に直径25mmのガラスカバースリップ＃0で、逆さまアップPDMSスタンプを配置することによって、薄いPDMS層をアクティブ化します。次のステップに迅速に進んでください。
        注：他の厚さ、形状、及び寸法を有するカバーガラスを用いることもできます。しかし、いくつかの細胞構造は、選択されたカバースリップの厚さや目的に応じて視覚化することは困難かもしれません倍率および/またはNAおよび/または作動距離。客観的なデータシートを確認してください。
      6. ガラスカバースリップでスタンプ（薄いスピンコートされた層を有する側）に接触して配置します。 「ボンディング」を作るためにピンセットで静かにすべてのスタンプの表面の周りを押し。最後に、約10秒間、スタンプの上に一定の圧力を保ちます。
      7. 30分間穏やかに「ピール''解放'' eggcups」の順にカバースリップのうちスタンプした後（ 図1を参照）。エタノールとドライで十分に洗い流してください。 PDMS「eggcups 'が十分にカバーガラスに付着されていない場合（ すなわち、それらは「unpeeling'ステップの間にデタッチ）は、プラズマクリーナーの設定を調整することを検討し、ステップ1.3.1.5で再起動します。
        注：この手順はデリケートです。カバーガラスおよび/または薄いPDMS層の剥離の破損を避けるために注意を払います。
      8. 1ミリメートル×1の硬化PDMSの小片（ハンドル）グルー液体PDMSの小滴とカバーガラスの端の体積中のx 3ミリメートルミリメートル、前と同様にPDMSを治します。これは、（ 図1を参照）、その後、試料の操作を容易にします。このステップはオプションです。
    2. 戦略2
      1. 30秒間酸素プラズマ処理によって作製PDMSスタンプを親水。埃の付着を防止するために、閉じたペトリ皿に一時的に活性化されたスタンプを保管してください。
        注：プラズマのための他のガスが使用されている場合は露出時間を調整します。
      2. 30秒間15 Wで直径25mmのガラス製カバースリップ＃0、酸素プラズマ処理を親水。次のステップに迅速に進んでください。
        注：他の厚さ、形状、及び寸法を有するカバーガラスを用いることもできます。しかし、細胞構造が選択されたカバーガラスの厚さと客観的な特性に応じて視覚化することは困難になります（上記の注を参照）。
      3. スピンコート架橋剤w / wのPDMS（1：10の小滴：プレPOLカバーガラス上に数マイクロリットルのymer）。スピンコートを1,500 rpmで30秒間、約50ミクロンの最終的な厚さのために。
      4. 液体PDMSの小滴とカバーガラスの端の体積の1ミリメートル×1ミリメートル×3mmの硬化PDMSの小片（ハンドル）を接着し、前と同様にPDMSを治します。これは、（ 図1を参照）、その後、試料の操作を容易にします。このステップはオプションです。
      5. きれいな上に一時的にPDMSでコーティングされたカバースリップを保存埃の付着から保護するために、ペトリ皿の内側に拭いてください。
      6. 各スタンプの上にシラン化試薬の滴を入れて、それが1-2分間蒸発してみましょう。その後、N 2気流下でそれらを乾燥させます。
        注：このステップでは、スタンプの一時的な変形が蒸発中に観察することができます。スタンプは、微細構造の任意の永久変形することなく、N 2で乾燥させた後、元の形状を回復します。
      7. の上に非常に優しくシラン化スタンプをドロップペトリ皿に格納されたPDMS-スピンコーティングされたガラスカバースリップ。両側が接触時に完全に平行であることを確認してください。 PDMSコーティングされたカバーガラスの上に配置した後、スタンプを押したり、移動しないでください。
      8. 気泡を除去するために1〜2時間、真空中で試料を用いてペトリ皿を置きます。
        注：サンプルは、スタンプのずれを回避するために、完全に水平であることを確認してください。また、潜在的に真空ポンプによる振動を避けてください。
      9. 4時間65℃のオーブンでサンプルを置きます。
      10. 静かに、「eggcups」を明らかにするためにスタンプをはがし。エタノールとドライで十分に洗い流してください。
        注：この時点での練習が必要です。カバーガラスおよび/または薄いPDMS層の剥離の破損を回避することに注意を払ってください。

2.「Eggcups '内に細胞を導入

「eggcups '内部哺乳動物細胞を導入するために、PDMS表面NEEDSは、細胞外マトリックスの接着タンパク質で官能化することができます。この例では、フィブロネクチンが、コラーゲンのような関心のある他のタンパク質を使用して、使用することができます。

