Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Résumé

Nous rapportons un dispositif et une nouvelle méthode pour étudier les cellules et les embryons. Les cellules individuelles sont précisément commandées dans des tableaux de microcavité. Leur confinement 3D est une étape vers des environnements 3D rencontrés dans des conditions physiologiques et permet l'orientation des organites. En contrôlant la forme des cellules, cette configuration réduit la variabilité signalée dans des essais standard.

Résumé

cellules biologiques sont habituellement observées sur (2D) des surfaces planes. Cette condition est non physiologique et les phénotypes et les formes sont très variables. Le dépistage à base de cellules dans de tels environnements ont des limitations donc graves: organites cellulaires présentent des phénotypes extrêmes, morphologies cellulaires et tailles sont des organites cellulaires hétérogènes et / ou spécifiques ne peuvent pas être correctement visualisés. En outre, des cellules in vivo sont situées dans un environnement 3D; Dans cette situation, les cellules présentent des phénotypes différents principalement en raison de leur interaction avec la matrice extracellulaire autour du tissu. Afin de normaliser et de générer l' ordre de cellules individuelles dans un environnement 3D physiologiquement pertinents pour des essais à base de cellules, nous rapportons ici la microfabrication et les applications d'un dispositif de culture in vitro de cellules 3D. Ce dispositif se compose d'un tableau 2D de microcavités (typiquement ⁵ à 10 alvéoles / cm ^2), chacun rempli avec les cellules ou les embryons isolés. cellule position, la forme, la polarité et l'organisation interne de la cellule deviennent alors normalisée montrant une architecture 3D. Nous avons utilisé réplique moulage pour motif un tableau de microcavités, «coquetiers», sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur une lamelle. Caries étaient recouverts de fibronectine pour faciliter l'adhérence. Les cellules ont été insérées par centrifugation. le pourcentage de remplissage a été optimisé pour chaque système permettant jusqu'à 80%. Les cellules et les embryons viabilité a été confirmée. Nous avons appliqué cette méthode pour la visualisation des organites cellulaires, comme noyau et appareil de Golgi, et d'étudier les processus actifs, tels que la fermeture de l'anneau cytokinétique lors de la mitose cellulaire. Ce dispositif a permis l'identification de nouvelles fonctionnalités, telles que des accumulations et des inhomogénéités de la myosine et l'actine périodiques lors de la fermeture du cycle cytokinétique et phénotypes compactés pour Golgi et l'alignement noyau. Nous avons caractérisé la méthode pour les cellules de mammifères, levure de fission, la levure bourgeonnante, C. elegans wième adaptation spécifique dans chaque cas. Enfin, les caractéristiques de ce dispositif, il est particulièrement intéressant pour les tests de dépistage des drogues et de la médecine personnalisée.

Introduction

Courant dans des essais à base de cellules in vitro sont deux dimensions (2D). Cette configuration est pas naturelle pour les cellules de mammifère et donc pas physiologiquement pertinente ^1; cellules présentent une grande diversité de formes, de tailles et de phénotypes hétérogènes. Ils présentent de sérieuses limitations supplémentaires lorsqu'il est appliqué à des applications de dépistage, comme une distribution désordonnée dans le plan et les phénotypes extrêmes de organites cellulaires (fibres de stress, en particulier). Ceci est particulièrement important dans les essais cliniques pour le dépistage des drogues, où les hautes budgets sont dépensés chaque année. La plupart de ces médicaments ne parviennent que lorsqu'ils sont appliqués à des modèles animaux en raison de la condition de culture 2D artificiel dans les stades précoces du criblage des médicaments. En outre, en utilisant cette approche, des organites cellulaires spécifiques ne peut pas être visualisée correctement, comme la bague de actomyosine cytokinétique pendant la mitose cellulaire et, en général des structures qui évoluent dans le plan perpendiculaire au plan d'observation. Certainsnouveaux tests 2D ont été proposées afin de remédier aux inconvénients mentionnés ci-dessus et des informations importantes sur l' organisation du cytosquelette ont été observées ^2,3. Cependant, ces tests présentent encore une limitation sérieuse: les cellules présentent un phénotype très propagation contrairement à ce qui est observé in vivo, où les cellules présentent une architecture 3D. Ces artefacts associés à la méthode de culture peut déclencher des caractéristiques non physiologiques , telles que le renforcement de fibres de stress ^1,4,5.

