优化人骨髓间充质干细胞附着在聚（ε己内酯）静电纺纱线

摘要

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

摘要

研究生物材料和组织工程通常包括基于细胞的体外研究，这需要的起始细胞数初始知识。尽管研究人员通常引用其接种密度，这并不一定表示已附着于有问题的材料的细胞的实际数量。这是特别为材料或支架，其不包括标准的细胞培养孔板的底部的情况。本研究探讨接种在一个已知的数上静电纺丝的聚（ε - 己内酯）纱线在培养4小时后，自人骨髓间充质干细胞的初始附着。静电纱内几个不同的调校举行，包括生物反应器容器旋转9的转速，位于低结合孔板和聚四氟乙烯（PTFE）的槽放置在培养皿中的细胞培养插入物。后两者经受静态条件或定位在振荡器上板（30 37℃，5％的CO _2中 ，接种细胞的位置是由细胞的DNA分析测定。从容器中取出，放入裂解液支架。媒体馏分类似地除去并离心 - 上清液丢弃，沉淀捣碎用裂解缓冲液。裂解缓冲液加入每个容器，或良好，并且刮下以释放任何细胞可以存在。细胞的DNA分析测定细胞在支架内时，媒体和井馏分的百分比。细胞附着率较低为所有的实验室设备，具有最大的附着（30％）的细胞培养插入物内保持并进行摇动运动的纱线。这项研究提出认识到附加到脚手架不管通过上述细胞接种密度的细胞的实际数量。

引言

支架例行正在开发和研究的生物材料和组织工程应用。因此，它们通常被接种细胞及其在体外行为通过确定细胞增殖和细胞数，例如测定法表征。进行实验，如这些，当务之急是初始小区数量是已知的，并研究经常述在每毫升或厘米²细胞的数目而言播种浓度。虽然这是很好的做法，特别是对于按比例放大的目的，不考虑细胞附着在支架的表面（其也依赖于生物材料表面¹的粘结性）的实际数量。这对于支架不覆盖细胞培养井板的整个基更是如此作为细胞可以从构建体都消失，而且，由于实验的通常的静态性质，可能永远不会回到与英特的材料接触休息。电纺纤维纱是一个支架未覆盖的井（ 图1A）的基部的一个很好的例子。在这种情况下，低结合孔板，但没有经表面处理的应用，以防止细胞附着在板的表面，因此扭曲的任何公基测定法的结果。

孔板容易地用于细胞接种到支架的，但它们不是唯一可用的方法。旋转细胞培养系统，一种生物反应器由生命科学部于上世纪80年代开发的NASA，同样可以用于在与模拟微重力三维（3D）环境种子支架。这种类型的生物反应器仍然是一个流行的选择与世界各地的研究人员和研究中已经纳入了细胞信号^2,3，干细胞^4,5和组织工程^6,7。是什么让旋转生物反应器最好孔板是维修的3D环境中，这有助于防止分化的细胞，从去分化，这是常有的情况下，当常规的2D条件⁸内进行培养。

本文研究不同的技术来作为制作博斯沃思等人 ^，9，以便最大限度地附连到这些支架一个4小时期间内的细胞的初始数量上静电聚（ε -己内酯）纤维丝接种人类间质干细胞。对于2D培养，纱线牢固孔板或定做的聚（四氟乙烯）（PTFE）波谷内保持与静态条件下保持，或摇动以30rpm。对于3D的文化，纱线和细胞生物反应器旋转的船只在9转速范围内举行。

