原发性脑多巴胺能神经元的分离，培养和长期维持胚胎脑鼠类

摘要

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

摘要

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

引言

多巴胺能神经元从黑质损耗致密部导致帕金森氏病（PD），所述第二最常见的神经变性疾病的基本运动症状。这种脑的神经元群的灭亡的根本原因尚不清楚。研究负责开发和调制神经生理特性和mesDA神经元，几个细胞培养和动物模型系统的生存已使用的生化途径。永生化细胞系，包括大鼠多巴胺能细胞系1RB ₃ AN _{27（N27），}所述的SH-SY5Y人的多巴胺能神经母细胞瘤细 ​​胞系，小鼠的多巴胺能杂交细胞系MN9D和人脑LUHMES细胞已被用于生化和有限的机理研究^{1 -5。}对于mesDA神经元的具体损失的研究，几种神经毒素为基础和遗传模型已开发^6-8。原发性脑腹侧文化，提供一个不可缺少的工具用于研究多巴胺能神经元的神经元和突触的属性和参与这一常见的疾病的发病机制中的通路。

这里我们提出了一个详细的协议，用于中脑多巴胺能神经元的分离，它含有导致更高的生存能力和每个胚胎盖玻片的增加的产量的修改。使用预成熟E12.5鼠脑（E14.5大鼠）提高了生存能力。在这个年龄段的神经元还没有开发轴突的是，它在清扫树叶细胞的完整，减少应力，从而提高显著生存能力。此外，小心解​​剖腹侧中脑，如在该协议的第2节描述的，进一步提高的生存能力。增加每个胚胎盖玻片的数量，另一种电镀方法，提出在该协议的第4条。这导致每个胚胎高达10盖玻片的收率相比，下4盖玻片标准电镀条件从而减少每个实验动物的数量。

在轴突和树突的文化展品生长的神经元，形成突触联系，揭示了神经元和突触的标记使这些文化适合活细胞成像，免疫细胞化学和电生理研究的存在。此外，使用的神经元培养物的促进基因和药理学操纵。 体外 2天的轴突生长允许发育研究。此外，培养物的长期存活（最多6周），使它们适合于这些神经元的速度慢，进行性变性的研究。

研究方案

注:该动物保持并遵守处理与制度的指导方针，所有动物的程序批准了帝国学院的动物福利和伦理审查机构（AWERB）以及内政部和哈佛大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）符合联邦和州法规。

1，试剂和设备安装

1. 解冻，分装和存储1日-80ºC毫克/毫升层粘连蛋白的解决方案。溶解2微升在1ml DMEM / F12，导致在1-2微克/厘米²的涂布的浓度。
   注:解冻层粘连慢慢在冰上并溶解在冷的DMEM / F12，并立即将其添加到板/盖玻片。
2. 稀释75毫升0.01％聚-L-鸟氨酸425毫升的PBS，并储存于4ºC。
   注:工作液的保质期长达一个月。
3. 溶解25％（重量/体积）BSA的PBS，pH 7.4中，并储存在4ºC长达一个咋AR。
4. 制备50％FBS（在HBSS中）的失活的介质。
5. （+） - - 葡萄糖（重量/体积），0.25％的BSA（重量/体积），以通过添加50U / ml的青霉素和链霉素，1×N2添加剂，5％（体积/体积）胎牛血清，0.36％D制备的完全培养基DMEM / F12，并储存在4ºC。
   注:保质期是10天。
6. 在沸腾的70％（体积/体积）乙醇为至少30分钟的地方盖玻片以除去油脂和高压釜任何痕迹。
7. 在24孔板的地方盖玻片并加入500μl聚-L-鸟氨酸溶液到每个孔中。孵育所述组织培养罩下1小时，在室温下，然后，洗3次，用500μl水。加入500μl层粘连蛋白的解决方案，以每块板和孵化O / N在湿润的组织培养孵化器在37ºC。
   注意:虽然没有洗涤是必要的层粘连蛋白处理后，洗涤该聚-L-鸟氨酸小于三倍导致细胞的死亡培养后24小时。
8. 擦亮玻璃吸管超过天然气或火炬f显示提示跛脚。
   注意:在此步骤之后的尖端的直径应为约一半正常大小的。
9. 削减1.5 ml离心管的盖子，用剪刀蒸压釜和。