Tridimensionnelles des analyses de culture cellulaire fournissent de nombreux avantages par rapport aux environnements 2D ^6,7. Ils sont physiologiquement plus pertinent, et les résultats sont donc significatifs. A titre d'exemple, les cellules incorporées dans les hydrogels présentent des structures 3D-like mais leurs morphologies diffèrent d'une cellule à l' autre ^8,9. Cependant, leurs morphologies diffèrent d'une cellule à une autre, ce qui complique les applications de criblage. Une autre stratégie consiste à intégrer uniqueles cellules dans des cavités microfabriqués ^10,11. position de cellules, la forme, la polarité et l'organisation interne de la cellule peuvent alors devenir normalisée. En plus de fournir une architecture 3D ressemblant à des cellules, microcavités permet également de haute contenu des études de dépistage ^10,12-14; des cellules individuelles peuvent être commandées en microréseaux et des organites cellulaires et leurs évolutions peuvent être observées en parallèle. Cette régularité fournit de bonnes statistiques à faible nombre de cellules et de meilleures résolutions temporelles / spatiales. Des composés utiles sont plus faciles à identifier de manière fiable.

Dans cette étude, nous montrons la fabrication et l' application d'un nouveau système de culture de cellules unique 3D-like pour les applications à haut contenu de dépistage ^10,12,13. Le dispositif est constitué d'un réseau de microcuves élastomères (10 ⁵ cavités / cm ^2), inventé '' coquetiers (CE). Dimensions et volume total des CE dans ce travail sont optimisés pour le volume typique des cellules NIH3T3 et HeLa individuelsau cours de la division cellulaire. Morphologie des cavités cylindriques - - est sélectionné pour la forme des cellules correctement orient pour la visualisation des processus actifs. Replica moulage est utilisé pour modèle un tableau de la CE sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur un verre lamelle ^15,16. Les cellules sont introduites dans les CE par centrifugation. Nous rapportons ici l'observation et la normalisation des organites cellulaires (fibres de stress d'actine, appareil de Golgi et noyau) en 3D (CE) en comparaison avec les mêmes cellules sur 2D (plat) surfaces. Nous présentons également l'observation des processus dynamiques actifs tels que la fermeture de l'anneau de actomyosine cytokinétique lors de la mitose des cellules ^17. Enfin, nous montrons les résultats de cette méthodologie sur d' autres systèmes avec des parois rigides, tels que la levure bourgeonnante, levure de fission et C. embryons elegans qui confirme l'applicabilité de notre méthodologie à une large gamme de systèmes modèles.

Nous présentons ensuite une p détaillée et exhaustiverotocol afin de fabriquer et d'appliquer les «coquetiers» pour microfabrication 3D. Notre approche est simple et n'a pas besoin d'une chambre propre. Nous prévoyons que cette nouvelle méthodologie sera particulièrement intéressante pour les essais de criblage de médicaments et de la médecine personnalisée, en remplacement de boîtes de Pétri. Enfin, notre dispositif sera utile pour étudier les distributions des réponses des cellules à des stimuli externes, par exemple dans le cancer ¹⁸ ou dans la recherche fondamentale ^19.

Protocole

1. microfabrication de «Coquetiers»