研究方案

1.Scaffold制作和消毒

1. 溶解的PCL在1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇，得到10％w / v的浓度。如所描述的在博斯沃思等人 ^，9静电纺丝聚合物溶液（参数:20千伏1毫升/小时，有20厘米）。并收集在旋转的心轴（600转）的边缘排列的纤维。用解剖刀除去收集纤维的色带，然后切成较短的长度 - 3厘米（对于槽和旋转容器）和4厘米（用于细胞培养插入）的长度。
2. 用细镊子浸入蒸馏水中个别条和删除。
3. 拿着拇指和食指之间的两端;手动拧条，直到它类似于线程。
4. 简要地浸没在蒸馏水此线状支架和放置在干净的，非纤维状的卡晾干。
5. 一旦干燥，代替单独的干净的微量离心管中，并在蒸馏水中加入1毫升50％体积/体积乙醇。关闭盖子，并留下24小时。
   注意:执行下层流下列步骤:
6. 放置离心管在层流柜和吸出50％的v / v溶液。用1ml 70％体积/体积乙醇蒸馏水，靠近盖更换和离开24小时。
7. 重复的90％和在蒸馏水水（1ml体积）100％体积/体积乙醇。
8. 洗涤用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中，每次洗涤24小时，（2×1毫升）脚手架两次。
9. 除去PBS中，并添加1 ml的细胞培养介质。注:脚手架已经准备好使用后的24小时。

2。确定脚手架面积和单元数

1. 使用光学显微镜和图像处理软件，测量沿其长度的静电纱线的直径，以确定一个平均值。
2. 假设纱是一个圆柱棒和近似使用表面积:
3. 其中，A =表面积，R =半径和H =长度
   注意:表面积计算为18902，800微米^2。此外，应该指出的是，实际表面积比该计算更大的纱是由数百个细纤维，这将增加的表面积的。因此细胞的更大数目应能附着到支架上。然而，这并不影响正在测试组之间的直接比较。
4. 确定细胞可以通过附着到暴露的支架表面的最大数量:
   注意:使用光学显微镜和图像处理软件，人类间质干细胞的直径被确定为20微米（假设细胞是圆的），因此在这种情况下，细胞= 60200的数。

3.脚手架设置 - 细胞培养插入（图1A）

1. 在层流中，打开无菌的6孔细胞培养插入，并从更广泛的环状体中分离的短环带齿。
2. 取环带齿朝上。悬垂1所述4厘米支架在环使中心的两侧确保它重叠。取环形体和位置上的带齿环和支架和向下推确保将支架保持在适当的位置，并通过位于细胞培养插管的中心。
3. 将细胞培养插管与支架成6孔，低结合板的孔。
4. 加入10 mL培养基的脚手架。

4.脚手架建立 - 槽（图1B）

1. 下的层流，代替聚（四氟乙烯）（PTFE）波谷成单独的培养皿和培养介质加入10毫升的低谷。
2. 使用镊子披覆3厘米支架进料槽中的一个，并确保其长度位于平行于槽的长边缘。

5.脚手架建立 - 生物反应器容器（图1C）

1. 在层流，将10毫升无菌PBS通过生物反应器容器的主要港口，并留下了10分钟。
2. 移除PBS并更换用8ml培养基。
3. 使用镊子，经由主端口插入3厘米支架之一到容器。
4. 关闭掉的主要港口。

6.细胞计数

1. 从骨髓，根据制造商的协议到通道4之前收获来自培养人间充质干细胞（hMSC的）。
2. 从75厘米吸媒体²瓶含有从骨髓（第4代，80％融合）得到的hMSCs。
3. 用10ml无菌PBS和抽吸洗细胞。
4. 加入3 ml胰蛋白酶孵育烧瓶在37℃，5％的CO _2，直到细胞已经从烧瓶表面脱落。
5. 添加7毫升培养基使酶失活，这总体积（10毫升）转移到一个离心管中。
6. 通过上下吹打数次重悬该细胞悬浮液，以均匀分散中的细胞媒体和限制细胞团块（10毫升吸管）。
7. 取出20微升细胞悬液，转移到一个血球。
8. 放置在血细胞计数X10客观光显微镜下的图像。
9. 聚焦网格线和计数在网格的每个角落的细胞，在4×4方块数和落入正方形内和那些穿过右手或底部边界线。计数为每组4×4平方（每格4计数）。
10. 重复再悬浮和细胞计数三次（步骤6.6-6.9）。
11. 计算平均细胞计数，并确定所需的细胞再悬浮（细胞浓度60200在200μl）介质的体积。例如，确定从血球的平均细胞数，然后确定细胞从三个独立计数的总体平均数。由1×10 ⁴乘以此，得到每毫升的细胞数，然后乘以细胞悬浮液的总体积，得到以细胞的数量TAL。使用下面的公式来确定所需的悬浮介质体积:
12. 离心细胞悬浮液在241×g离心5分钟。