2.解剖胚胎中脑腹侧的

1. Narcotize定时怀孕（E12.5）的CO ₂吸入水坝，然后由颈椎脱位安乐死。
2. 喷用70％乙醇的腹部，使腹部切口，直到子宫囊都暴露出来。使用镊子削减阴道附件，删除子宫。放置在冰冷的HBSS子宫，在100毫米培养皿中。
3. 除去从子宫和羊膜囊胚胎，使用镊子（ 图1C）。地方胚胎在新鲜的冰冷的HBSS。
   注: 图1D的矩形表示胚胎中脑腹侧的位置。
4. 将解剖显微镜（10倍放大倍率）在胚胎和解剖脑拱通过切割大脑在峡部和中脑-间脑边界区域，使用bioscissor和镊子（ 图1E，请参考图1A，用于切口线）。
5. 后取出整个脑，做了脑内侧背（ 图1F）削减。
6. 除去脑膜，使用两个镊子（ 图1H）。
   注:关键步骤:此步骤是为最佳的神经元的产量和存活至关重要。由于培养条件是最佳的脑细胞中，大部分从周围组织中的细胞死电镀后，并从该组织中的细胞凋亡信号可能损坏培养物的完整性。
7. 拼合在培养皿中脑组织，观察蝴蝶造型和削减大约各占一半机翼，用消毒的剃须刀片（ 图1H，I）。
   注: 图1J描绘了孤立的腹侧中脑。
8. 转让一块腹脑入冰冷的HBSS在一个15毫升的锥形管，然后继续下一个胚胎。
   注意:步骤2.1-2.8不应超过1小时。保持胚胎超出在冰上这个时间帧显著降低细胞活力。

3.解离腹侧中脑细胞

1. 传送下一个层流罩腹侧中脑的部分。移除HBSS和加入1 ml预热（37℃）0.05％胰蛋白酶-EDTA入锥形管（体积足够容纳12个腹侧中脑）。孵育所述组织在37ºC5-10分钟。
2. 除去胰蛋白酶-EDTA罩下和加入1毫升去活化介质（血清将停用胰蛋白酶）来组织。
3. 取出失活介质和洗涤在1ml完全培养基中的组织的两倍。
   注:避免除去从管的所有介质和吸取的组织，以防止废弃离解的细胞。
4. 加入1ml完全培养基和三叔尿酸盐用火抛光的玻璃吸管的组织。避免形成气泡，并继续直到捣碎单细胞悬浮液来实现的。
   注:通常情况下，8-10通过限制提示所需的完整的解离。
5. 离心细胞，在400×g离心5分钟，在室温并取出介质。
6. 重新暂停通过缓慢吹吸在1ml完全培养基中的沉淀和向下多达四次。

4.电镀中脑腹侧细胞

1. 混合10微升细胞悬浮液与90微升锥虫蓝溶液，并用血细胞计数器计数细胞数。
   注:细胞的生存力，也可以在此阶段进行检查。
2. 放置无菌微量离心管帽在100mM培养皿转移聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片，使用镊子，一次一个上盖帽的顶部。
   注意:不要洗盖玻片，避免干燥的层粘连蛋白，因为这可能会导致uneveñ文化和减少细胞的生存能力。
3. 加入完全培养基调节音量，以每1微升1500细胞并在每个盖玻片的顶部添加细胞悬浮液的100微升（总共150,000个细胞的）（体积为最佳，以覆盖盖玻片的表面而不溢出）。关闭培养皿孵育它们1小时，在湿润的组织培养箱（37℃，5％的CO _2）。
   注:关键步骤:此步骤是必需的用于增强细胞的附着和生活力并增加每个胚胎盖玻片的数量。或者，所述细胞可以直接转移到孔中（含有盖玻片），但是单元的数目应增加（而不是150000），以350000每孔。换句话说，使用这种方法，8-10盖玻片能够获得，而直接转移产生，因为细胞，其附着到所述板（旁或盖玻片下）为约3-4盖玻片。平均viabiliTY培养物，使用该方法是在90％左右。

5.文化成长和维护

1. 1小时温育后，小心地转移盖玻片包括介质到24孔板，含有400微升预热（37℃）的完全培养基（总体积:500微升）。孵育细胞O / N为37ºC。
2. 内孔中温育24小时后，轻轻地加入500微升完全培养基到每个孔中。
   注:第几个小时为多巴胺能神经元的存活和存活细胞的数目不显著超过该点改变的最关键的阶段。
3. 不附加媒体添加到培养的头两个星期或直至介质变为黄色。如果对于超过两周或介质颜色变为黄色，介质的交换一半（500微升）与新鲜的完全预热介质（典型地每两个星期）培养。
   注:内多巴胺能神经元培养将生存在这些条件下6周以上。

结果

免疫组织化学对酪氨酸羟化酶（TH）表明，该细胞在培养中的0.5-1％之间的多巴胺。电镀后的2小时的神经元突起出现并通过第一天，轴突和树突是可区分（ 图2），使用酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（MAP2）抗体（ 图3）。神经元存活超过六个星期，并显示大量的产物。在培养的神经元 - 神经胶质细胞比直接相关的血清的培养基中的浓度，如前所示。同时消除FBS从培?...

讨论

在中脑多巴胺能神经元是多巴胺在中枢神经系统中的主要来源。它们被分成三组，黑质致密部（黑质致密部），腹侧被盖区（VTA）和retrorubral字段^{（RRF）10，11。}在黑质致密部和VTA的神经元产生重大多巴胺能通路，mesocortical，脑边缘和黑质纹状体，涉及的功能，如情感，动机和运动行为的控制。在黑质致密部和黑质纹状体系统的功能性破坏的神经元死亡是第二个最显着的神经变性疾病，帕?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012