1. Fabrication du Maître: Microcavités tableau
   1. Chauffer une plaquette 3 'de silicium "jusqu'à 200 ° C pour faire évaporer toute présence d'humidité.
   2. Spin-coat une mince couche de résine photosensible SU-8. Ajuster le volume de la résine et la vitesse de filage en fonction de l'épaisseur et de résine photosensible de type désiré. Cette épaisseur dictera la profondeur des «coquetiers» (CE). Pour une couche épaisse de 30 um et SU-8 2025, spin-coat à 2.800 tours par minute.
   3. Pré-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min (étape 1 de 2) pour une couche épaisse de 30 um SU-8 2025. Adapter le temps en fonction du type de résine photosensible et à l'épaisseur souhaitée. Consultez la fiche technique du fabricant pour plus de détails.
   4. Pré-cuire la plaquette à 95 ° C pendant 3 min (étape 2 de 2) pour une couche épaisse de 30 um SU-8 2025. Adapter le temps en fonction du type de résine photosensible et à l'épaisseur souhaitée. Consultez la fiche technique du fabricant pour plus de détails.
   5. Chargez leplaquette sur le dispositif d'alignement de masque pour une exposition aux UV. Placer le masque de photolithographie sur elle. Le masque représente un motif de caractéristiques circulaires (disques) de 20 um de diamètre. Assurer un contact parfait entre les uns des autres.
      REMARQUE: Différents fabricants offrent des masques de photolithographie. La résolution spatiale déterminera le coût final. masques Acétate offrent une résolution acceptable (≈10 um) à faible coût. masques de chrome offrent une meilleure résolution, mais sont plus chers. Adapter le diamètre des disques (à partir du masque de photolithographie) et le volume des cellules. Dimensions des disques sur le masque déterminent le diamètre des cavités dans le dispositif. Les petits diamètres conduiront à un remplissage faible; trop grand diamètre ne limitera pas les cellules. Pour les cellules HeLa et NIH 3T3, des diamètres de 20 um à 25 um sont suggérées.
   6. Vérifiez la puissance de la lampe UV exposition avant et d'optimiser le temps d'exposition en conséquence. Irradier (longueur d'onde = 365 nm) pendant 41,5 secondes (ou le temps d'exposition optimisée) à250 mJ / ^cm2.
      NOTE: SU-8 2025 est une résine photosensible négative, ce qui signifie que les régions exposées aux UV seront guéris. Dans ce cas, les caractéristiques circulaires étaient noirs et la transparence reste. Travaux de résine photosensible positive dans le sens inverse: les régions non exposées sont durcies. Sélectionnez la résine photosensible en conséquence, en fonction de la conception et la photo-masque.
      REMARQUE: Protéger les yeux des rayons UV avec des lunettes de sécurité appropriées.
   7. Retirez délicatement le masque de la couche de résine photosensible.
   8. Post-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min (étape 1 de 2) pour une couche épaisse de 30 um SU-8 2025. Post-cuire la plaquette à 95 ° C pendant 3 min (étape 2 de 2) pour une couche épaisse de 30 um SU-8 2025. Adapter le temps en fonction du type de résine photosensible et à l'épaisseur souhaitée. Consultez la fiche technique du fabricant pour plus de détails. Après post-cuisson, refroidir la plaquette à la température ambiante sur le banc pendant environ 1 min.
   9. Placez la plaquette dans le spin-coater et déposez quelques mm de SU-8 développeur pour couvrirtoute la surface de la plaquette. Développer pendant 2 min, puis tourner-coat à 1000 rpm pendant 30 secondes. Répétez la procédure trois fois.
   10. Rincer avec 2-propanol pour assurer l'élimination complète des sous-développés SU-8. Apparition de régions blanches est une indication de développement incomplet. Si oui, répéter l'étape de développement d'un délai supplémentaire.
   11. Hard-cuire la plaquette à 200 ° C pour assurer la robustesse des microstructures fabriquées. Cette étape est facultative.
   12. Rangez la 3 '' wafer avec microstructures l'intérieur d'un 94 mm x 15 mm polystyrène boîte de Pétri.
       NOTE: Il n'y a pas besoin d'un traitement de surface, en particulier silanisation, pour les prochaines étapes.
2. Fabrication de la Polydiméthylsiloxane (PDMS) Replica: Pillars tableau
   1. Bien mélanger dans un rapport 1:10 (p / p) de l'agent de réticulation et le pré-polymère pour un total de 30 g dans un tube de 50 ml.
      NOTE: L'utilisation d'un rapport de 1:10 (v / v) travaille également.
   2. Centrifuger le tube à 1800 g pendant 5 min àéliminer les bulles d'air.
   3. Déposez délicatement les PDMS sur le dessus des microstructures.
      NOTE: Si des bulles d'air apparaissent au cours de cette étape, dégazer l'échantillon en utilisant une pompe à vide pendant 15-20 min.
   4. Placer l'échantillon dans un four à 65 ° C pendant 4 heures.
      NOTE: Le temps de durcissement varie entre les utilisateurs et, en même temps que l'agent de réticulation: proportion pré-polymère. Cette fois-ci déterminera la rigidité des PDMS. Il est recommandé de traiter plus de 2 heures et de coller à un temps de séchage fixe.
   5. Utilisez un scalpel pour couper délicatement la zone d'intérêt (timbre) d'environ 1 cm ² , qui comprend environ 10 ⁵ microcavités ou «coquetiers».
      NOTE: Coupez d'abord les PDMS puis, peler off doucement. Vérifier la qualité de la réplique PDMS avec un microscope optique.
3. Fabrication de «coquetiers» par réplique moulage. Dans ce qui suit, deux stratégies alternatives pour la fabrication de "coquetier" sont décrits. Les deux protocoles sont similar et fournir des résultats identiques:
   1. Stratégie 1
      1. Activer le tampon PDMS fabriqué par un traitement par plasma d'oxygène pendant 30 secondes. Stocker temporairement les timbres activés dans une boîte de Pétri fermée pour empêcher le dépôt de poussière.
         REMARQUE: Réglez le temps d'exposition, si d'autres gaz pour le plasma sont utilisés.