  1. 30秒間酸素プラズマクリーナーの「eggcups 'を親水。
    注：必要に応じてパラメータを最適化します。
  2. ウシ源から20μgのミリリットル-1フィブロネクチンのPBS 1X中の溶液を調製します。
  3. 5分間UVと「eggcups」を滅菌します。全体の「eggcups」の領域をカバーし、室温で1時間インキュベートしたフィブロネクチン溶液（20-50μlの周りの）小滴を堆積させます。乾燥からサンプルを保護します。
  4. 静かにPBS 1Xで「eggcups」をすすぎます。 3回繰り返します。
    注：サンプルは数週間のために直ちにまたは暗所で4℃で保存し使用できるようになりました。
  5. （参照50ミリリットルチューブに高さ63ミリメートル、外径の26ミリメートルと内部半径寸法の7ミリメートルの円筒形のカスタムメイドのプラスチック片を導入図2）20
    注意：使用UV殺菌アイテムまたはそれらを使用前に滅菌します。
    注：この作品は、簡単に実験室で製造することができます。または使用可能な任意の機械工場によります。
  6. チューブ内の細胞培養培地の13ミ ​​リリットルを入れて（ 表1参照）。媒体は、サンプルの完全な浸漬を保証するために、少なくとも2センチメートル円筒形のピースの上に記入する必要があります。
    注：酵母などの特定の細胞タイプの詳細、および他のモデル系またはC.エレガンス胚、および使用される対応する媒体は、セクション5および表1を参照してください。記載されているプロトコルは、HeLa、NIH3T3細胞、および他の細胞株（ 表1を参照）のために最適化しました。
  7. プラスチック片の上側に非常に穏やかにチューブと並列内側「eggcups」を紹介します。 PDMSハンドルを使用してサンプルを保持するために鋭いピンセットを使用してください。押して、静かにそれまでのカバーガラスはプラスチック片、国連の上側の上にありますそれが完全に浸されるTIL（ 図2参照 ）。
    注：これは、シャープでストレートピンセットを使用することをお勧めします。曲がったピンセットで、サンプルの操作は困難であり、破損の原因になります。
  8. 培養細胞P60シャーレで80から100パーセントコンフルエンスになるまで、トリプシン処理によってそれらを収集。
    注：細胞は、野生型、トランスフェクトまたは目的の任意の薬剤で治療することができます。
    注：「eggcups 'を入力するために、単一の細胞を避けることができます細胞凝集体の形成を避けてください。このステップ、ピペット上下徹底的にトリプシン処理した後を最適化するには。
  9. 再懸濁5mLの培養培地に細胞。 「eggcups」の上に細胞を200μlをピペット。
    注：可能な限り中心として「eggcups」の上にセルをドロップしますが、物理的な接触を避けること。これは、破損および/または試料の損傷を防ぐことができます。
  10. 2分間1800×gで遠心分離します。
    注：最初の遠心分離の後、マイクをチェック「eggcups」の充填率をroscope。
  11. 2分間、1800×gで「eggcups 'と遠心機の上に細胞のピペットを再度200μlの。充填率を最適化するために、全部で3回繰り返します。
    注：最後の遠心分離した後、顕微鏡で「eggcups」の充填率を確認してください。必要に応じて、所望の充填率に達するまで充填+遠心分離手順を繰り返します。
  12. PDMSハンドルを保持鋭いピンセットを使用してチューブからサンプルを削除します。 「eggcups」で開催されていない「不穏'細胞には注意していることを確認します（ 図2を参照）。
  13. 媒体とのペトリ皿にサンプルを置きます。微細構造アレイの各側に静かに次のピペッティングにより3回ダウン」eggcups '（合計4辺）に含まれていない細胞の過剰を除去するために洗浄します。
    注：ピペッティングがあまりにも強く解放してもよいです「eggcups」からいくつかの細胞外。
  14. 非取付け細胞を除去するために新鮮な培地で培地を交換してください。
    注：このステップでは、目的の薬剤を添加することができます。
  15. 細胞を修正またはタイムラプスimaging.Seeステップ4.1のためにそれらを準備します。

「Eggcups」で活躍細胞ダイナミクスの3観察：細胞質分裂の閉環

注：この例では、それぞれ、キー活性分子は、細胞の有糸分裂時に細胞質分裂の閉環に関与し、ミオシンとアクチンのためMYH10-GFPとLifeact-mCherryを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を使用しています。デバイスは、直径25μmのマイクロキャビティを用いて調製されます。彼らの観察のために、エピ蛍光倒立顕微鏡を使用し、60倍の油浸対物レンズ（1.40 NA、DIC、プランアポ）とGFP（ミオシン）とTxRed（アクチン）フィルタを装備します。あるいは直立共焦点顕微鏡は、25Xまたは63X HCX IR APO Lの水の対物レンズ（NA 0.95）を備え、使用されました。このエクサのためmple、非常に二重チミジンブロック、有糸分裂ブロックまたは有糸分裂シェイクオフ法21-24を使用して細胞を同期することをお勧めします。
注：「eggcups」のために使用されるPDMSの厚さは両方反転して直立に配置顕微鏡で目的の様々な使用を可能にします。