7.细胞种植

1. 从离心管中吸出介质离开细胞沉淀，并替换为所计算出的介质体积。
2. 重悬的细胞和培养基对偶数混合。
3. 使用P200的吉尔森吸管，缓缓地分配200μl的细胞悬浮液在每个支架通过运行沿该支架的长度和介质液面下的移液管的尖端。离开原状20分钟。
4. 对于生物反应器的船只，免除200微升细胞悬液通过主要港口。补足其余2毫升培养经由注射器端口媒体，得到为10ml的总体积。

8.实验开始

1. 转让生物反应器船只到农村信用社，4DQ生物反应器，并设置9的转速旋转。
2. 陈德良sfer所述孔板与细胞培养插入和波谷到摇动板，并设置以30rpm旋转。
3. 传送孔板与细胞培养插入和波谷至细胞培养箱设定为37℃，5％的CO _2（静态培养）的货架。

9. DNA检测

1. 制备溶液 - 裂解缓冲液，1×TE缓冲液，DNA的标准和细胞DNA工作液 - 按照制造商的说明。
2. 4小时后，从孵化器中取出样品，并在层流放置。
3. 所有样品取出介质分数，并放置在单独标示离心管。离心管241 XG。去除上清，加3毫升裂解液。悬浮溶液分手细胞沉淀。
4. 使用镊子取下支架并将其放置在装有3毫升裂解液（用于生物反应器内的血管支架离心管，取出支架，用来吸取我之前直径）。用于细胞培养插入物内保持支架，第一释放该支​​架通过切割所述支架附近使用解剖刀刀片的边缘。
5. 加入3毫升裂解液到每个支架插座和刮去表面（大力鼓吹的生物反应器的船只）。除去裂解缓冲液，并放置在单独标示离心管中。
6. 涡旋每个离心管约1分钟，以确保细胞的足够的搅拌和缓冲，并鼓励细胞膜裂解。
7. 在一个黑色的96孔板，加入100微升的裂解液对每个样品部分 - 脚手架，媒体和好（副本）。
8. 在黑暗中，加入100微升细胞DNA溶液到含有裂解缓冲液的所有孔中，并轻轻混匀。
9. 包括孔用不含DNA和细胞的DNA溶液中以提供一个阴性和阳性对照的孔板裂解缓冲液。
10. 使用荧光板阅读器，测量孔的吸光度S使用485nm激发和520 nm发射。
11. 与从DNA标准按照制造商的指示生成的标准曲线进行比较的数据。

10.扫描电子显微镜（SEM）的固定

1. 执行以下步骤在层流:4小时后，从他们的插座和地点取出一个新的6孔板（不同孔）内的所有支架。
2. 用PBS洗两次支架。
3. 执行以下步骤打开板凳上:每孔加入2毫升的PBS 1.5％V / V戊二醛，确保支架完全覆盖。
4. 离开板至少30分钟，在4℃，进行细胞固定。
5. 除去固定液，用PBS洗两次支架。
6. 脱水支架随着乙醇浓度的蒸馏水开始用50％体积/体积，随后70％体积/体积至90％体积/体积。对于每一个浓度，充分浸没在solutio支架N（2ml）中，并离开3分钟。丢弃的解决方案和重复。
7. 通过完全浸没在溶液中的支架（2毫升）中，并静置5分钟，脱水在100％乙醇。丢弃的解决方案和重复。
8. 化学干燥使用六甲基二（HMDS）在通风橱支架。沉浸在HMDS的支架（2毫升），并留下5分钟。取出HMDS和重复。
9. 除去HMDS，并允许支架进行干燥。安装在市售的SEM存根的支架（在此情况下的不锈钢存根与粘合剂碳片）。
10. 到缓解的SEM观察中，涂层用金溅射镀膜机进行2分钟的样品，以确保一个薄而均匀的覆盖。
11. 内SEM和地方样本使用5千电子伏的电子束可视化细胞接种支架。