      2. Placez les PDMS activés timbre à l'envers vers le haut (le côté avec les structures) dans une boîte de Pétri à côté d'un bouchon de tube de 15 ml. Remplissez le bouchon avec 200 pi de triméthylchlorosilane (TMCS). Fermez la boîte de Pétri et laisser le silaniser de timbre pendant 7 min.
         NOTE: Certaines déformation temporaire sur le timbre et / ou changement de couleur (blanc) peut être observée. Le timbre va récupérer sa forme originale en peu de temps et les structures ne seront pas affectés.
         NOTE: TMCS produit par inhalation et par voie cutanée toxicité aiguë, et est hautement inflammable (avec allumage flashback en mesure de se produire sur des distances considérables). Par conséquent, il doit être utilisé dans une hotte de laboratoire à une distance de la sources d'allumage.
      3. Placez le tampon PDMS sur le spin-coater avec les structures à l'envers vers le haut. Mettre une petite goutte de quelques microlitres (environ 20 ul) de PDMS liquide (01:10 p / p de l'agent de réticulation: le pré-polymère) au-dessus des structures. Spin-coat à 1500 rpm pendant 30 secondes pour déposer une fine couche de PDMS au-dessus des structures.
         NOTE: Si le timbre ne correspond pas au spin-coater chuck lieu le timbre sur le dessus d'un plat couvercle Petri avec un petit trou en son centre.
      4. Placez le tampon dans le four à 65 ° C pendant 4 heures pour durcir la couche de PDMS de spin-enduit déposé.
      5. Activer la couche de PDMS mince en plaçant le timbre de PDMS à l'envers, en collaboration avec une lamelle de verre # 0 de 25 mm de diamètre, en utilisant l'oxygène nettoyeur à plasma pendant 30 secondes. Procéder rapidement à l'étape suivante.
         REMARQUE: des lamelles avec d'autres épaisseurs, formes et dimensions peut être utilisé aussi bien. Cependant, certaines structures cellulaires pourraient être difficiles à visualiser en fonction de l'épaisseur de la lamelle couvre-objet sélectionné et l'objectifagrandissement et / ou NA et / ou la distance de travail. Vérifiez la feuille de données objectives.
      6. Placer en contact le timbre (le côté avec la couche de spin-enduit mince) avec la lamelle de verre. Appuyez doucement tout autour de la surface du tampon avec des pincettes pour faire le «collage». Enfin, maintenir une pression constante sur le dessus du tampon pour environ 10 sec.
      7. Au bout de 30 min doucement «peau» du timbre sur la lamelle afin de «libérer» «coquetiers» (voir Figure 1). Rincez abondamment avec de l'éthanol et sec. Si PDMS 'coquetiers »ne sont pas bien respectées sur la lamelle de verre (ils se détachent lors de l'étape' unpeeling '), envisager d' ajuster les paramètres du filtre à plasma et redémarrer à l' étape 1.3.1.5.
         REMARQUE: Cette étape est délicate. Faites attention afin d'éviter la rupture de la lamelle et / ou le détachement de la couche de PDMS mince.
      8. Collez un petit morceau (poignée) de PDMS durcis de 1 mm x 1mm x 3 mm de volume au bord de la lamelle couvre-objet avec une petite goutte de liquide et de durcir le PDMS PDMS comme précédemment. Cela permettra de faciliter la manipulation de l'échantillon par la suite (voir la figure 1). Cette étape est facultative.
   2. Stratégie 2
      1. Hydrophiliser les timbres PDMS fabriqués par un traitement par plasma d'oxygène pendant 30 secondes. Stocker temporairement les timbres activés dans une boîte fermée Petri pour empêcher le dépôt de poussière.
         REMARQUE: Réglez le temps d'exposition, si d'autres gaz pour le plasma sont utilisés.
      2. Hydrophiliser les lamelles de verre de diamètre # 0 traitement par plasma d'oxygène de 25 mm à 15 W pendant 30 secondes. Procéder rapidement à l'étape suivante.
         REMARQUE: des lamelles avec d'autres épaisseurs, formes et dimensions peut être utilisé aussi bien. Cependant, les structures cellulaires seront difficiles à visualiser en fonction de l'épaisseur de la lamelle sélectionnée et caractéristiques objectives (voir note ci-dessus).
      3. Spin-coat une petite goutte de PDMS (1:10 w / w cross-linker: pré-polYmer) de quelques microlitres sur les lamelles de verre. Par centrifugation à 1500 tours par minute manteau pendant 30 secondes pour une épaisseur finale d'environ 50 pm.
      4. Coller un petit morceau (poignée) de PDMS durcis de 1 mm x 1 mm x 3 mm en volume au bord de la lamelle couvre-objet avec une petite goutte de liquide et de durcir le PDMS PDMS comme précédemment. Cela permettra de faciliter la manipulation de l'échantillon par la suite (voir la figure 1). Cette étape est facultative.
      5. Stocker temporairement les PDMS revêtus des lamelles sur un chiffon propre essuyez l'intérieur d'une boîte de Pétri pour protéger contre les dépôts de poussière.
      6. Mettre une goutte de réactif de silanisation sur le dessus de chaque timbre et laisser évaporer pendant 1-2 min. Ensuite, les sécher sous un courant de _N2.
         NOTE: Dans cette étape, une déformation temporaire du tampon peut être observée lors de l'évaporation. Le timbre va récupérer sa forme initiale après séchage avec N ₂ , sans déformation permanente de microstructures.
      7. Déposez très doucement le timbre silanisé sur le dessus duPDMS-spin enduit lamelle de verre stocké dans la boîte de Pétri. Assurez-vous que les deux côtés sont complètement parallèles lors du contact. Évitez d'appuyer ou de déplacer le tampon après l'avoir placé sur la lamelle de PDMS-enduits.
      8. Placez la boîte de Pétri avec des échantillons dans le vide pendant 1-2 heures pour éliminer les bulles d'air.
         REMARQUE: Veiller à ce que les échantillons sont totalement horizontale pour éviter tampon déplacement. Evitez également les vibrations potentiellement causés par la pompe à vide.
      9. Placer les échantillons dans le four à 65 ° C pendant 4 heures.
      10. Doucement, décoller le timbre pour révéler «coquetiers». Rincez abondamment avec de l'éthanol et sec.
          NOTE: La pratique à ce point est nécessaire. Faites attention à éviter la rupture de la lamelle et / ou le détachement de la couche de PDMS mince.