  1. 場所顕微鏡ホルダーに「eggcups 'および10％FCS、L-15観察培地1mlでそれを埋めます。蒸発を避けるために、ホルダの上にガラス蓋を置くかmedium.Select 60X油対物レンズの上にミネラルオイルの薄い層を適用します。
    注：L-15培地は、非CO 2気圧に適しています。 DMEMのいくつかの化合物が自動蛍光性であることにも注意してください。このメディアを使用する場合は、1〜2時間のための高輝度ランプとそれを照射することによって蛍光化合物を光退色することをお勧めします。
    注：DIC画像で作業するとき、プラスチックのふたを使用しないでください。
  2. 「eggcups 'とobserでホルダーを配置顕微鏡でvation媒体。 「eggcups '、及び細胞観察の同一平面上になるまで、明視野光を用いて慎重に焦点を当てます。
  3. ソフトウェアを開き、パラメータを調整します。アクチンとミオシンのためのフィルタTxRedとGFPを選択します。各チャネルの露出時間を調整します。典型的な取得率は、両チャンネルの5秒です。
    注：露出時間は、セットアップに使用、染料または関心のある他の細胞小器官に応じて調整する必要があります。
  4. 関心領域を選択し、GFPまたはTxRedチャネルのいずれかを使用して、細胞質分裂のリングを求めます。正確に焦点を当てています。
    注：リングはミオシンで鮮明で認識しやすくなります。
  5. リングが完全に閉じられるまで、両方のチャネルでの自動取得を実行します。
    注：一部の光退色が観察されてもよいです。それを低減するために、顕微鏡のパラメータを調整します。

「Eggcups」に修正された細胞小器官の4観測

このステップは、ステップ＃3の前または後に行うことができます。細胞は、直接、遠心分離工程の後に固定され、関心のオルガネラ、または顕微鏡で観察した後に染色することができます。この例では、「eggcups」でNIH3T3線維芽細胞上のゴルジ装置、核とアクチン繊維の染色を示します。

  1. 「Eggcups」中の細胞の固定化
    1. 37℃で3％パラホルムアルデヒド（PFA）と暖かいを準備します。 50mlのチューブ（または顕微鏡ホルダー）から「eggcups」のサンプルを削除し、P35ペトリ皿の内側に配置します。 PBS 1×で一回すすいでください。
      注：3％パラホルムアルデヒドを製造するためのプロトコルは、他の場所で広く利用可能です。
      注意：PFAの準備中にニトリル手袋と目の保護具を使用してください。
    2. 完全にPBSを削除し、3％PFAの1ミリリットルをドロップし、17分間インキュベートします。 PFAを削除し、PBS 1Xの1ミリリットルで二回すすいでください。 0.5％トリットの1ミリリットルを使用して透過処理細胞3分間で5分間、PBS 1Xで二回洗浄します。
  2. 「Eggcups」での細胞の染色
    1. PBSで1：500希釈で一次抗体ウサギポリクローナル抗Giantinとゴルジ体染色用の細胞をインキュベートします。プラスチックフィルムシート上に抗体溶液の100μlのドロップを置き、45分間逆さまに「eggcups」内部の細胞を培養します。
      注：乾燥を防ぐためにカバーでサンプルを保護します。
    2. 慎重に「Eggcups」をリリースし、P35ペトリ皿に入れます。 PBS 1×で、3回、各5分洗浄します。
    3. （1：200）ファロイジンアレクサフルオロ488とアクチンストレスファイバーを染色するための：二次抗体のCy3ヤギ抗ウサギ（千1）を含むPBSでカクテルを準備します。
    4. プラスチックフィルムシート上に抗体溶液の100μlのドロップで細胞をインキュベートし、45分間逆さまに「eggcups」の内側の細胞を培養します。
    5. リリース慎重に」eggcアップ 'とP35ペトリ皿に入れます。 PBS 1×で、3回、各5分洗浄します。
    6. プラスチックフィルムシート上に1μgのml -1のPBS中DAPI100μlの低下を置く核染色のための細胞をインキュベートし、逆さまに45分間「eggcups」の内側の細胞を培養します。このステップは、ステップ4.2.3で行うことができます。
    7. 慎重に「eggcups」をリリースし、P35ペトリ皿に入れます。 PBS 1×で、3回、各5分洗浄します。
    8. 標準的な顕微鏡用スライドガラス上に：（1 V / V 1）と乾燥を避けるためにマニキュアでサンプルを密封PBS：マウント細胞は、15μlのグリセロールを使用しました。
      注：「eggcups 'の厚さに応じて、実装が困難であり得ます。乾燥から保護PBS中P35ペトリ皿の中に、サンプルを保存することをお勧めします。
  3. 顕微鏡観察
    注：この例では直立共焦点顕微鏡を使用している、PMTおよびハイブリッドの検出器を装備。 25Xまたは63 X HCX IR APO Lの水目標（0.95 NA）は、サンプルの広いフィールドを提供し、高コンテンツスクリーニングアプリケーションのための装置の適用性を示すために選ばれました。
    1. 25Xや63X水の目的を選択します。
      注：アプリケーション、信号に応じて、異なる目的に使用することができます。しかし、高開口数の対物レンズの使用が推奨されます。
    2. 「eggcups 'で固定した試料を置き、注意深く観察の平面内にある「eggcups'と細胞まで、明視野光（位相コントラストやDIC）を使用して焦点を合わせます。
    3. ソフトウェアを開き、パラメータを調整します。それぞれ、アクチン、ゴルジおよび核観察用フィルタGFP、Cy3およびDAPIを選択します。すべてのチャンネルの露出時間を調整します。
      注：暴露時間の設定に応じて調整されなければなりません。
    4. 関心領域を選択し、焦点を合わせます。画像キャプチャを開始する（ 図3参照 ）。
TLE "> 5。酵母細胞の観察のための適応とC.は、胚エレガンス