结果

该结果强调以下4小时后播种每种实验设置的细胞的位置的影响。 图2A表明细胞在此期间已附着在支架的表面的百分比。 8.5皮克/细胞A转换因子是用来测量的DNA含量为细胞数转换，从而确定电池¹⁰的比例。对于所有的播种调校研究，细胞附着的百分比相对较低，具有最大的细胞粘附（30％）的细胞培养插入物内保持并摇动以30rpm（插入振荡器）的支架。坚持最低（15％）是在细胞培养插入内举行脚手架，并保持静态条件（将静态）下。

大量细胞是媒体级分（ 图2B）内时，最明显的是对于低结合板（插入静态）和旋转式容器内保持细胞培养插入物为50％和51％的分别。槽内保持支架证明细胞保持器本身内本的凸起数 - 48％的细胞为槽振荡器和用于槽的静态的50％。

扫描电子显微镜所允许的细胞接种支架的视觉评估（ 图3）。代表图像强调不论接种建立细胞的有限的存在在纤维表面上，。然而，更大数目的细胞和细胞聚集体是存在于细胞培养插入物内保持并摇动以30rpm（插入振荡器）的支架。

图1.实验调校，其中静电纺丝纱内举行; （A）的细胞培养物的插入和低结合孔板，（B）聚（四氟乙烯）（PTFE）和波谷培养皿;和（C）生物反应器容器。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.位置细胞4小时后播种到PCL电纺的纱线采用不同播种调校的。 （A）的演示已经附连到的PCL支架的细胞的百分比（平均值±标准偏差）;（B）的突出位置细胞的百分比传播三个馏分内-媒体，以及与支架（n = 4时，数据表示为平均值）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.代表性的扫描电子显微镜对PCL电纺的纱线与人骨髓间充质干细胞，采用不同的实验调校初始播种后4小时 （以1,000倍的放大倍率的所有图像，比例尺= 130微米。） 请点击这里查看更大的版本这个数字。

讨论

从生物聚合物制成电纺纤维基质经常用于支持细胞附着和增殖为生物材料和/或组织工程应用^11,12。在这些情况下，基质常常薄板纤维容易覆盖细胞培养井板的整个基础，从而在与接种的细胞可提高细胞附着完全接触的。然而，如果生物材料支架不完全覆盖所述孔板的底部，有一个高的机会，该接种的细胞的相当大的比例不会停留在与支架接触，并最终将不能附着。该研究调查了几种不同的方法对种子细胞到支架不覆盖孔板的底部，以确定可能被推荐用于未来的基于细胞的实验的优化技术。

五个不同的调校进行了研究（ 图1）:scaffo使用低绑定孔板内的细胞培养插入LDS（静电纱）举行，要么保持静态条件下或摇动30转;支架置于狭窄的PTFE槽内，并保持静态或动摇在30转;和安置生物反应器内旋转的船只9转支架。确定细胞，通过DNA分析附着在静电纱线的数量显示出附件的所有接种设置窗口（ 图2）低的百分比;这进一步从扫描电子显微照片（SEM）（ 图3）确认。最大的细胞附着 - 30％〜18060细胞-was观察举行了细胞培养插入内，进行连续运动的纱线。有趣的是，最低细胞附着（15％），用于通过细胞培养插入持有，但在静态条件下保持的纱线，这将表明，包含径向运动对保持细胞与支架接触的积极效果达到了。然而，但是应当注意的是，媒体的流量连续旋绕可能负责从SEM图像中观察到的细胞团块。该摇动板被设置在它的最低设置 - 30rpm下 - 这可能是一个限制到这种设置。使用较慢的径向运动可有助于预防或减少细胞凝集，也可以提高细胞附着作为细胞将经历较小的力。未来的实验应该着力优化的理想摇床速度提高细胞附着。掺入运动对于保持槽内没有导致了类似的趋势纱线，与这两种情况下，得到18％的附着性（〜10836个细胞）;虽然这可能是由于在槽内的支架的部分浮起（观察放置在摇动器板上的槽），因为它们并没有固定在基座上。支架的局部浮将防止已经从进入与材料和粘附接触下沉到槽的底部的任何细胞。在t他的特殊设置中，该槽被装在一个培养皿中，并共10毫升体积的介质中加入。槽的尺寸小意味着大多数媒体内的培养皿本，如果有任何的运动，细胞可能漂离槽到培养皿并保持完全脱离支架接触。为了克服这些限制，进一步的实验应该包括在该协议中，从而使支架的端部被固定到用无菌细针槽的底部的额外步骤，因为这应当防止其浮起和运动（特别是对于暴露于支架径向运动），这最终应导致附接至所述支架单元的数量增加。细胞的16％的已附连在旋转容器内存在的纱线。尽管是一个行之有效的技术为3D的文化，并出现从船只的主要港口拆除支架，这可能导致松散ATTAC问题丢失HED细胞。容器可以完全打开将消除这个问题;这些是可以购买的，但都显着高于在该研究中使用的一次性容器更昂贵。