2. Présentation de cellules dans les 'Eggcups'

Afin d'introduire des cellules de mammifères à l'intérieur 'coquetiers', PDMS surface needs à fonctionnaliser avec des protéines d'adhérence de la matrice extracellulaire. Cet exemple utilise la fibronectine, mais d'autres protéines d'intérêt, comme le collagène, peuvent être utilisés.

1. Hydrophiliser les "coquetier" dans le nettoyeur à plasma d'oxygène pendant 30 secondes.
   REMARQUE: Optimiser les paramètres si nécessaire.
2. Préparer une solution dans du PBS 1x de 20 pg ml ^-1 fibronectine provenant de sources bovines.
3. Stériliser les «coquetiers» avec UV pendant 5 min. Déposez une petite goutte (environ 20-50 pi) de solution de fibronectine pour couvrir toute la zone 'de coquetiers' et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Protéger l'échantillon de séchage.
4. Rincer délicatement les «coquetiers» avec PBS 1x. Répétez 3 fois.
   NOTE: L'échantillon est prêt à être utilisé immédiatement ou conservé à 4 ° C dans l'obscurité pendant plusieurs semaines.
5. Introduire une pièce cylindrique sur mesure en plastique de 63 mm de hauteur, 26 mm de rayon externe et 7 mm de dimensions de rayon interne dans un tube de 50 ml (voirLa figure 2) ²⁰
   ATTENTION: L'utilisation des articles UV-stérilisée ou de les stériliser avant utilisation.
   NOTE: Cette pièce peut être facilement fabriqué en laboratoire. ou par tout atelier d'usinage disponible.
6. Mettre 13 ml de milieu de culture cellulaire à l' intérieur du tube (voir le tableau 1). Le milieu doit remplir au moins 2 cm au-dessus de la pièce cylindrique pour assurer une immersion complète de l'échantillon.
   NOTE: Pour les détails des types de cellules spécifiques, et d' autres systèmes modèles tels que la levure ou C. elegans embryons, et le milieu correspondant utilisé, se référer au chapitre 5 et le tableau 1. Le protocole décrit a été optimisé pour HeLa, les cellules NIH3T3, et d' autres lignées cellulaires (voir le tableau 1).
7. Présentez très doucement les «coquetiers» à l'intérieur du tube et parallèle à la face supérieure de la pièce en plastique. Utilisez des pinces acérées pour maintenir l'échantillon en utilisant la poignée PDMS. Appuyez doucement la lamelle jusqu'à ce qu'il se trouve au-dessus de la face supérieure de la pièce en plastique, nonjusqu'à ce qu'il soit complètement immergé (voir la figure 2).
   NOTE: Il est recommandé d'utiliser des pinces pointues et droites. Avec une pince courbe, la manipulation de l'échantillon est difficile et peut entraîner la rupture.
8. les cellules de culture jusqu'à 80-100% de confluence dans une boîte de Pétri de P60 et de recueillir les par trypsinisation.
   NOTE: Les cellules peuvent être de type sauvage, transfectées ou traités avec un médicament d'intérêt.
   REMARQUE: Eviter la formation d'agrégats de cellules qui éviteront des cellules individuelles pour entrer dans les «coquetiers». Pour optimiser cette étape, la pipette de haut en bas à fond après trypsinisation.
9. Remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu de culture. Pipeter 200 pi de cellules au-dessus des «coquetiers».
   REMARQUE: Laissez tomber les cellules comme centré que possible au-dessus des «coquetiers», mais en évitant tout contact physique. Cela permettra d'éviter la rupture et / ou des dommages de l'échantillon.
10. Centrifuger à 1800 xg pendant 2 min.
    NOTE: Après la première centrifugation, vérifiez dans un microroscope le pourcentage de remplissage des "coquetier".
11. Pipette à nouveau 200 pi de cellules au-dessus des «coquetiers» et centrifuger à 1800 g pendant 2 min. Répéter pour un total de trois fois afin d'optimiser le taux de remplissage.
    NOTE: Après la dernière centrifugation, vérifier avec un microscope, le pourcentage de remplissage des «coquetiers». Si nécessaire, répétez les étapes de remplissage + centrifugation jusqu'à atteindre le pourcentage de remplissage souhaité.
12. Retirer l'échantillon du tube à l'aide des pinces pointues tenant la poignée PDMS. Assurez - vous de faire attention à ne pas les cellules «inquiétantes» qui sont détenus dans les «coquetiers» (voir la figure 2).
13. Placer l'échantillon dans une boîte de Pétri avec un milieu. Rincer pour éliminer l'excès de cellules qui ne sont pas dans les «coquetiers» par aspiration et à trois reprises doucement à côté de chaque côté (total de 4 côtés) de la matrice de microstructure.
    NOTE: pipetage trop fortement peut libérercertaines cellules sur des «coquetiers».
14. Remplacer le milieu avec un milieu frais pour éliminer les cellules nonattached.
    NOTE: Dans cette étape, un médicament d'intérêt peut être ajouté.
15. Fixer les cellules ou les préparer pour time-lapse imaging.See étape 4.1.