  1. 核分裂と出芽酵母細胞
    注：この例では、それぞれ、ミオシンとアクチンのためのRLC1-mCherryをとCHD-GFPでタグ付けされた分裂酵母細胞を使用しています。出芽酵母細胞を蛍光ここで標識されていません。分裂酵母観察用反転スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用しました。 100X HCX PL APO CS油対物レンズ（1.4 NA）は、すべての取得のために使用しました。あるいは、細胞は、20X位相差空気目的LCPlanFl（0.4 NA）を備えた倒立位相差顕微鏡を用いて観察しました。この例では、プロトコルは、両方の細胞タイプについて同じです。
    1. 上記のように「eggcups」表面を準備します。分裂および出芽酵母細胞を、直径5ミクロンのキャビティを調製した（ 表1参照）。この場合、表面は、接着タンパク質で官能化される必要はありません。
      注：充填CAnは円錐形の「eggcups 'を使用することによって最適化すること。この形状は、キャプチャし、遠心分離後のリンス工程中に放出さ回避の細胞を保持します。充填率は約80％で最適です。これらの円錐'eggcups'は、ディープ反応性イオンエッチング13を用いて製造することができます。
    2. 適切な培地中で培養酵母細胞は、0.2〜0.8の範囲の光学密度（OD）に達するまで（ 表1参照します）。凝集物を除去するために、酵母細胞の培養物を超音波処理します。
    3. 遠心分離により「eggcups」で酵母細胞を挿入します。遠心分離のために、適切なODで培養した細胞の4ミリリットルを「eggcups 'でチューブに追加されます。 「eggcups」のセルが乱されていないながら、最初の遠心分離した後、静かに、「eggcups」に含まれていない細胞を再懸濁するためにチューブを振ります。再びチューブ、遠心分離機を開くことなく二回、この手順を繰り返します。これは、堆積を保証します空のマイクロキャビティへの培養物からの細胞の充填率が増加します。
      注：酵母で作業する場合、それは実験中の作業温度に予熱遠心分離することをお勧めします
      注：このプロトコルは、ここで一時停止し、後12時間まで継続することができます。この場合には、使用温度で試料を保存し、蒸発を防ぐためにそれをカバー。
    4. 顕微鏡ホルダーに「eggcups」を置き、撮影用のフィルター滅菌媒体とホルダーを埋めます。浮遊酵母細胞を効率的に除去されるまで、今同じメディアで細胞を洗浄。すすぎ工程中に「eggcups」で細胞を乱さないように注意してください。
    5. 100Xの油浸対物レンズを選択して、慎重に焦点を当てています。ソフトウェアを開き、パラメータを調整します。分裂酵母の場合は、アクチンとミオシンのためのフィルタのGFPとTxRedを選択して、両チャンネルの露出時間を調整します。典型的な取得率は3秒です。
      注：上の依存フルオロフォア、タグの種類や設定、露出時間は、他のシステムのために変化します。
  2. C.エレガンス胚
    注：この例では、Cを使用しています25-30μmの幅と長い50〜55μmのエレガンス胚。 25に示すように胚を培養しました。 C.を操作する方法の簡単な視覚的なプロトコルエレガンスは 26で見つけることができます。観察は40倍の空気対物0.55 NAを備えた倒立位相差顕微鏡を用いて行きました。
    1. 上述した、直径25ミクロンとして「eggcups」表面を調製する（ 表1参照）。この場合、表面は、接着タンパク質で官能化される必要はありません。
    2. 文化C. （ 表1参照）、適切な培養培地中で胚をエレガンス 。
    3. 上記のように培養液として超純水を使用して（2.12へのセクション2.6を参照）遠心分離によって「eggcups」で胚を挿入します。
      注：胚は実験期間中、通常、超純水に「振る舞う」しました。あるいは、長期的な実験のための生理的M9バッファを使用しています。
    4. （セクション2.14を参照）は、上述したようにサンプルをすすぎます。顕微鏡ホルダーに「eggcups」を置きます。 40Xエア目的を選択して、慎重に焦点を当てています。ソフトウェアを開き、パラメータを調整します。 3秒の取得速度を選択します。