这项研究表明，目前的问题播种支架不包括标准的细胞培养孔板的整个基。播种一个已知的细胞数目导致小于三分之一附着到所述支架，尽管支架的表面积，允许所有的细胞附着。这可能在其他基于细胞的试验，可能评估生物相容性和细胞材料/细胞 - 细胞的行为和相互作用与该支架作为一个潜在的未来医疗装置的有害后果。该研究的进一步限制可能包括4小时的时间点-尽管是足够长的时间，以确保初始细胞接种（细胞已被证明牢固附着到基板30分钟^13,14,15内），它可能是合理的，在vestigate稍后的时间点，提供细胞较长的时间帧期间不增殖，因为这本来歪斜的起始细胞数。还原的介质体积，在此情况下10毫升，还可以改善细胞和支架之间的接触，并最终增加细胞附着。未来的研究也应考虑细胞活力作为细胞接种的过程中可能会导致细胞损伤和/或细胞死亡^16。细胞的DNA分析不可行的和非存活细胞区分，因为这样的活/死测定法，例如，将突出生存能力的水平。

本次调查提高认识到细胞附着在支架的实际数量，尽管播种一个已知量。对于依赖于细胞的起始数的研究，这是非常重要的是，研究人员知道究竟有多少该数字做实际上附着于感兴趣的底物。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled water	in-house supply	n/a
Ethanol	Merck	1117271000
Phosphate Buffered Saline solution	Life Technologies	70013016
Human mesenchymal stem cells	PromoCell GmbH	C-12974
MSC culture media	PromoCell GmbH	C-28010B	Warmed to 37 oC before use
Supplement mix	PromoCell GmbH	C-39810	Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix	Sigma-Aldrich	A5955	Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%)	Sigma-Aldrich	59417C	Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75)	Becton Dickinson Ltd	353110
Low binding 6-well plates	Costar Corning	3471
6-well CellCrowns	Scaffdex	C00003S
Petri-dish 50 ml deep	Sterilin	124
PTFE troughs	in-house production	n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml	Synthecon	D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor	Synthecon	RCCS-4DQ
Shaker plate	Stuart	SSM1	Mini Orbital Shaker
Haemocytometer	Digital Bio	DHC-F01	Disposable C-Chip
Centrifuge tube	Deltalab	352096, 429901	15 ml and 50 ml
Centrifuge	Hettich	Rotafix 32 A
Syringe 3 ml	Shield Medicare Ltd	3039820
Pipettes	Sterilin	40305, 47310, 40125	5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes	SLS	F144801, F144802, F123600, F123601, F123602	P2 - P1000
Pipette tips	SLS	PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml	Eppendorf	30125.15
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
PicoGreen Assay	Invitrogen	P7589	Assay set-up in the dark
Black 96-well plate	Greiner Bio One	655086
Fluorescent plate-reader	BGM Labtech	FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25%	TAAB Laboratories	G002	Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	999-97-3
Aluminium stubs (SEM)	Agar Scientific	G301
Carbon tabs (SEM)	Agar Scientific	G3347N
Gold sputter coater	Edwards	S150B
Scanning Electron Microscope (SEM)	Phenom World	Phenom Pro