3. Observation de la dynamique cellulaire active dans les «Coquetiers»: cytokinétique Anneau de fermeture

NOTE: Cet exemple utilise des cellules HeLa qui sont transfectées avec MYH10-GFP et Lifeact-mcherry pour la myosine et de l'actine, respectivement, des molécules actives clés impliquées dans la fermeture du cycle cytokinétique lors de la mitose cellulaire. Le dispositif est préparé avec microcavités de 25 um de diamètre. Pour leur observation, un microscope inversé à épifluorescence a été utilisé, équipé d'un objectif d'huile 60X (1,40 NA, DIC, Plan Apo) et GFP (myosine) et TxRed (actine) filtres. En variante, un microscope confocal en position verticale a été utilisé, équipé d'un 25X ou 63X HCX IR APO L 'objectif de l'eau (0,95 NA). Pour cette example, il est fortement recommandé de synchroniser les cellules en utilisant la double bloc de thymidine, bloc mitotique ou méthode shake-off mitotique ^21-24.
NOTE: L'épaisseur des PDMS utilisés pour les «coquetiers» permet l'utilisation d'une variété d'objectifs, tant en microscopes inversés et droit positionnés.

1. La place «coquetiers» dans un support de microscope et le remplir avec 1 ml de 10% de FCS milieu L-15 d'observation. Pour éviter l'évaporation, placer un couvercle en verre sur le dessus du support ou d'appliquer une mince couche d'huile minérale sur le dessus du medium.Select l'objectif d'huile 60X.
   NOTE: L-15 moyen est suffisant pour non-CO ₂ atmosphères. Notez également que certains composés de DMEM sont auto-fluorescent. Lorsqu'on utilise ce moyen, il est recommandé de photobleach les composés fluorescents en l'éclairant avec une lampe de haute intensité pendant 1-2 heures.
   REMARQUE: Évitez d'utiliser des couvercles en plastique lorsque vous travaillez avec l'imagerie DIC.
2. Placez le porte avec des «coquetiers» et obsermilieu de vation au microscope. Concentrez soigneusement à l'aide de lumière en fond clair jusqu'à ce que les «coquetiers», et les cellules sont dans le même plan d'observation.
3. Ouvrez le logiciel et régler les paramètres. Sélectionnez les filtres TxRed et GFP pour l'actine et la myosine; ajuster le temps d'exposition pour chaque canal. Un taux d'acquisition typique est 5 s pour les deux canaux.
   NOTE: Le temps d'exposition peut être ajustée en fonction de la configuration utilisée, colorant ou d'autres organites cellulaires d'intérêt.
4. Sélectionnez la région d'intérêt et chercher un anneau cytokinétique en utilisant soit la GFP ou le canal TxRed. Concentrez avec précision.
   NOTE: La bague est plus nette dans la myosine et plus facile à reconnaître.
5. Exécutez l'acquisition automatique dans les deux canaux jusqu'à ce que l'anneau est complètement fermé.
   NOTE: Certains photoblanchiment peut être observée. Réglez les paramètres du microscope afin de le réduire.

4. Observation des organites cellulaires fixes dans les 'Eggcups'

Cette étape peut être réalisée avant ou après l'étape 3. Les cellules peuvent être fixées directement après l'étape de centrifugation et colorées pour l'organite d'intérêt ou après l'observation au microscope. Cet exemple montre la coloration de l'appareil de Golgi, le noyau et les fibres d'actine sur des fibroblastes NIH3T3 dans "coquetier".