結果

「eggcups '（EC）は、3D環境に配向した細胞と胚の可視化を可能にする新たな高コンテンツのスクリーニング方法論です。さらに、標準的な2D（フラット）培養物中で観察することが困難であるいくつかの細胞プロセスは、この新たな方法により観察することができる。 図1aは、ECの微細加工のための手順の概要を示している（上記のプロトコルでも、第1参照）。この方法は、簡...

ディスカッション

レプリカ成形は「eggcups」を作製するために使用しました。製造プロセスは、クリーンルームを必要としません。いくつかの練習が必要になることがありますが、それは、簡単でシンプルです。具体的には、PDMSスタンプを解放すると、高品質」eggcups 'の大きな領域を生成するための最も重要なステップです。このため、特別な注意は、このステップで注意しなければなりません。このステ?...

開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

我々は、抗Giantin抗体、M. Labouesseラボで私たちを提供するためのL. Brino（IGBMCハイコンテントスクリーニング施設、イルキルシュ、フランス）を認めます。 C.のためのエレガンス （IGBMC）とBセラフィンラボ。酵母（IGBMC）、分裂酵母細胞用の蛍光HeLa細胞（MPI-CBG、ドレスデン）、J.モーズリー（ダートマス医科大学）とJQウー（オハイオ州立大学）のためのE. PaluchとA.ハイマンを出芽するため、 A.フールと実験の助けのためのF. Evenou、技術的なヘルプのためのC.リック（IBMC、ストラスブール、フランス）、および微細加工のヘルプのためのJC Jeannot（フェムト-ST、フランス）。この作品は、CNRS、ストラスブール大学、CONECTUS、ラ財団ラRECHERCHEMédicaleとCI-FRCストラスブールのを注ぐからの資金によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ddH20 (ultrapure)Millipore-Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)BemisPM-999Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-maskSelba-http://www.selba.ch
Silicon waferSiltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresistMicroChem2000 serieshttp://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developerMicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanolSigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )Sigma-AldrichSL2-25MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS)Sigma-Aldrich386529-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile glovesKleenguard57372http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0Knittel glassKN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezersSPI0WSSS-XDhttp://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tubeBD Falcon352070http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMSDow CorningSylgard 184 kithttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slidesDutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose mediumFisher Scientific41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serumSigma-AldrichC8056-500MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1xFisher Scientific14200-067http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 mediumFisher Scientific21083-027http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin Sigma-AldrichF1141-5MGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & StreptomycinFisher Scientific15140-122http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35Greiner627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60Greiner628163http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94Greiner633179http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %Sigma-AldrichP6148-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %Sigma-Aldrich93443-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488InVitrogenA12379http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647InVitrogenA212451:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-GiantinAbcamab245861:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillinCourtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosineTransduction Lab610000http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit Jackson Immunoresearch111-166-047http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPISigma-AldrichD8417 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
GlycerolSigma-AldrichG2025http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oilSigma-AldrichM8410-500MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells--Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cellsATCC-Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast --For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms--For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements includedMP Biomedicals4101-732http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements includedMP Biomedicals4101-522http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)MP Biomedicals4110-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imagingMP Biomedicals4110-012For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)MP Biomedicals4104-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filtersMillipore-http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

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