1. Fixation des cellules dans les 'Eggcups'
   1. Préparer 3% de paraformaldehyde (PFA) et chaud à 37 ° C. Retirer l'échantillon 'coquetiers' du tube de 50 ml (ou le porte-microscope) et le placer dans une boîte de Pétri de P35. Rincer une fois avec PBS 1x.
      REMARQUE: Les protocoles pour la préparation de 3% de paraformaldéhyde sont largement disponibles ailleurs.
      ATTENTION: Utilisez des gants en nitrile et des lunettes de protection lors de la préparation de PFA.
   2. Retirez complètement le PBS et déposez 1 ml de 3% PFA et incuber pendant 17 min. Retirez la PFA et rincer deux fois avec 1 ml de PBS 1X. perméabiliser les cellules à l'aide de 1 ml de 0,5% Tritpendant 3 min et laver deux fois avec du PBS 1x pendant 5 min.
2. Coloration des cellules dans 'Eggcups'
   1. Incuber les cellules pour appareil de Golgi coloration avec l'anticorps primaire polyclonal de lapin anti-Giantin dans une dilution 1: 500 dans du PBS. Placer une goutte de 100 pl de solution d'anticorps sur une feuille de film plastique et incuber les cellules à l'intérieur des "coquetier" à l'envers pendant 45 min.
      REMARQUE: Protéger l'échantillon avec un couvercle pour éviter le dessèchement.
   2. Relâcher soigneusement les «Coquetiers» et les placer dans une boîte de Pétri de P35. Rincer 3 fois, 5 minutes chacun, avec PBS 1x.
   3. Préparer un cocktail dans du PBS avec l'anticorps secondaire Cy3 de chèvre anti-lapin (1: 1000) et phalloïdine Alexa Fluor 488 (1: 200) pour la coloration de fibres de stress d'actine.
   4. Incuber les cellules avec une goutte 100 ul de solution d'anticorps sur une feuille de film plastique et incuber les cellules à l'intérieur des "coquetier" à l'envers pendant 45 min.
   5. Sortie soigneusement le «EGGCups »et placez-les dans une boîte de Pétri de P35. Rincer 3 fois, 5 minutes chacun, avec PBS 1x.
   6. Incuber les cellules de coloration de noyau en plaçant une goutte 100 ul de 1 ug ml - ¹ dans du PBS DAPI sur une feuille de film plastique et incuber les cellules à l' intérieur des "coquetier" à l' envers pendant 45 min. Cette étape peut être réalisée à l'étape 4.2.3.
   7. Relâcher soigneusement les «coquetiers» et les placer dans une boîte de Pétri de P35. Rincer 3 fois, 5 minutes chacun, avec PBS 1x.
   8. cellules de montage en utilisant un Glycerol 15 pi: PBS (1: 1 v / v) sur une lame de verre de microscope standard et sceller l'échantillon avec le vernis à ongles pour éviter le séchage.
      NOTE: En fonction de l'épaisseur '' coquetiers, le montage peut être difficile. Il est recommandé de stocker ensuite l'échantillon dans une boîte de Pétri de P35 dans du PBS, protégé de séchage.
3. Microscope Observation
   NOTE: Pour cet exemple, un microscope confocal vertical est utilisé, équipé de PMT et hybrides détecteurs. Un 25X ou 63 X HCX IR APO objectif L d'eau (0,95 NA) a été sélectionné pour fournir un large champ de l'échantillon et de montrer l'applicabilité de l'appareil pour des applications à haute teneur de dépistage.
   1. Sélectionnez l'objectif 25X ou 63X eau.
      NOTE: Les différents objectifs peuvent être utilisés en fonction de l'application et du signal. Mais l'utilisation d'objectifs de grande ouverture numérique est recommandée.
   2. Placer l'échantillon fixe avec les «coquetiers» et se concentrer soigneusement à l'aide de lumière à fond clair (contraste de phase ou DIC) jusqu'à ce que les «coquetiers» et les cellules sont dans le plan d'observation.
   3. Ouvrez le logiciel et régler les paramètres. Sélectionnez les filtres GFP, Cy3 et DAPI pour l'actine, Golgi et d'observation noyau, respectivement; régler le temps d'exposition pour tous les canaux.
      NOTE: Le temps d'exposition peut être ajustée en fonction de la configuration.
   4. Sélectionnez et concentrer la région d'intérêt; commencer la capture d' image (voir Figure 3).

tle "> 5. Adaptation pour l'observation des cellules de levure et C. elegans Embryon

1. Les cellules de levure Fission et herbe
   NOTE: Cet exemple utilise des cellules de levure de fission qui sont étiquetés avec RLC1-mcherry et CHD-GFP pour la myosine et de l'actine, respectivement. Les cellules de levure de bourgeonnement ne sont pas marqués par fluorescence ici. Pour l'observation fission de la levure un disque rotatif microscope confocal inversé a été utilisé. Un objectif d'huile 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) a été utilisé pour toutes les acquisitions. Alternativement, les cellules ont également été observées en utilisant un microscope à contraste de phase inversée équipée d'un objectif d'air de contraste de phase 20X LCPlanFl (0,4 NA). Dans cet exemple, le protocole est identique pour les deux types de cellules.
   1. Préparer la surface "coquetier", comme décrit ci-dessus. Pour la fission et des cellules de levure en herbe, préparer des cavités de 5 m de diamètre (voir le tableau 1). Dans ce cas, la surface n'a pas besoin d'être fonctionnalisés avec des protéines d'adhérence.
      NOTE: Le remplissage can être optimisé en utilisant 'coquetiers' coniques. Cette forme capte et retient les cellules en évitant la libération lors de l'étape de rinçage après centrifugation. Le pourcentage de remplissage est optimale à environ 80%. Ces "coquetier" coniques peuvent être fabriqués au moyen de gravure ionique réactive profonde ^13.
   2. La culture de cellules de levure dans le milieu de culture approprié (voir le tableau 1) jusqu'à atteindre une densité optique (DO) dans l'intervalle de 0,2 et 0,8. Soniquer la culture de cellules de levure pour éliminer les agrégats.
   3. Insérer des cellules de levure dans les «coquetiers» par centrifugation. Pour la centrifugation, 4 ml de cellules cultivées dans la DO appropriée est ajoutée sur le tube en "coquetier". Après la première centrifugation, secouer doucement le tube à des cellules qui ne sont pas dans les «coquetiers» remettre en suspension, tandis que les cellules dans les «coquetiers» ne sont pas perturbés. Sans ouvrir à nouveau le tube, centrifugeuse et répéter deux fois cette étape. Ceci assure le dépôtdes cellules de la culture dans les microcavités vides et augmentera le pourcentage de remplissage.
      REMARQUE: Lorsque l'on travaille avec de la levure, il est recommandé de préchauffer la centrifugeuse à la température de travail pendant les expériences
      NOTE: Le protocole peut être mis en pause ici et a continué jusqu'à 12 heures plus tard. Dans ce cas, stocker l'échantillon à la température de travail et le couvrir pour éviter l'évaporation.
   4. Placez «coquetiers» dans un support de microscope et remplir le support avec filtre stérilisé moyen pour l'imagerie. Maintenant, rincer les cellules avec le même milieu jusqu'à ce que les cellules de levure flottantes sont retirées de manière efficace. Prenez soin de ne pas perturber les cellules dans «coquetiers» au cours du processus de rinçage.
   5. Sélectionnez l'objectif d'huile 100X et de se concentrer attentivement. Ouvrez le logiciel et régler les paramètres. Pour la levure de fission, sélectionnez les filtres GFP et TxRed pour l'actine et la myosine et régler le temps d'exposition pour les deux canaux. Un taux d'acquisition typique est 3 sec.
      REMARQUE: Selonle fluorophore, le type de marquage et de la mise en place, le temps d'exposition varie pour d'autres systèmes.
2. C. elegans Embryon
   NOTE: Cet exemple utilise C. elegans embryons de 25 à 30 um de large et de 50 à 55 um de long. Les embryons sont mis en culture comme indiqué à ^25. Un protocole visuel simple de la façon de manipuler C. elegans peut être trouvée dans ^26. L'observation a été réalisée à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversée équipée d'un objectif d'air 40X 0,55 NA.
   1. Préparer la surface 'coquetiers' comme décrit ci - dessus et 25 m de diamètre (voir le tableau 1). Dans ce cas, la surface n'a pas besoin d'être fonctionnalisés avec des protéines d'adhérence.
   2. Culture C. embryons elegans dans le milieu de culture approprié (voir le tableau 1).
   3. Insérez des embryons dans les «coquetiers» par centrifugation comme décrit ci-dessus (voir la section 2.6 à 2.12) en utilisant l'eau ultrapure comme milieu de culture.
      NOTE: Les embryons ont été «comportés« normalement dans de l'eau ultrapure pendant toute la durée de l'expérience. Vous pouvez également utiliser un tampon M9 physiologique pour des expériences à long terme.
   4. Rincer l'échantillon tel que décrit ci-dessus (voir la section 2.14). Placez les «coquetiers» dans un support de microscope. Sélectionnez l'objectif de l'air 40X et se concentrer attentivement. Ouvrez le logiciel et régler les paramètres. Sélectionnez un taux de 3 sec d'acquisition.

Résultats

Les «coquetiers» (CE) sont une méthodologie de haute teneur dépistage roman qui permet la visualisation des cellules et d'embryons orientés dans un environnement 3D. De plus, certains processus cellulaires, qui sont difficiles à observer en 2D cultures (plat) standard, peuvent être observés par cette nouvelle méthode. La figure 1a montre un résumé de la procédure pour la microfabrication CE (voir également la section 1 dans le protocole décrit ci-dessus ). La méthode est simple, rapid...

Discussion

Replica moulage a été utilisé pour fabriquer les «coquetiers». Le procédé de fabrication n'a pas besoin d'une chambre propre; il est facile et simple, même si une certaine pratique peut être nécessaire. En particulier, la libération du timbre de PDMS est l'étape la plus critique afin de produire une grande surface de «coquetiers» de haute qualité. Pour cette raison, une attention particulière doit être prise lors de cette étape. Si cette étape échoue à plusieurs reprises, envisager pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2